en<em> Ex vivo</em> Metode til Time-Lapse Imaging af dyrkede Rat Mesenteriske Mikrovaskulære Networks
Summary
Angiogenesis involves multi-cell, multi-system interactions that need to be investigated in a physiologically relevant environment. The objective of this study is to demonstrate the ability of the rat mesentery culture model to make time-lapse comparisons of intact microvascular networks during angiogenesis.
Abstract
Angiogenese, defineret som væksten af nye blodkar fra allerede eksisterende fartøjer, indebærer endotelceller, pericytter, glatte muskelceller, immunceller og koordinering med lymfekar og nerver. Den multi-celle, multisystem interaktioner nødvendiggør undersøgelse af angiogenese i et fysiologisk relevant miljø. Medens anvendelsen af in vitro celle-kultur-modeller har tilvejebragt mekanistiske indsigt, en fælles kritik er, at de ikke rekapitulere kompleksiteten forbundet med en mikrovaskulær netværk. Formålet med denne protokol er at demonstrere evnen til at få tid-lapse sammenligninger af intakte mikrovaskulære netværk før og efter angiogenese stimulering i dyrkede rotte mesenterium væv. Dyrkede væv indeholder mikrovaskulære netværk, der opretholder deres hierarki. Immunhistokemisk mærkning bekræfter tilstedeværelsen af endotelceller, glatte muskelceller, pericytter, blodkar og lymfekar. I enddition, mærkning væv med BSI-lektin muliggør time-lapse sammenligning af lokale netværk regioner før og efter serum eller vækstfaktor stimulation karakteriseret ved øget kapillær spiring og skib tæthed. I sammenligning med almindelige cellekulturmodeller, denne fremgangsmåde tilvejebringer et værktøj til endotheliale celle afstamning undersøgelser og vævsspecifik angiogen evaluering lægemiddel i fysiologisk relevante mikrovaskulære netværk.
Introduction
Mikrovaskulær netværk vækst og ombygninger er fællesnævnere for væv funktion, sårheling, og flere patologier og en vigtig proces er angiogenese, defineret som væksten af nye blodkar fra eksisterende 1, 2. For tissue engineering nye skibe eller designe angiogene baserede terapier, at forstå vigtigheden af de cellulære dynamik involveret i angiogenese er kritisk. Men denne proces er kompleks. Det kan variere på bestemte placeringer inden for en mikrovaskulær netværk og involverer flere celletyper (dvs. endothelceller, glatte muskelceller, pericytter, makrofager, stamceller) og flere systemer (lymfatiske netværk og neurale netværk). Selvom in vitro-modeller har bidraget enormt til at undersøge forholdet mellem forskellige celler involveret i angiogenese 3, kan deres fysiologiske relevans blive undermineret på grund af thei r begrænset kompleksitet og det faktum, at de ikke afspejler nøje en in vivo situation. For at overvinde disse begrænsninger, tredimensionelle dyrkningssystemer 3, ex vivo vævsmodeller 4, mikrofluide systemer 5, 6, og beregningsmodeller 7 er udviklet og introduceret de senere år. Imidlertid er der stadig et behov for en model med time-lapse kapacitet til at efterforske angiogenese i intakte net mikrovaskulære ex vivo. Etableringen af nye time-lapse modeller for angiogenese studier med dette niveau af kompleksitet vil give et uvurderligt redskab til at forstå de underliggende mekanismer, der regulerer angiogenese og forbedre behandlinger.
En potentiel model, der muliggør ex vivo undersøgelse af angiogenese på tværs af et intakt mikrovaskulære netværk er rotter mesenteriet kulturmodel> 8. I seneste arbejde har vi vist, at blod og lymfe mikrovaskulære netværk forbliver levedygtigt efter kultur. Endnu vigtigere er, kan rotte mesenterium kultur model bruges til at undersøge funktionelle pericyt-endotel celle interaktioner, blod og lymfe endotel celle forbindelser, og time-lapse billeddannelse. Formålet med dette oplæg er at give vores protokol for time-lapse imaging-metoden. Vores repræsentative resultater dokumenterer de multiple celletyper, der forbliver levedygtigt efter stimulering af angiogenese med serum og tilbyde eksempler på anvendelse af denne fremgangsmåde til kvantificering vævsspecifikke angiogene responser samt endotelcelle-sporing undersøgelser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol dokumenterer en fremgangsmåde til anvendelse af rotte mesenterium kulturmodel som en ex vivo værktøj til time-lapse billeddannelse af mikrovaskulære netværk vækst. Tidligere arbejde i vores laboratorium har etableret brugen af vores model for 1) angiogenese 8, 2) lymfangiogenese 8, 3) pericyt-endotelcelle-interaktioner 8, og 4) antiangiogen drug test 9. Evnen til billeddannelse dyrkede rotte mese…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Institutes of Health Grant 5-P20GM103629 to WLM and the Tulane Center for Aging. We would like to thank Matthew Nice for his help with editing the protocol text.
Materials
| Drape | Cardinal Health | 4012 | 12”x12” Bio-Shield Regular Sterilization Wraps |
| Scalpel Handle | Roboz Surgical Instrument | RS-9843 | Scalpel Handle, #3; Solid; 4" Length |
| Sterile Surgical Blade | Cincinnati Surgical | 0110 | Stainless Steel; Size 10 |
| Culture Dish (60mm) | Thermo Scientific | 130181 | 10/Sleeve |
| Graefe Forcep (curved tweezers) | Roboz Surgical Instrument | RS-5135 | Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8mm Tip Width; 4" Length |
| Graefe Forcep (straight tweezers) | Roboz Surgical Instrument | RS-5130 | Micro Dissecting Forceps; Serrated, Straight; 0.8mm Tip Width; 4" Length |
| Noyes Micro Scissor | Roboz Surgical Instrument | RS-5677 | Noyes Micro Dissecting Spring Scissors; Straight, Sharp-Blunt Points; 13mm Cutting Edge; 0.25mm Tip Width, 4 1/2" Overall Length |
| Gauze Pads | FisherBrand | 13-761-52 | Non-Sterile Cotton Gauze Sponges; 4"x4" 12-Ply |
| Cotton-Tippled Applicators | FisherBrand | 23-400-124 | 6" Length; Wooden Shaft; Single Use Only |
| 6-Well Plate | Fisher Scientific | 08-772-49 | Flat Bottom with Low Evaporation Lid; Polystyrene; Non-Pyrogenic |
| Sterile Syring 5ml | Fisher Scientific | 14-829-45 | Luer-Lok Tip |
| Sterile Bowl | Medical Action Industries Inc. | 01232 | 32 oz. Peel Pouch; Blue; Sterile Single Use |
| 6-Well Plate Inserts (CellCrown Inserts) | SIGMA | Z681792-3EA | 6-Well Plate Inserts; Non-Sterile |
| Polycarbonate Filter Membrane | SIGMA | TMTP04700 | Isopore Membrane Filter; Polycarbonate; Hydrophilic; 5.0 µm, 47 mm, White Plain |
| Name | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Beuthanasia | Schering-Plough Animal Health Corp. Union (Ordered from MWI Veterinary Supply) | MWI #: 011168 | Active Ingredient: Per 100mL, 390 mg pentobarbital sodium, 50mg phenytoin sodium |
| Ketamine | Fort Dodge Animal Health (Ordered from MWI Veterinary Supply) | MWI #: 000680 | Kateset 100 mg/ml |
| Xylazine | LLOYD. Inc. (Ordered from MWI Veterinary Supply) | MWI #: 000680 | Anased 100 mg/ml |
| Saline | Baxter | 2F7122 | |
| PBS | Invitrogen | 14040-133 | |
| MEM | Invitrogen | 11095080 | |
| PenStrep | Invitrogen | 15140-122 | |
| FBS | Invitrogen | 16000-044 | |
| BSA | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | |
| Saponin | SIGMA | S7900-100G | |
| Isopropyl Alcohol | Fisher Scientific | S25372 | |
| Povidone-Iodine | Operand | 82-226 | |
| Hydrochloric Acid | SIGMA | 320331 | |
| Methanol | Fisher Scientific | 67-56-1 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | |
| FITC-conjugated Lectin | SIGMA | L9381-2MG | |
| Anti-NG2 Chondroitin Sulfate Proteoglycan Antibody | SIGMA | AB5320 | |
| PECAM (CD31) Antibody | BD Biosciences | 555026 | |
| LYVE-1 Antibody | AngioBio Co. | 11-034 | |
| Goat Anti-Rabbit Cy2-conjugated Antibody | Jackson ImmunoResearch | 111-585-144 | |
| Goat Anti-Mouse Cy3-conjugated Antibody | Jackson ImmunoResearch | 115-227-003 | |
| Streptavidin Cy3-conjugated Antibody | Jackson ImmunoResearch | 016-160-084 | |
| Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen | L3224 | |
| Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| 5-Bromo-2'-Deoxyuridine | SIGMA | B5002 | |
| Monoclonal Mouse Anti-Bromodeoxyuridine Clone Bu20a | Dako | M074401-8 | |
| Mouse Anti-Rat CD11b | AbD Serotec | MCA275R |
References
- Carmeliet, P., Jain, R. K. Angiogenesis in cancer and other diseases. Nature. 407 (6801), 249-257 (2000).
- Carmeliet, P. Angiogenesis in life, disease and medicine. Nature. 438 (7070), 932-936 (2005).
- Kaunas, R., Kang, H., Bayless, K. J. Synergistic Regulation of Angiogenic Sprouting by Biochemical Factors and Wall Shear Stress. Cell Mol Bioeng. 4 (4), 547-559 (2011).
- Pitulescu, M. E., Schmidt, I., Benedito, R., Adams, R. H. Inducible gene targeting in the neonatal vasculature and analysis of retinal angiogenesis in mice. Nat Protoc. 5 (9), 1518-1534 (2010).
- Song, J. W., Munn, L. L. Fluid forces control endothelial sprouting. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (37), 15342-15347 (2011).
- Chan, J. M., et al. Engineering of in vitro 3D capillary beds by self-directed angiogenic sprouting. PLoS One. 7 (12), e50582 (2012).
- Peirce, S. M., Mac Gabhann, F., Bautch, V. L. Integration of experimental and computational approaches to sprouting angiogenesis. Curr Opin Hematol. 19 (3), 184-191 (2012).
- Stapor, P. C., Azimi, M. S., Ahsan, T., Murfee, W. L. An angiogenesis model for investigating multicellular interactions across intact microvascular networks. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 304 (2), H235-H245 (2013).
- Azimi, M. S., et al. An ex vivo model for anti-angiogenic drug testing on intact microvascular networks. PLoS One. 10 (3), e0119227 (2015).
- Nicosia, R. F., Ottinetti, A. Growth of microvessels in serum-free matrix culture of rat aorta. A quantitative assay of angiogenesis in vitro. Lab Invest. 63 (1), 115-122 (1990).
- Hutter-Schmid, B., Kniewallner, K. M., Humpel, C. Organotypic brain slice cultures as a model to study angiogenesis of brain vessels. Front Cell Dev Biol. 3, 52 (2015).
- Sawamiphak, S., Ritter, M., Acker-Palmer, A. Preparation of retinal explant cultures to study ex vivo tip endothelial cell responses. Nat Protoc. 5 (10), 1659-1665 (2010).
- Unoki, N., Murakami, T., Ogino, K., Nukada, M., Yoshimura, N. Time-lapse imaging of retinal angiogenesis reveals decreased development and progression of neovascular sprouting by anecortave desacetate. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (5), 2347-2355 (2010).
- Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J Cell Mol Med. 10 (3), 588-612 (2006).
- Kelly-Goss, M. R., Sweat, R. S., Azimi, M. S., Murfee, W. L. Vascular islands during microvascular regression and regrowth in adult networks. Front Physiol. 4, 108 (2013).
- Kelly-Goss, M. R., et al. Cell proliferation along vascular islands during microvascular network growth. BMC Physiol. 12, 7 (2012).
- Skalak, T. C., Price, R. J. The role of mechanical stresses in microvascular remodeling. Microcirculation. 3 (2), 143-165 (1996).
- Kadohama, T., Nishimura, K., Hoshino, Y., Sasajima, T., Sumpio, B. E. Effects of different types of fluid shear stress on endothelial cell proliferation and survival. J Cell Physiol. 212 (1), 244-251 (2007).
- Milkiewicz, M., Brown, M. D., Egginton, S., Hudlicka, O. Association between shear stress, angiogenesis, and VEGF in skeletal muscles in vivo. Microcirculation. 8 (4), 229-241 (2001).
- Corliss, B. A., Azimi, M. S., Munson, J. M., Peirce, S. M., Murfee, W. L. Macrophages: An Inflammatory Link Between Angiogenesis and Lymphangiogenesis. Microcirculation. 23 (2), 95-121 (2016).
