Der gives oplysninger om, hvordan QTL-kortlægning med et genomsekvensbaseret genetisk kort kan bruges til at identificere et lægemiddelresistensgen i Toxoplasma gondii og hvordan dette kan verificeres med CRISPR / Cas9-systemet, der effektivt redigerer et genomisk mål, i dette tilfælde Lægemiddelresistensgen.
Videnskabelig viden er i bund og grund forbundet med tilgængelige teknologier og metoder. Denne artikel vil præsentere to metoder, der muliggør identifikation og verifikation af et lægemiddelresistensgen i Apicomplexan parasit toxoplasma gondii , metoden for kvantitativ trait lokalisering (QTL) kortlægning ved hjælp af et generisk genetisk kort med hele genomsekvens (WGS) og metoden Af klynget regelmæssigt interspaced kort palindromisk gentagelser (CRISPR) / Cas9-baseret genredigering. Tilgangen ved QTL-kortlægning gør det muligt at teste om der er en sammenhæng mellem en genomisk region (er) og en fænotype. To datasæt er påkrævet for at køre en QTL-scanning, et genetisk kort baseret på afkom af et rekombinant kryds og en kvantificerbar fænotype vurderet i hvert af afkom fra dette kryds. Disse datasæt formateres derefter for at være kompatible med R / qtl-software, der genererer en QTL-scanning for at identificere signifikante loci korreleret med fænotypen. Selvom dette i høj grad kan indsnævre søgningen wIndkomst af mulige kandidater, QTLs spænder regioner, der indeholder en række gener, hvorfra kausal genet skal identificeres. At have WGS af afkom var kritisk til at identificere den kausal medicinresistensmutation på genniveauet. Efter identifikation kan kandidatmutationen verificeres ved genetisk manipulation af lægemiddelfølsomme parasitter. Den mest enkle og effektive metode til genetisk modifikation af T. gondii er CRISPR / Cas9-systemet. Dette system omfattede kun 2 komponenter, som begge kodede på et enkelt plasmid, et enkelt styrings-RNA (gRNA) indeholdende en 20 bp sekvens komplementær til det genomiske mål og Cas9 endonukleasen, der genererer en dobbeltstrenget DNA-pause (DSB) ved målet, Reparation der tillader indsættelse eller sletning af sekvenser omkring pauseområdet. Denne artikel indeholder detaljerede protokoller til at anvende CRISPR / Cas9-baserede genomeedigeringsværktøjer til at verificere genet, der er ansvarligt for sinfunginresistens og at konstruere transgene parasitter.
Værtsområde bestemmer omfanget af en parasiternes prævalens. Nogle parasitter har meget specifikke værtsbehov, der begrænser området, hvorfra de findes, andre er generalister. En sådan generalist er Toxoplasma gondii ( T. gondii) . Denne parasit findes over hele verden, da den kan inficere alle pattedyr og mange fugle. Mennesker er også modtagelige, og det anslås, at ca. 1/3 af den globale befolkning er blevet smittet. Heldigvis styrer en robust immunrespons normalt parasittenes vækst, men i situationer, hvor immunsystemet er kompromitteret, kan parasitten vokse ukontrolleret og forårsage sygdomme, ofte encephalic. Også denne parasit kan forårsage medfødte sygdomme, hvis tidligere uinficerede kvinder er inficeret under graviditeten, da de mangler immunhukommelse for hurtigt at begrænse parasittenes spredning. Derudover er der en byrde for okulær toksoplasmose, som kan resultere i synetab 1 . Til disse reasoNs T. gondii er blevet et fokus for studier og på grund af de mange molekylære metoder, der er udviklet til undersøgelsen, en model for Apicomplexan-parasitter. To metoder, der vil blive diskuteret her, er kvantitativ træk lokalisering (QTL) kortlægning og klynget regelmæssigt interspaced kort palindromisk gentagelser (CRISPR) / Cas9 gen redigering. QTL kortlægning og CRISPR / Cas9 redigering er henholdsvis fremadrettede og omvendte genetiske fremgangsmåder, der er blevet anvendt i tidligere undersøgelser for at identificere og / eller karakterisere T. gondii virulensgener. Her kombineres disse metoder til at identificere og bekræfte funktionen af et SNFr-gen, TgME49_290860, og dets orthologer (annoteret som SNR1 ) 2 .
Selv om T. gondii kan inficere et bredt udvalg af mellemliggende værter, skal det passere igennem og inficere de tarmepitelceller af et felid for at fuldføre livscyklusen. Katte er de endelige værter af parasitten, hvor sExual stadier fremstilles, og genetisk rekombination via meiose forekommer. For at gennemføre en QTL undersøgelse skal man skabe et genetisk kryds, og i tilfælde af toxoplasma betyder det at passere to forskellige parasitstammer, der afviger i et fænotypisk træk, forældrenes pletter gennem en kat til fremstilling af rekombinant afkom 3 . Før de bliver fodret til katte, gøres forældresstammerne resistente over for separate lægemidler for at muliggøre mere effektiv identifikation af rekombinanter ved dobbeltmedicinsk selektion af afkom 4 . Tre stoffer er blevet brugt i T. gondii til dette formål; Fluorodeoxyribose (FUDR), for hvilken uracilphosphoribosyltransferase ( UPRT ) er resistensgenet 5 , adenosin arabinosid (ARA), for hvilket Adenosine Kinase ( AK ) er resistensgenet 6 og sinusfungin (SNF), for hvilket resistensgenet var ukendt 7 . Flere genetiske kryds har væretSkabt for T. gondii , men kun de 24 afkom af ME49-FUDR r X VAND-SNF r- krydset blev genotyperet ved anvendelse af fuldgenomsekvensering (WGS) 8 . Dette åbnede muligheden for kortlægning og identifikation af SNF-resistensgenet ved anvendelse af dette kryds, da VAND-forældre blev gjort modstandsdygtige ved kemisk mutagenese af den lægemiddelfølsomme VAND (VAND-SNF s ) -stamme, og VAND-referencegenomet blev sekventeret under anvendelse af VAND- SNF s- stamme, hvilket således muliggør identifikation af alle polymorfier mellem afkom WGS og VAND-SNFs referencegenomet, herunder den arvelige forældreløse VAND-SNF r- mutation, der gjorde nogle af de afkomne resistente for afkom.
For at identificere den kausale enkelt nukleotidpolymorfisme (SNP) i SNF r- avkommen, kan flere beregningsbaserede open source-ressourcer anvendes til at analysere dataene. For at oprette det genetiske kort til ME49-FUDR r X VAND-SNF r krydse REDHORSE software suite 9 blev udviklet, der bruger WGS-indstillinger af forældrene og afkom til nøjagtigt at detektere de genomiske positioner af genetiske krydsninger. Denne kortlægningsinformation kan derefter kombineres med de fænotypiske data (SNF r i afkom) for at formatere et datasæt, der er kompatibelt med 'qtl'-pakken 10 i den R statistiske programmeringssoftware, hvor en QTL-scan kan køres for at afsløre vigtige loci korreleret med fænotype. For at identificere det kausal SNP, der er placeret inden for QTL-locuset, kan WGS-aflæsningerne af afkommet tilpasses individuelt til det sinfungin-følsomme VAND-genom ved anvendelse af Bowtie 2-justeringsprogrammet 11, hvorfra SNP'er kan kaldes ved hjælp af VarScan mpileup2snp-variantopkaldsprogrammet 12 . Ved hjælp af disse SNP'er kan QTL-locussen derefter scannes for polymorfier, som er til stede i SNF r, men ikkeI SNF s afkom. Med det kausal SNP, der er identificeret i det kodende område af et gen, kan genetisk modifikation af det kandidat SNF r- gen udføres i en SNF s- stamme for at verificere lægemiddelresistensfunktionen.
CRISPR / Cas9 genometredigeringssystemet blev for nylig etableret i Toxoplasma 13 , som tilføjede vigtige værktøjer til udforskning af den komplekse biologi af denne parasit, især for genetiske undersøgelser i ikke-laboratorie-tilpassede stammer. På grund af den meget aktive ikke-homologe endeforbindelses (NHEJ) aktivitet i WT Toxoplasma- celler er målrettet genommodifikation vanskeligt at opnå, da eksogent indført DNA er tilfældigt integreret i genomet ved ekstrem høj frekvens 14 . For at øge succesfrekvensen for lokalspecifik modifikation har forskellige fremgangsmåder været anvendt til at øge effektiviteten af homolog rekombination og / eller reducere thE NHEJ aktivitet 15 , 16 . En af disse fremgangsmåder er CRISPR / Cas9-systemet. Sammenlignet med andre metoder er CRISPR / Cas9-systemet effektivt til at indføre stedspecifikke modifikationer og er let at designe 13 , 17 , 18 . Derudover kan den anvendes i enhver Toxoplasma- stamme uden ekstra modifikation af parasitten 13 , 19 .
CRISPR / Cas9-systemet stammede fra det adaptive immunsystem af Streptococcus pyogenes , som bruger det til at forsvare invasionen af mobile genetiske elementer, såsom fag 20 , 21 , 22 . Dette system anvender det RNA-styrede DNA-endonuclease-enzym Cas9 for at indføre dobbeltstrenget DNA-pause (DSB) i målet, som efterfølgende repaEnten af det fejlbehæftede NHEJ for at inaktivere målgener gennem korte indelmutationer eller ved homologi-rettet rekombination for at ændre mållokalet præcis som designet 23 , 24 . Målspecificiteten bestemmes af et lille RNA-molekyle ved navn single-guide RNA (gRNA), som indeholder en individuelt designet 20 nt-sekvens, der har 100% homologi til mål-DNA'et 22 . GRNA-molekylet indeholder også signaturer genkendt af Cas9, der styrer nukleasen til målstedet, hvilket omfatter en særlig Protospacer tilstødende motiv (PAM, sekvens er 'NGG') 25 , 26 . Derfor arbejder gRNA-molekylet og PAM-sekvensen sammen for at bestemme Cas9-spaltningsstedet i genomet. Man kan nemt ændre gRNA-sekvensen for at målrette forskellige steder for spaltning.
Da CRISPR / Cas9-systemet først blev udviklet i ToxopLasma, blev et enkelt plasmid, der udtrykker Cas9-nukleasen og gRNA-molekylet, anvendt til at indføre DSB på målingsstedet 13 , 17 . Det har vist sig, at CRISPR / Cas9-systemet drastisk forøger effektiviteten af stedspecifik genomgenmodifikation, ikke kun ved homolog rekombination, men også ikke-homolog integration af eksogent DNA 13 . Det gør det i wildtype stammer, der indeholder NHEJ aktivitet. Derfor kan dette system anvendes i i det væsentlige enhver toxoplasma- stamme til effektiv genomredigering. I et typisk eksperiment co-transficeres det målspecifikke CRISPR-plasmid og DNA-fragmentet, der anvendes til modifikation af målet, ind i parasitter. Hvis DNA-fragmentet, der anvendes til at modificere målet, indeholder homologe sekvenser til mål-locuset, kan homolog rekombination anvendes til at reparere DSB introduceret af CRISPR / Cas9 for at tillade præcis modifikation af målet. På den anden side, hvis intDNA-fragmentet ikke indeholder homolog sekvens, kan det stadig integreres i CRISPR / Cas9-målretningssiden. Sidstnævnte bruges ofte til at forstyrre gener ved indsættelse af selekterbare markører eller til at komplementere mutanter på loki, der tillader negativt valg 13 . Her tjener SNR1- locus som et eksempel for at vise, hvordan CRISPR / Cas9 kan anvendes til genafbrydelse og generering af transgene parasitter.
Disse protokoller frembyder adskillige metoder, der, når de kombineres, tillader identifikation af et lægemiddelresistensgen i T. gondii . To især var integreret i projektet, den forholdsvis erfarne metode til QTL-kortlægning og den nyligt udviklede metode til CRISPR / Cas9-genredigering. Lander og Botstein udgav deres indflydelsesrige papir i 1989 og demonstrerede QTL-kortlægning, der korrelerer genetiske loci med fænotyper 36 . Senere i 2012 beskrev Dounda og Charpentier CRISPR / Cas9-editeringssystemet i Streptococcus pyogenes 22, der hurtigt blev tilpasset som et genetisk værktøj i mange forskellige modeller, herunder T. gondii 13 , 17 . Begge metoder var nyttige her, hvor QTL-kortlægning definerede locus indeholdende lægemiddelresistensmutationen, der i sidste ende blev identificeret ved anvendelse af WGS-baseret SNP-detektion, og CRISPR / Cas9-redigering gav mig Ans for at bekræfte SNR1 er det genfindte lægemiddelresistensgen.
ME49-FUDR r X VAND-SNF r- kryds 8 blev oprindeligt udviklet til at forhøre en virulensfænotype 19 , men forældrenes stammer forekom også at have en yderligere fænotypisk forskel, for hvilken kausal genet ikke var kendt, sinusfældet resistens i VAND-forældre. Dette fremhæver en fordel ved krydser, idet de kan genindføres, når der ses yderligere fænotypiske forskelle i forældrene. Dette var tilfældet for et andet Toxoplasma- kryds, type 2 x type 3, hvor flere gener involveret i virulens blev fundet ved at kortlægge flere fænotyper 37 , 38 , 39 , 40 . Til dato er fire forskellige T. gondii- kryds blevet beskrevet og brugt til at kortlægge gener, som er ansvarlige for fænotyperSs = "xref"> 8 , 37 , 41 , 42 , som alle har potentialet til at blive genbrugt til at kortlægge nye fænotyper, for hvilke det genetiske grundlag ikke er kendt. Langs disse linjer er genomerne for 62 T. gondii- stammer, der repræsenterer den kendte globale genetiske mangfoldighed, sekventeret 43 . Nye kryds kan laves fra denne pool for stammer, der adskiller sig fra interessante fænotyper. Efter at have udtalt fordelene ved QTL-kortlægning, må det siges, at generering af et kryds er ikke en mindre virksomhed. Der er andre metoder, der kan bruges til at identificere årsagsgener. En kraftig teknik bruger kemisk mutagenese til at skabe mutanter, der kan screenes for fænotyper. For at finde årsagsgenet kan mutanter enten komplementeres med kosmidbiblioteker 44 eller genomsekventeringsmetoder kan anvendes til at finde årsagsmutationen 45 . For moSe her om to, se JoVE artikler fra Coleman et al. Og Walwyn et al. Der beskriver disse tilgange 46 , 47 .
Mange af de trin, der fører til identifikationen af den kausal SNF r- mutation (protokol 2 og 3) er baseret på beregningsmetoder udført med software, som er frit tilgængelig til akademisk brug. Detaljerede kommandoer for hvert trin er tilvejebragt, og når kørslen med de rigtige filer vil tillade brugeren at genskabe de datasæt, der er nødvendige for at finde årsags SNF r SNP. Husk at nogle af syntaksen i kommandoerne henviser til filnavne eller mappestruktur ($ PATH), der kan ændres til brugerens præference. Selvom de kommandoer, der gives her, helt sikkert ikke udtømmer måder man kan analysere et kryds med QTL analyse og WGS-baseret SNP-identifikation, er de tilstrækkelige til at gentage eksperimentet beskrevet i denne artikel og bør give brugeren mulighed for at blive m Malm er bekendt med, hvordan disse fremgangsmåder udnyttes trinvist.
Skønt QTL-kortlægning og WGS-sekvensbaseret SNP-detektion var tilstrækkelige til at identificere et kandidat SNF r- gen, er der behov for yderligere eksperimenter for at bekræfte dets rolle i lægemiddelresistens. Dette kan overbevisende ses ved genforstyrrelser eller knockout-teknikker, der begge kan opnås ved hjælp af CRISPR / Cas9 genredigering. Detaljerede metoder til anvendelse af CRISPR / Cas9 til enten at generere indelmutationer eller indsætte transgene konstruktioner i et målgen i T. gondii er givet. Målretningsspecifikiteten, som CRISPR / Cas9 giver, øger effektiviteten af genredigering over traditionelle metoder. Denne øgede effekt har også gjort det muligt at anvende ikke-laboratorie-tilpassede stammer til genetiske undersøgelser, som tidligere var vanskelige at modificere 13 . Selvom CRISPR / Cas9 i sin barndom allerede er blevet brugt til at forårsage genforstyrrelserLass = "xref"> 2 , 13 , 17 , 18 , 48 , 49 , tag gener 17 , og lav genknockouts 16 , 19 , 50 , 51 , 52 , 53 , 54 i T. gondii , lovende at være et nyttigt værktøj For mange andre undersøgelser i fremtiden.
Opdagelsen af, at SNR1- inaktivering fører til sinfældet resistens gør SNR1- locus til et lovende sted for transgen insertion eller genetisk komplementering. For at maksimere succesen med at anvende CRISPR / Cas9-medieret genmålretning til at lede integrationen af transgen til SNR1- locuset, bør følgende aspekter overvejesRødt under det eksperimentelle design. For det første anbefales en markeringsmarkør til at blive inkluderet i den transgene konstruktion for at øge effektiviteten af belastningskonstruktionen. Hvis der er inkluderet en markeringsmarkør, kan både positivt og negativt valg anvendes, hvilket resulterer i, at næsten 100% af de dobbelt valgte parasitter er transgene med GOI integreret på SNR1- locus. I modsætning hertil afhænger effektiviteten af succesfuld transgenese i høj grad af effektiviteten af cotransfektion af CRISPR-plasmidet og den transgene konstruktion, hvis den transgene konstruktion ikke indeholder yderligere selekterbare træk og afhænger af negativt selektion på SNR1- locuset.
For det andet, selv om CRISPR / Cas9-medieret stedsspecifik integration af et ikke-homologt DNA-fragment hyppigt anvendes til komplementering og transgenese, skal det bemærkes, at orienteringen af indsættelse ikke kan garanteres i sådanne tilfælde, hvor begge retninger er mulige. Dette kan udgøre problemerMs til nogle applikationer. For at komplementere en mutant med forskellige gen alleler er det for eksempel vanskeligt at sikre, at alle alleler indsættes i samme orientering, og uoverensstemmelser i orientering kan forårsage ekspressionsforskelle. Til denne type ansøgning anbefales DNA-konstruktioner med sekvenser homologe til SNR1- locuset, hvilket vil drive den korrekte integrationsorientering ( figur 6 ).
For det tredje er forholdet mellem CRISPR-plasmidet og det transgene DNA-molekyle under transfektion kritisk for succesfuld transgenisk belastningskonstruktion. Dette forhold skal justeres i henhold til udvælgelsesstrategierne. Følgende retningslinjer anbefales: 1) Hvis den transgene konstruktion indeholder en lægemiddelresistent markør og det tilsvarende lægemiddel, er det eneste valg, der anvendes til at generere transgene parasitter, dvs. det er ikke brugt sinfungin, det foreslåede molforhold mellem den transgene konstruktion og CRISPR-plasmaetId er 1: 5. Ved at anvende mere CRISPR-plasmid i dette tilfælde øges sandsynligheden for, at parasitter, der modtager den transgene konstruktion, også modtager CRISPR-plasmidet, derfor er de lægemiddelresistente parasitter mere tilbøjelige til at have markøren indsat på CRISPR-målingsstedet. Hvis forholdet er omvendt, vil de fleste parasitter, der modtager den transgene konstruktion, ikke få CRISPR-plasmidet. Som følge heraf opnår langt størstedelen af lægemiddelresistente parasitter den transgene konstruktion gennem tilfældig integration, der ikke er forbundet med CRISPR / CAS9-medieret stedspecifik insertion. 2) Hvis den transgene konstruktion indeholder en lægemiddelresistent markør, og det tilsvarende lægemiddel anvendes sammen med sinfungin for at vælge transgene parasitter, er det foreslåede molforhold mellem den transgene konstruktion og CRISPR-plasmidet 1: 1. Denne strategi giver den højeste effektivitet ved transgen belastning konstruktion. 3) Hvis den transgene konstruktion ikke indeholder en valgbar producent, afhænger af negativt valgVed sinfungin alene for at opnå transgene parasitter er det foreslåede molforhold mellem den transgene konstruktion og CRISPR-plasmidet 5: 1. Begrundelsen for dette design er det samme som i den første retningslinje ovenfor. Da både pyrimethamin og sinfungin blev anvendt til udvælgelse i protokol 5, blev forholdet mellem DHFR * mini-gen og det SNR1- målrettede CRISPR-plasmid sat som 1: 1.
Tværtimod har metoderne beskrevet her et detaljeringsniveau, som ikke var muligt at formidle i den oprindelige publikation, der identificerede SNR1 2 . Disse protokoller; Specielt bør kommandolinjens syntaks, sekventiel layout af de anvendte programmer og brugen af CRISPR / Cas9 hjælpe fremtidige bestræbelser for at identificere nye gener, som er ansvarlige for fænotyper.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke L. David Sibley og Asis Khan for deres bidrag til den oprindelige publikation, som disse protokoller bygger på. Dette arbejde blev finansieret af National Institutes of Health grant AI108721.
T25 flasks | Corning | 430639 | |
HFF | ATCC | SCRC-1041 | |
T. gondii ME49 strain | ATCC | 50840 | |
T. gondii VAND strain | ATCC | PRA-344 | |
DMEM (No Sodium Bicarbonate) | Life Sciences | 12800017 | |
Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | |
HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
Fetal Bovine Serum Premium Grade | VWR International | 97068-085 | |
L-Glutamine 200mM | Sigma Aldrich | G7513 | |
Gentamicin (10 mg/mL) | Life Technologies | 15710064 | |
Cell Scraper for Flasks | VWR International | 10062-904 | |
Syringe 10ml | BD | 309604 | |
Blunt needles 22g x 1" | BRICO Products | BN2210 | |
Nuclepore Filter 3.0 µm, 25mm | GE Healthcare | 110612 | |
Swin-Lok Filter Holder 25mm | GE Healthcare | 420200 | |
Hemacytometer | Propper MFG | 90001 | |
Sinefungin | Enzo Life Sciences | 380-070-M001 | |
R | The R Foundation | https://www.r-project.org/ | |
J/qtl | The Churchill Group | http://churchill.jax.org/software/jqtl.shtml | |
Bowtie2 | John Hopkins University | http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml | |
NCBI SRA Toolkit | NCBI | http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra/?view=toolkit_doc | |
SAMtools | Wellcome Trust Sanger Institute | http://www.htslib.org/ | |
VarScan | Washington University, St Louis | http://varscan.sourceforge.net/ | |
MUMmer | JCVI & Univ Hamburg | http://mummer.sourceforge.net/ | |
pSAG1::CAS9-U6::sgUPRT | Addgene | Plasmid #54467 | T. gondii CRISPR plasmid to cut the UPRT gene |
pSAG1::CAS9-U6::sg290860-6 | Addgene | Plasmid #59855 | T. gondii CRISPR plasmid to cut the TG*_290860 SNR1 gene |
pUPRT::DHFR-D | Addgene | Plasmid #58528 | Template for DHFR* mini gene |
Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit | New England Biolabs | E0552S | |
QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27106 | |
NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000 | |
LB Broth | Fisher Scientific | DF0446-07-5 | |
Potassium chloride | Sigma Aldrich | P9541 | |
Calcium chloride | Sigma Aldrich | 746495 | |
Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P9791 | |
Potassium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | P5504 | |
EDTA | Sigma Aldrich | E5134 | |
Magnesium chloride | Sigma Aldrich | M1028 | |
Adenosine triposhpate (ATP) | Sigma Aldrich | A6419 | |
L-glutathione (GSH) | Sigma Aldrich | G4251 | |
ECM 830 Electroporation System | BTX | 45-0002 | |
Electroporation Cuvette 4 mm | Harvard Apparatus | 45-0126 | |
Crytal Violet | Alfa Aesar | B21932-14 | |
6-well TC plate | Corning | 353046 | |
24-well TC plate | Corning | 353935 | |
Cover glass 12mm round | VWR International | 89015-724 | |
96-well TC plate | Corning | 353075 | |
Gibson Assembly Cloning Kit (Multi-fragment) | New England Biolabs | E5510S | |
Q5 High-Fidelity Polymerase | New England Biolabs | M0491S | |
Pyrimethamine | TCI AMERICA | P2037-1G | Use cuation when using pyrimethamine resistant parasites – see Protocol |