Details worden gepresenteerd over hoe QTL mapping met een genoomkaart op basis van een genoom sequentie kan worden gebruikt om een drug resistentie gen in Toxoplasma gondii te identificeren en hoe dit kan worden gecontroleerd met het CRISPR / Cas9 systeem dat efficiënt een genomisch doel bewerkt, in dit geval de Drug resistentie gen.
Wetenschappelijke kennis is intrinsiek verbonden aan beschikbare technologieën en methoden. In dit artikel worden twee methoden gegeven die toelaten voor het identificeren en verifiëren van een geneesmiddel resistentie gen in de Apicomplexan parasiet Toxoplasma gondii , de methode van kwantitatieve trait locus (QTL) mapping met behulp van een genoomkaart met een hele genoom sequentie (WGS) en de methode Van clusterde regelmatige interspaced korte palindromische herhalingen (CRISPR) / Cas9-gebaseerde genbewerking. De aanpak van QTL mapping maakt het mogelijk om te testen of er een correlatie bestaat tussen een genomische regio (en) en een fenotype. Er zijn twee datasets nodig om een QTL scan te kunnen uitvoeren, een genetische kaart gebaseerd op de nageslacht van een recombinant kruis en een kwantificeerbaar fenotype dat wordt beoordeeld in elk van de nakomelingen van dat kruis. Deze datasets worden dan geformatteerd om compatibel te zijn met R / qtl software die een QTL scan genereert om significante loci te identificeren die gecorreleerd is met het fenotype. Hoewel dit de zoekopdracht aanzienlijk kan verkleinenInkomst van mogelijke kandidaten, QTL's strekken zich over regio's die een aantal genen bevatten waaruit het causaal gen moet worden geïdentificeerd. Het hebben van WGS van de nakomelingen was van cruciaal belang om de causale drug resistentie mutatie op het genniveau te identificeren. Eenmaal geïdentificeerd kan de kandidaat mutatie worden gecontroleerd door genetische manipulatie van geneesmiddelen gevoelige parasieten. De meest eenvoudige en efficiënte methode om T. gondii genetisch te wijzigen is het CRISPR / Cas9-systeem. Dit systeem bestaat uit slechts 2 componenten die beide zijn gecodeerd op een enkel plasmide, een enkelvoudig geleidingsRNA (gRNA) dat een 20 bp sequentie bevat die complementair is aan het genomische doel en het Cas9 endonuclease dat een dubbelstrengs DNA-breuk (DSB) op het doel opwekt, Reparatie van die het mogelijk maakt om sequenties in de pauze plaats in te voeren of te verwijderen. Dit artikel bevat gedetailleerde protocollen om CRISPR / Cas9 gebaseerde genoom bewerkingshulpmiddelen te gebruiken om het gen dat verantwoordelijk is voor sinfungine resistentie te verifiëren en transgene parasieten te bouwen.
Gastheerbereik bepaalt de omvang van de prevalentie van een parasieten. Sommige parasieten hebben zeer specifieke gastheerbehoeften die het gebied beperken waaruit zij zijn gevonden, anderen zijn generalisten. Een dergelijke generalist is Toxoplasma gondii ( T. gondii) . Deze parasiet is wereldwijd gevonden, omdat het alle zoogdieren en veel vogels kan infecteren. Mensen zijn ook vatbaar en er wordt geschat dat ongeveer 1/3 van de wereldwijde bevolking is geïnfecteerd. Gelukkig controleert een robuuste immuunrespons normaal gesproken op de groei van de parasiet, maar in situaties waar het immuunsysteem in gevaar komt, kan de parasiet ongemarkeerd groeien en ziekte veroorzaken, vaak encefalische. Ook kan deze parasiet aangeboren ziekten veroorzaken als vroeger ongeïnfecteerde vrouwen tijdens de zwangerschap geïnfecteerd zijn, omdat ze immuungeheugen hebben om de verspreiding van de parasiet snel te beperken. Bovendien is er een last van oculaire toxoplasmose die kan leiden tot visieverlies 1 . Voor deze reasoNs T. gondii is uitgegroeid tot een focus van studie, en door de vele moleculaire methodes die zijn ontwikkeld voor zijn studie, een model voor Apicomplexan parasieten. Twee methodes die hier worden besproken, zijn de kwantitatieve tract locus (QTL) mapping en clustered regelmatig interspaced korte palindromische herhalingen (CRISPR) / Cas9 genbewerking. QTL mapping en CRISPR / Cas9 editing zijn respectievelijk voorwaartse en omgekeerde genetische benaderingen die in eerdere studies zijn gebruikt om T. gondii virulence genen te identificeren en / of te karakteriseren. Hier worden deze methoden gecombineerd om de functie van een SNF-gen, TgME49_290860, en zijn orthologen (geannoteerd als SNR1 ) 2 te identificeren en te bevestigen.
Hoewel T. gondii een grote verscheidenheid aan intermediaire gastheren kan infecteren, moet het de darmepitheelcellen van een felid doorvoeren en infecteren om de levenscyclus te voltooien. Katten zijn de definitieve gastheren van de parasiet waar de sExieke fasen worden geproduceerd en genetische recombinatie vindt plaats via meiose. Om een QTL studie uit te voeren moet men een genetisch kruis creëren, en in het geval van Toxoplasma betekent dit dat twee verschillende parasietstammen verschillen in een fenotypische eigenschap, de ouderlijke vlekken, door een kat om recombinante nakomelingen te produceren 3 . Voordat de katten worden gevoed, worden de ouderlijke stammen bestand tegen afzonderlijke geneesmiddelen, zodat een efficiëntere identificatie van recombinanten door middel van dubbele drugselectie van de nakomelingen 4 mogelijk is . Voor dit doel zijn drie drugs gebruikt in T. gondii ; Fluorodeoxyribose (FUDR) waarvoor uracil fosforibosyltransferase ( UPRT ) het resistentie gen 5 is , adenosine arabinoside (ARA) waarvoor Adenosine Kinase ( AK ) het resistentie-gen 6 is , en sinfungine (SNF) waarvoor het resistiemene onbekend was 7 . Verscheidene genetische kruisen zijn geweestGecreëerd voor T. gondii , maar alleen de 24 nakomelingen van het ME49-FUDR r X VAND-SNF r kruis werden genotypeerd met behulp van genoom sequentiebepaling (WGS) 8 . Dit heeft de mogelijkheid geopend om het SNF-resistentiegen te gebruiken door het kruis te identificeren en te identificeren, aangezien de VAND-ouder door middel van chemische mutagenese van de geneesmiddel gevoelige VAND (VAND-SNF s ) stam genotypeerd werd en het VAND-referentiegenoom werd sequentieerd onder toepassing van de VAND- SNF s- stam waardoor de identificatie van alle polymorfismen tussen het nageslacht WGS en het VAND-SNF 's referentiegenoom mogelijk is, met inbegrip van de erfelijke VAND-SNF r mutatie die een deel van de nageslacht resistente afkomst heeft gemaakt.
Om het causaal enkel nucleotide polymorfisme (SNP) in het SNF r- nageslacht te identificeren, kunnen verschillende computergebaseerde open bronbronnen worden gebruikt om de data te analyseren. Om de genetische kaart voor de ME49-FUDR r X VAND-SNF r cross de REDHORSE software suite 9 is ontwikkeld die gebruik maakt van WGS-uitlijning van de ouders en de nakomelingen om de genomische posities van genetische crossovers nauwkeurig te detecteren. Deze mapping informatie kan dan gecombineerd worden met de fenotypische data (SNF r in de nageslacht) om een dataset te vormen die compatibel is met het 'qtl' pakket 10 in de R statistische programmeersoftware waar een QTL scan kan worden uitgevoerd om significante loci te correleren met de fenotype. Om het causale SNP in het QTL locus te identificeren, kunnen de WGS-lezingen van de nageslacht individueel uitgelijnd worden aan het sinfungin-gevoelig VAND-genoom met behulp van het Bowtie 2-uitlijningsprogramma 11, waarvan SNP's kunnen worden genoemd met behulp van het VarScan mpileup2snp variant-oproepprogramma 12 . Met behulp van deze SNP's kan de QTL locus vervolgens worden gescand voor polymorfismen die aanwezig zijn in de SNF r, maar nietIn de nageslacht van de SNF. Met het causale SNP geïdentificeerd in het coderende gebied van een gen, kan genetische modificatie van het kandidaat SNF r gen uitgevoerd worden in een SNF s stam om de drug resistentie functie te verifiëren.
Het CRISPR / Cas9 genoom bewerkingssysteem is onlangs opgericht in Toxoplasma 13 , die belangrijke instrumenten heeft toegevoegd voor de verkenning van de complexe biologie van deze parasiet, met name voor genetische studies in niet-laboratorium aangepaste stammen. Door de zeer actieve non-homologous End Joining (NHEJ) activiteit in WT Toxoplasma cellen, is gerichte genoom modificatie moeilijk te bereiken, aangezien exogent geïntroduceerd DNA willekeurig geïntegreerd is in het genoom bij extreem hoge frequentie 14 . Om de succesfrequentie van locus-specifieke modificatie te verhogen, zijn verschillende benaderingen toegepast om de efficiëntie van homologe recombinatie te verhogen en / of te verminderenE NHEJ activiteit 15 , 16 . Een van deze benaderingen is het CRISPR / Cas9-systeem. Vergeleken met andere methoden is het CRISPR / Cas9-systeem efficiënt om site-specifieke wijzigingen in te voeren en is het gemakkelijk om 13 , 17 , 18 te ontwerpen. Daarnaast kan het in elke Toxoplasma stam gebruikt worden zonder extra modificatie aan de parasiet 13 , 19 .
Het CRISPR / Cas9-systeem is afkomstig van het adaptieve immuunsysteem van Streptococcus pyogenes , die het gebruikt om de invasie van mobiele genetische elementen zoals fages 20 , 21 , 22 te verdedigen. Dit systeem maakt gebruik van het RNA-geleid DNA-endonuclease-enzym Cas9 om dubbelstrengs DNA-breuk (DSB) in het doel te introduceren, dat vervolgens wordt herhaaldAfkomstig van de foutgevoelige NHEJ om doelgenen te inactiveren door korte indel mutaties, of door homologie gerichte recombinatie om de target locus precies zoals ontworpen 23 , 24 te wijzigen . De target specificiteit wordt bepaald door een klein RNA molecuul genaamd single guide RNA (gRNA), die een individueel ontworpen 20 nt sequentie bevat die 100% homologie heeft op het doel DNA 22 . Het gRNA-molecuul bevat ook handtekeningen die worden herkend door Cas9, die de nuclease naar de doelplaats leiden, die een speciaal Protospacer-aangrenzend motief bevat (PAM, sequentie is 'NGG') 25 , 26 . Daarom werken het gRNA-molecuul en de PAM-sequentie samen om de Cas9-splitsingsplaats in het genoom te bepalen. Men kan de gRNA-sequentie gemakkelijk veranderen om verschillende sites voor splitsing te targeten.
Toen het CRISPR / Cas9-systeem voor het eerst in Toxop werd ontwikkeldLasma, een enkel plasmide dat het Cas9 nuclease uitdrukt en het gRNA molecuul werd gebruikt om DSB op de targeting site 13 , 17 te introduceren. Het is aangetoond dat het CRISPR / Cas9 systeem de efficiëntie van plaatsspecifieke genoommodificatie drastisch verhoogt, niet alleen door homologe recombinatie maar ook niet-homologe integratie van exogeen DNA 13 . Dit doet dit in wildtype stammen die NHEJ activiteit bevatten. Daarom kan dit systeem in hoofdzakelijk elke Toxoplasma- stam gebruikt worden voor efficiënte genoombewerking. In een typisch experiment worden het doelspecifieke CRISPR-plasmide en het DNA-fragment dat gebruikt wordt om het doel te wijzigen co-transfecteerd in parasieten. Als het DNA-fragment dat gebruikt wordt om het doel te wijzigen, homologe sequenties bevat aan de doellocus, kan homologe recombinatie worden gebruikt om de DSB, die door CRISPR / Cas9 is geïntroduceerd, te repareren om nauwkeurige modificatie van het doel toe te staan. Aan de andere kant, als de intGerukt DNA fragment bevat geen homologe sequentie, het kan nog steeds geïntegreerd worden in de CRISPR / Cas9 targeting site. Deze laatste wordt vaak gebruikt om genen te verstoren door invoeging van selecteerbare markers of complementatie van mutanten op loci die negatieve selectie mogelijk maken 13 . Hier dient de SNR1 locus als voorbeeld om te laten zien hoe CRISPR / Cas9 kan worden gebruikt voor genverstoring en de generatie van transgene parasieten.
Deze protocollen presenteren verschillende methoden die, wanneer gecombineerd, de identificatie van een geneesmiddelweerstandgen in T. gondii mogelijk maken . Twee in het bijzonder waren integraal voor het project, de relatief gekruide methode van QTL mapping en de recent ontwikkelde methode van CRISPR / Cas9 gen editing. Lander en Botstein publiceerden hun invloedrijke papier in 1989 en tonen QTL-mapping die genetische loci met fenotypen 36 correleren. Meer recent in 2012 beschreef Dounda en Charpentier het CRISPR / Cas9-bewerkingssysteem in Streptococcus pyogenes 22 die snel in verschillende modellen werd aangepast als een genetisch instrument, waaronder T. gondii 13 , 17 . Beide methoden waren hier nuttig, waar QTL-mapping de locus definieerde die de resistentiemutatie van de drug bevat die uiteindelijk werd geïdentificeerd met behulp van WGS-gebaseerde SNP-detectie, en CRISPR / Cas9-editing leverde mij de Ans om te bevestigen dat SNR1 het genotype drug resistentie gen is.
De ME49-FUDR r X VAND-SNF r kruis 8 werd oorspronkelijk ontwikkeld om een virulentie fenotype 19 te ondervragen, maar de ouderlijke stammen bleken ook een additioneel fenotypisch verschil te hebben waarvoor het causaal gen niet bekend was, de ontstekingsweerstand in de VAND-ouder. Dit wijst op een voordeel van kruisen doordat ze opnieuw kunnen worden herhaald wanneer er extra fenotypische verschillen in de ouders worden waargenomen. Dit was het geval voor een ander Toxoplasma kruis, type 2 x type 3, waar meerdere genen betrokken bij virulentie werden gevonden door meerdere fenotypes 37 , 38 , 39 , 40 te mappen. Tot op heden zijn vier verschillende T. gondii crosses beschreven en gebruikt om genen die verantwoordelijk zijn voor fenotypen te plannenSs = "xref"> 8 , 37 , 41 , 42 , die alle mogelijkheden hebben om opnieuw te gebruiken om nieuwe fenotypes te plannen waarvoor de genetische basis onbekend is. Langs deze lijnen zijn de genen voor 62 T. gondii stammen die de bekende wereldwijde genetische diversiteit vertegenwoordigen, gehersequentieerd 43 . Er kunnen nieuwe kruisingen worden gemaakt van dit zwembad voor stammen die verschillen in interessante fenotypen. Het hebben van de voordelen van QTL-mapping is uitgesproken, dat het genereren van een kruis geen kleine onderneming is. Er zijn andere methoden die kunnen worden gebruikt om causale genen te identificeren. Een krachtige techniek maakt gebruik van chemische mutagenese om mutanten te creëren die voor fenotypen kunnen worden gescreend. Om het causale gen te vinden kunnen mutanten complementair zijn met kosmide bibliotheken 44 of genoom resequencing methoden kunnen worden gebruikt om de causale mutatie 45 te vinden . Voor moZie hiervoor twee JoVE-artikelen van Coleman et al. En Walwyn et al. Dat beschrijven deze benaderingen 46 , 47 .
Veel van de stappen die leiden tot de identificatie van de causale SNF r mutatie (Protocols 2 en 3) zijn gebaseerd op berekeningsmethoden die worden uitgevoerd met software die vrij beschikbaar is voor academisch gebruik. Gedetailleerde commando's voor elke stap worden verstrekt en als de run met de juiste bestanden wordt uitgevoerd, kan de gebruiker de datasets die nodig zijn om de causale SNF r SNP te vinden opnieuw maken. Houd er rekening mee dat sommige van de syntaxis in de commando's verwijzen naar bestandsnamen of directorystructuur ($ PATH) die kan worden aangepast aan de gebruikers voorkeur. Hoewel de commando's die hier gegeven worden, zeker niet uitwerken hoe u een kruis kunt analyseren met QTL-analyse en WGS-gebaseerde SNP-identificatie, zijn ze uitgebreid genoeg om het experiment te herhalen dat in dit artikel wordt beschreven en moet de gebruiker worden m Erts bekend zijn met hoe deze benaderingen worden gebruikt in een stap voor stap mode.
Hoewel QTL mapping en WGS sequentie gebaseerde SNP detectie voldoende waren om een kandidaat SNF r gen te identificeren, zijn aanvullende experimenten nodig om zijn rol in drug resistentie te bevestigen. Dit kan overtuigend getoond worden door middel van genafbreking of knock-out technieken, die beide kunnen worden bereikt met behulp van CRISPR / Cas9 genbewerking. Gedetailleerde methoden voor het gebruik van CRISPR / Cas9 om indel mutaties te genereren of transgene constructen in een doelgen in T. gondii in te voeren, worden gegeven. De targeting specificiteit die CRISPR / Cas9 biedt, verhoogt de efficiëntie van genbewerking over traditionele methodes. Ook deze verhoogde efficiëntie heeft het mogelijk gemaakt om niet-laboratorium aangepaste stammen te gebruiken voor genetische studies die eerder moeilijk waren om 13 te wijzigen. Alhoewel CRISPR / Cas9 in zijn kinderschool al is gebruikt om genverstoringen te veroorzakenLass = "xref"> 2 , 13 , 17 , 18 , 48 , 49 , merk genen 17 en maak gene knockouts 16 , 19 , 50 , 51 , 52 , 53 , 54 in T. gondii , veelbelovend om een handig hulpmiddel te zijn Voor veel andere studies in de toekomst.
De ontdekking dat de SNR1- inactivatie leidt tot sinfungine resistentie maakt de SNR1 locus een veelbelovende plaats voor transgene insertie of genetische complementatie. Om het succes van het gebruik van CRISPR / Cas9 gemedieerde gen targeting te optimaliseren om de integratie van transgen in het SNR1 locus te leiden, dienen de volgende aspecten te worden overwogenRood tijdens het experimentele ontwerp. Ten eerste wordt een selectiemarkering aanbevolen om in het transgene constructie opgenomen te worden om de efficiëntie van de spanconstructie te verhogen. Als er een selectie marker is opgenomen, kunnen zowel positieve als negatieve selectie worden gebruikt, waardoor bijna 100% van de dubbel geselecteerde parasieten transgenic zijn met de GOI die op de SNR1 locus is geïntegreerd. Als het transgene construct echter geen aanvullende selecteerbare eigenschappen bevat en afhankelijk is van negatieve selectie op het SNR1 locus, hangt het efficiëntie van succesvolle transgenese grotendeels af van de efficiëntie van cotransfectie van het CRISPR-plasmide en het transgene construct.
Ten tweede, hoewel CRISPR / Cas9 gemedieerde site-specifieke integratie van een niet-homologe DNA-fragment vaak gebruikt wordt voor complementatie en transgenese, moet opgemerkt worden dat de oriëntatie van insertie niet kan worden gewaarborgd in zulke gevallen als beide richtingen mogelijk zijn. Dit kan problemen veroorzakenMs voor sommige toepassingen. Bijvoorbeeld, om een mutant aan te vullen met verschillende gen allelen, is het moeilijk om ervoor te zorgen dat alle allelen in dezelfde oriëntatie worden ingevoegd, en afwijkingen in oriëntatie kunnen expressieverschillen veroorzaken. Voor dit type applicatie worden DNA-constructies met sequenties die homologe zijn aan de SNR1 locus, aanbevolen, die de juiste integratie oriëntatie zullen aandrijven ( Figuur 6 ).
Ten derde, tijdens transfectie, is de verhouding tussen het CRISPR-plasmide en het transgene DNA-molecuul kritisch voor succesvolle transgene stamconstructie. Deze verhouding moet worden aangepast volgens de selectie strategieën. De volgende richtlijnen worden aanbevolen: 1) Als het transgene construct een geneesmiddelbestendige merker bevat en het bijbehorende geneesmiddel is de enige selectie die wordt gebruikt om transgene parasieten te genereren, dwz sinfungine wordt niet gebruikt, wordt de voorgestelde molverhouding tussen het transgene construct en het CRISPR-plasmaId is 1: 5. Het gebruik van meer CRISPR-plasmide verhoogt in dit geval de kans dat parasieten die het transgene construct ontvangen, ook het CRISPR-plasmide ontvangen. Daarom zijn de medicijnbestendige parasieten waarschijnlijker de markering op de CRISPR-targeting site geplaatst. Als de verhouding omgekeerd wordt, krijgen de meeste parasieten die het transgene construct ontvangen, het CRISPR-plasmide niet. Als gevolg daarvan krijgen de overgrote meerderheid van geneesmiddelbestendige parasieten het transgene construct door willekeurige integratie die niet verband houdt met CRISPR / CAS9-gemedieerde plaatsspecifieke insertie. 2) Als het transgene construct een geneesmiddelbestendige merker bevat en het overeenkomstige geneesmiddel wordt gebruikt samen met sinfungine om transgene parasieten te selecteren, is de voorgestelde molverhouding tussen het transgene construct en het CRISPR-plasmide 1: 1. Deze strategie biedt de hoogste efficiëntie van transgene stamconstructie. 3) Als het transgene construct geen selecteerbare maker bevat, vertrouwt u op negatieve selectieDoor alleen sinfungine om transgene parasieten te verkrijgen, is de voorgestelde molverhouding tussen het transgene construct en het CRISPR-plasmide 5: 1. De reden voor dit ontwerp is hetzelfde als in de eerste richtlijn hierboven. Aangezien zowel pyrimethamine als sinfungine werden toegepast voor selectie in protocol 5, werd de verhouding tussen DHFR * mini-gen en het SNR1- targetende CRISPR-plasmide ingesteld op 1: 1.
Samen hebben de hier beschreven methodes een detailniveau dat niet mogelijk was in de originele publicatie die SNR1 2 identificeerde. Deze protocollen; Specifiek, de syntax van de opdrachtregel, de opeenvolgende indeling van de gebruikte programma's en het gebruik van CRISPR / Cas9 dienen toekomstige inspanningen te helpen om nieuwe genen die verantwoordelijk zijn voor fenotypes te identificeren.
The authors have nothing to disclose.
We willen graag L. David Sibley en Asis Khan bedanken voor hun bijdrage aan de oorspronkelijke publicatie waarop deze protocollen zijn gebaseerd. Dit werk werd gefinancierd door National Institutes of Health subsidie AI108721.
T25 flasks | Corning | 430639 | |
HFF | ATCC | SCRC-1041 | |
T. gondii ME49 strain | ATCC | 50840 | |
T. gondii VAND strain | ATCC | PRA-344 | |
DMEM (No Sodium Bicarbonate) | Life Sciences | 12800017 | |
Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | |
HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
Fetal Bovine Serum Premium Grade | VWR International | 97068-085 | |
L-Glutamine 200mM | Sigma Aldrich | G7513 | |
Gentamicin (10 mg/mL) | Life Technologies | 15710064 | |
Cell Scraper for Flasks | VWR International | 10062-904 | |
Syringe 10ml | BD | 309604 | |
Blunt needles 22g x 1" | BRICO Products | BN2210 | |
Nuclepore Filter 3.0 µm, 25mm | GE Healthcare | 110612 | |
Swin-Lok Filter Holder 25mm | GE Healthcare | 420200 | |
Hemacytometer | Propper MFG | 90001 | |
Sinefungin | Enzo Life Sciences | 380-070-M001 | |
R | The R Foundation | https://www.r-project.org/ | |
J/qtl | The Churchill Group | http://churchill.jax.org/software/jqtl.shtml | |
Bowtie2 | John Hopkins University | http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml | |
NCBI SRA Toolkit | NCBI | http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra/?view=toolkit_doc | |
SAMtools | Wellcome Trust Sanger Institute | http://www.htslib.org/ | |
VarScan | Washington University, St Louis | http://varscan.sourceforge.net/ | |
MUMmer | JCVI & Univ Hamburg | http://mummer.sourceforge.net/ | |
pSAG1::CAS9-U6::sgUPRT | Addgene | Plasmid #54467 | T. gondii CRISPR plasmid to cut the UPRT gene |
pSAG1::CAS9-U6::sg290860-6 | Addgene | Plasmid #59855 | T. gondii CRISPR plasmid to cut the TG*_290860 SNR1 gene |
pUPRT::DHFR-D | Addgene | Plasmid #58528 | Template for DHFR* mini gene |
Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit | New England Biolabs | E0552S | |
QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27106 | |
NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000 | |
LB Broth | Fisher Scientific | DF0446-07-5 | |
Potassium chloride | Sigma Aldrich | P9541 | |
Calcium chloride | Sigma Aldrich | 746495 | |
Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P9791 | |
Potassium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | P5504 | |
EDTA | Sigma Aldrich | E5134 | |
Magnesium chloride | Sigma Aldrich | M1028 | |
Adenosine triposhpate (ATP) | Sigma Aldrich | A6419 | |
L-glutathione (GSH) | Sigma Aldrich | G4251 | |
ECM 830 Electroporation System | BTX | 45-0002 | |
Electroporation Cuvette 4 mm | Harvard Apparatus | 45-0126 | |
Crytal Violet | Alfa Aesar | B21932-14 | |
6-well TC plate | Corning | 353046 | |
24-well TC plate | Corning | 353935 | |
Cover glass 12mm round | VWR International | 89015-724 | |
96-well TC plate | Corning | 353075 | |
Gibson Assembly Cloning Kit (Multi-fragment) | New England Biolabs | E5510S | |
Q5 High-Fidelity Polymerase | New England Biolabs | M0491S | |
Pyrimethamine | TCI AMERICA | P2037-1G | Use cuation when using pyrimethamine resistant parasites – see Protocol |