विवरण कैसे प्रस्तुत किया जाता है कि कैसे संपूर्ण जीनोम अनुक्रम आधारित आनुवंशिक मानचित्र के साथ QTL मैपिंग का प्रयोग टोक्सोप्लाज्मा गोंडी में एक दवा प्रतिरोध जीन की पहचान के लिए किया जा सकता है और यह कैसे CRISPR / Cas9 प्रणाली से सत्यापित किया जा सकता है, जो इस मामले में कुशलता से जीनोमिक लक्ष्य का संपादन करता है दवा प्रतिरोध जीन
वैज्ञानिक ज्ञान आंतरिक रूप से उपलब्ध तकनीकों और तरीकों से जुड़ा हुआ है। यह आलेख दो तरीके पेश करेगी जो अपिकॉम्पलेक्सान परजीवी टोक्सोप्लाज्मा गोंडी में एक प्रतिरोधी जीवाणु की पहचान और सत्यापन के लिए अनुमति प्रदान करते हैं, एक संपूर्ण जीनोम अनुक्रम (डब्लूजीएस) आधारित आनुवंशिक मानचित्र और पद्धति का उपयोग करते हुए मात्रात्मक विशेषता लोकस (QTL) मैपिंग की विधि क्लस्टर किए गए नियमित नियमित अंतर्सपेड लघु पालिंड्रोमिक दोहराव (सीआरआईएसपीआर) / कैस 9-आधारित जीन एडिटिंग का क्यू एल एल मैपिंग के दृष्टिकोण से एक जांच हो सकती है कि जीनोमिक क्षेत्र (एस) और एक फेनोटाइप के बीच कोई संबंध है या नहीं। एक क्यूटीएल स्कैन चलाने के लिए दो डेटासेट की आवश्यकता होती है, एक रीकॉम्बनेंट क्रॉस की संतान पर आधारित एक आनुवांशिक नक्शा और उस क्रॉस के प्रत्येक संतान में मूल्यांकन किया जाने वाला एक क्वांटिफेएबल फेनोटाइप। ये डेटासेट फिर आर / qtl सॉफ़्टवेयर के साथ संगत होने के लिए स्वरूपित किए जाते हैं जो कि फेनोटाइप से संबंधित महत्वपूर्ण लोकी की पहचान करने के लिए एक क्यूटीएल स्कैन उत्पन्न करता है। यद्यपि यह बहुत खोज w को संकुचित कर सकता हैसंभव उम्मीदवारों की कंडोम, क्यूटीएल के कई क्षेत्रों में जिन जीनों से युक्त जीन को पहचानने की जरूरत होती है। संतान के डब्ल्यूजीएस होने के कारण जीन स्तर पर कारण तंत्रिका प्रतिरोध प्रतिरोध को पहचानना महत्वपूर्ण था। एक बार पहचाने जाने पर, उम्मीदवार के उत्परिवर्तन की जांच नशीली दवाओं के परजीवी आनुवांशिक हेरफेर द्वारा की जा सकती है। आनुवांशिक रूप से टी गोंडी को संशोधित करने के लिए सबसे आसान और कुशल तरीका है सीआरआईएसपीआर / सीएस 9 प्रणाली। इस प्रणाली में केवल 2 घटक शामिल होते हैं, जो एक एकल प्लाज्मिड, एक एकल गाइड आरएनए (जीआरएनए) में जीनोमिक लक्ष्य के पूरक 20 बीपी अनुक्रम युक्त होते हैं और कैस 9 एंडोन्यूक्लेज़ जो लक्ष्य पर एक डबल-स्ट्रैंड डीएनए ब्रेक (डीएसबी) उत्पन्न करता है, मरम्मत जिसमें ब्रेक साइट के आसपास दृश्यों को सम्मिलन या हटाने की अनुमति मिलती है। इस लेख में सीरीएसपीआर / कास 9 आधारित जीनोम संपादन उपकरण का उपयोग करने के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करता है ताकि ये साबुन के लिए जिम्मेदार जीन को सत्यापित कर सके और ट्रांसजेनिक परजीवी का निर्माण कर सके।
होस्ट श्रेणी परजीवी के प्रसार की सीमा निर्धारित करती है। कुछ परजीवियों के पास बहुत विशिष्ट मेजबान आवश्यकताएं होती हैं जो उस क्षेत्र को सीमित करती हैं जहां से वे पाए जाते हैं, अन्य सामान्य हैं ऐसा एक सामान्य व्यक्ति टोक्सोप्लाज्मा गोंडी ( टी गोंडी) है । यह परजीवी दुनिया भर में पाया जाता है क्योंकि यह सभी स्तनधारियों और कई पक्षियों को संक्रमित कर सकता है। मनुष्य भी अतिसंवेदनशील होते हैं और अनुमान है कि लगभग 1/3 वैश्विक आबादी संक्रमित हो चुकी है। सौभाग्य से, एक मजबूत प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया परजीवी की वृद्धि को आम तौर पर नियंत्रित करती है, लेकिन उन स्थितियों में जहां प्रतिरक्षा प्रणाली से समझौता किया जाता है परजीवी अनियंत्रित हो सकता है और रोगों का कारण बन सकता है, अक्सर एन्सेफेलिक इसके अलावा, यह परजीवी जन्मजात बीमारियों का कारण बन सकता है यदि पूर्व में अप्रभावित महिलाएं गर्भावस्था के दौरान संक्रमित होती हैं क्योंकि उन्हें परजीवी के प्रसार को सीमित करने के लिए प्रतिरक्षा स्मृति की कमी होती है। इसके अतिरिक्त, ओकुलर टोक्सोप्लास्मोसिस का एक बोझ है जिसके परिणामस्वरूप दृष्टि हानि 1 हो सकती है । इन रिसाओं के लिएएनएस टी। गोंडिया अध्ययन का एक फोकस बन गया है, और इसके अध्ययन के लिए विकसित कई आणविक विधियों के कारण, अपिकोप्लेक्सन परजीवी के लिए एक मॉडल। यहां दो तरीकों पर विचार-विमर्श किया जाएगा, क्वांटिटेटिव ट्रैक्ट लोकस (क्यूटीएल) मैपिंग और क्लस्टर किया गया नियमित रूप से इनर्सपेस्ड लघु पिलिन्ड्रोमिक रेप्टाइसेस (सीआरआईएसपीआर) / कैस 9 जीन एडिटिंग। क्यू एल एल मैपिंग और सीआरआईएसपीआर / सीएस 9 संपादन अनुक्रम क्रमशः, आनुवंशिक दृष्टिकोणों को आगे और पीछे कर देते हैं जो पिछले अध्ययनों में टी। गोंडी विषाणु जीन को पहचानने और / या चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। यहां, इन विधियों को एक sinefungin प्रतिरोध (एसएनएफ आर ) जीन, टीजीएमई 94_290860, और इसके orthologs ( एसएनआर 1 के रूप में एनोटेट) के कार्य की पहचान और पुष्टि करने के लिए जोड़ा जाता है।
यद्यपि टी। गोंडी इंटरमीडिएट मेजबानों की एक विस्तृत विविधता को संक्रमित कर सकते हैं, यह जीवन चक्र को पूरा करने के लिए एक गुमशु के आंतों के उपकला कोशिकाओं के माध्यम से गुजरना पड़ता है और उसे संक्रमित कर सकता है। बिल्लियों परजीवी के निश्चित मेजबान हैं जहां एसबाह्य चरणों का उत्पादन होता है और अर्धसूत्रीविभाजन के माध्यम से आनुवांशिक पुनर्संयोजन होता है। एक क्यूटीएल अध्ययन करने के लिए, एक आनुवंशिक क्रॉस बनाना चाहिए, और टोक्सोप्लाज्मा के मामले में इसका मतलब है कि दो अलग-अलग परजीवी तनाव जो कि फेनोटाइपिक विशेषता में भिन्न हैं, माता-पिता के दाग, एक बिल्ली के माध्यम से पुनः संयोजक संतान 3 का निर्माण करने के लिए। बिल्लियों को खिलाए जाने से पहले, पैतृक नस्लों को अलग-अलग दवाओं के प्रति प्रतिरोधक बना दिया जाता है ताकि उन्हें पुन: संयोजक की अधिक कुशल पहचान के लिए संतान 4 की दोहरी दवाओं का चयन किया जा सके। इस प्रयोजन के लिए टी। गोंदी में तीन दवाओं का इस्तेमाल किया गया है; फ्लोरोडाइक्सीरिबोज़ ( एफयूडीआर ) जिसके लिए यूरैसिल फॉस्फोर्बिस्सिल ट्रांसपेरेज़ ( यूपीआरटी ) प्रतिरोध जीन 5 , एडेनोसिन अरबीनोसाइड (एआरए) है जिसके लिए एडेनोसिन किनेस ( एके ) प्रतिरोध जीन 6 और साइनेफिंगिन (एसएनएफ) है जिसके लिए प्रतिरोध जीन अज्ञात है 7 । कई आनुवंशिक पार किया गया हैटी गोंडी के लिए बनाया गया था, लेकिन ME49-FUDR r एक्स VAND-SNF r क्रॉस के केवल 24 संतान पूरे जीनोम अनुक्रमण (डब्लूजीएस) 8 का इस्तेमाल करते थे। इसने मैपिंग की संभावना खो दी और इस क्रॉस का इस्तेमाल करते हुए एसएनएफ प्रतिरोध जीन की पहचान की, क्योंकि वंद माता-पिता को ड्रग असेंबली VAND (VAND-SNF s ) तनाव के रासायनिक mutagenesis के द्वारा प्रतिरोधी प्रतिरोधी बनाया गया था, और VAND संदर्भ जीनोम को VAND- एसएनएफ का तनाव इस प्रकार संप्रतीन डब्ल्यूजीएस और VAND-SNF के संदर्भ जीनोम के बीच सभी बहुरूपताओं की पहचान करने के लिए अनुमति देता है, जिसमें वंशानुक्रमित पैतृक VAND-SNF R उत्परिवर्तन भी शामिल है, जो कुछ संतान sinefungin प्रतिरोधी प्रदान करता है।
एसएनएफ आर संतान में कारक एकल न्यूक्लियोटाइड बहुरूपता (एसएनपी) की पहचान करने के लिए, डेटा के विश्लेषण के लिए कई कम्प्यूटेशनल आधारित ओपन सोर्स संसाधनों का उपयोग किया जा सकता है। ME49- के लिए आनुवंशिक मानचित्र बनाने के लिएFUDR r एक्स VAND-SNF r रेडहोर्स सॉफ्टवेयर सुइट 9 को विकसित किया गया था जो माता-पिता और वंश के डब्ल्यूजीएस संरेखण का उपयोग करता है जो आनुवंशिक क्रोससोवर्स के जीनोमिक पदों को सही ढंग से पहचानते हैं। इस मैपिंग जानकारी को फिर से आरटी सांख्यिकीय प्रोग्रामिंग सॉफ़्टवेयर में 'qtl' पैकेज 10 के साथ संगत डेटसेट को प्रारूपित करने के लिए प्रोन्यटीपिक डेटा (एसएनएफ आर में संतान) के साथ जोड़ दिया जा सकता है, जहां एक क्यूटीएल स्कैन महत्वपूर्ण लोकी के साथ सहसंबंधित महत्वपूर्ण पता चलता है। फेनोटाइप। QTL लोकस के भीतर स्थित कारण एसएनपी की पहचान करने के लिए, डब्ल्यूजीएस पढ़ता है कि संतान को बोटी 2 संरेखण कार्यक्रम 11 का इस्तेमाल करते हुए अलग-अलग साइनेफुंगिन संवेदनशील वंड जीनोम के साथ गठबंधन किया जा सकता है, जिसमें से एसएनपी को वारसैन mpileup2snp संस्करण कॉलर प्रोग्राम 12 का उपयोग कर कहा जा सकता है। इन एसएनपी का प्रयोग करते हुए, क्यूटीएल लोकस को बहुरूपता के लिए स्कैन किया जा सकता है जो एसएनएफ आर में मौजूद हैं लेकिन नहींएसएनएफ एस संतान में एक जीन के कोडिंग क्षेत्र में पहचान के कारण एसएनपी के कारण, एसएनएफ आर जीन उम्मीदवार एसएनएफ के जीन को संशोधित करने के लिए दवा प्रतिरोध समारोह को सत्यापित करने के लिए एसएनएफ के तनाव में किया जा सकता है।
सीआरआईएसपीआर / सीएस 9 जीनोम संपादन सिस्टम हाल ही में टोक्सोप्लाज्मा 13 में स्थापित किया गया था, जिसने इस परजीवी के जटिल जीवविज्ञान की अन्वेषण के लिए विशेष रूप से गैर-प्रयोगशाला अनुकूलन वाले उपभेदों में आनुवांशिक अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण उपकरण जोड़े। डब्ल्यूटीटी टोक्सोप्लाज्मा कोशिकाओं में अत्यधिक सक्रिय गैर-घरानुक्रमिक अंत में शामिल होने (एनएचईजे) की गतिविधि के कारण, लक्षित जीनोम संशोधन को हासिल करना मुश्किल है क्योंकि एक्सएनजेने डीएनए को बेहद उच्च आवृत्ति 14 पर बेतरतीब ढंग से जीनोम से एकीकृत किया गया है। विशिष्ट विशिष्ट संशोधन के सफलता दर को बढ़ाने के लिए, मुताबिक़ पुनर्संयोजन की दक्षता बढ़ाने के लिए और / या कमी करने के लिए विभिन्न तरीकों को नियोजित किया गया हैएनएचएचईजे गतिविधि 15 , 16 इनमें से एक दृष्टिकोण CRISPR / Cas9 प्रणाली है। अन्य तरीकों की तुलना में, सीआरआईएसपीआर / सीएस 9 प्रणाली साइट-विशिष्ट संशोधनों को शुरू करने में सक्षम है और 13 , 17 , 18 की डिजाइन करने में आसान है। इसके अलावा, यह परजीवी 13 , 1 9 के अतिरिक्त संशोधन के बिना किसी भी टोक्सोप्लाज्मा तनाव में इस्तेमाल किया जा सकता है।
सीआरआईएसपीआर / सीएस 9 प्रणाली स्ट्रैपटोकोकस पायोजनेज की अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली से उत्पन्न होती है, जो इसे 20 , 21 , 22 के चरण जैसे मोबाइल आनुवंशिक तत्वों के आक्रमण का बचाव करने के लिए उपयोग करती है। इस प्रणाली ने आरएनए द्वारा निर्देशित डीएनए एंडोन्यूक्लाइज़ एंजाइम सीएस 9 को लक्ष्य में डबल-स्ट्रैंड डीएनए ब्रेक (डीएसबी) का परिचय दिया, जो बाद में रिपक्षुधा-प्रवण एनएचईजेई द्वारा लघु इंडल म्यूटेशनों के माध्यम से लक्षित जीनों को निष्क्रिय करने के लिए, या समरूपता द्वारा निर्देशित पुनर्संयोजन द्वारा लक्षित लक्ष्य को ठीक से 23 , 24 के रूप में बदल दिया गया। लक्ष्य विशिष्टता एकल आरएनए (जीआरएनए) नामक छोटे आरएनए अणु द्वारा निर्धारित की जाती है, जिसमें एक व्यक्तिगत रूप से डिजाइन 20 एनटी अनुक्रम होता है जो लक्ष्य डीएनए 22 में 100% समरूपता है। जीआरएनए अणु में सीसी 9 द्वारा मान्यता प्राप्त हस्ताक्षर भी शामिल हैं, जो लक्ष्य साइट पर न्युकले को मार्गदर्शन करते हैं, जिसमें एक विशेष प्रोटॉस्पायर एडजेसेंट मोटीफ (पीएएम, अनुक्रम 'एनजीजी') 25 , 26 शामिल है । इसलिए, जीआरएनए अणु और पीएएम अनुक्रम जीनोम में कैस 9 क्लेविज साइट को निर्धारित करने के लिए मिलकर काम करते हैं। दरार के लिए विभिन्न साइटों को लक्षित करने के लिए जीआरएनए अनुक्रम आसानी से बदल सकता है।
जब CRISPR / Cas9 प्रणाली को पहली बार Toxop में विकसित किया गया थालैज़मा, कैस 9 न्यूकाईज को व्यक्त करने वाला एकल प्लाज्मिड और जीआरएनए अणु का लक्ष्य लक्ष्यीकरण साइट 13 , 17 में डीएसबी को पेश करने के लिए किया गया था। यह दिखाया गया है कि सीआरआईएसपीआर / सीएस 9 प्रणाली साइट-विशिष्ट जीनोम संशोधन की दक्षता को बढ़ाती है, न केवल मुताबिक़ पुनर्संयोजन के कारण, बल्कि बाहरी डीएनए 13 के गैर-मुताबिक़ एकीकरण भी। यह ऐसा wildtype उपभेदों में होता है जिसमें NHEJ गतिविधि शामिल होती है। इसलिए, इस प्रणाली का उपयोग प्रभावी जीनोम संपादन के लिए अनिवार्य रूप से किसी भी टॉक्सोप्लाज्मा तनाव में किया जा सकता है। एक विशिष्ट प्रयोग में, लक्ष्य विशिष्ट क्रिस्प्र प्लाज्मिड और डीएनए टुकड़ा लक्ष्य को संशोधित करने के लिए उपयोग किया जाता है परजीवी में सह-ट्रांसफ़ेक्ट होता है। यदि लक्ष्य को संशोधित करने के लिए इस्तेमाल किए जाने वाले डीएनए टुकड़ा में लक्ष्यिक बिंदुओं के मुताबिक़ अनुक्रम होते हैं, तो मुताबिक़ पुनर्संयोजन का इस्तेमाल सीआरआईएसपीआर / कास 9 द्वारा शुरू की गई डीएसबी की मरम्मत के लिए किया जा सकता है ताकि लक्ष्य को सटीक संशोधित किया जा सके। दूसरी ओर, यदि intप्रजनित डीएनए टुकड़ा में मुताबिक़ अनुक्रम शामिल नहीं है, फिर भी यह CRISPR / Cas9 लक्ष्यीकरण साइट में एकीकृत किया जा सकता है। बाद का चयन अक्सर चयनकर्ता मार्करों को सम्मिलित करके या स्थानीय में उत्परिवर्तकों को भरने के लिए जीन को बाधित करने के लिए किया जाता है जो नकारात्मक चयन 13 की अनुमति देता है। यहां एसएनआर 1 स्थान एक उदाहरण के रूप में कार्य करता है कि सीआरआईएसपीआर / सीएस 9 का उपयोग जीन के व्यवधान के लिए और ट्रांसजेनिक परजीवी जनरेशन के लिए कैसे किया जा सकता है।
ये प्रोटोकॉल कई तरीकों से पेश करते हैं, जब संयुक्त रूप से टी। गोंडी में ड्रग प्रतिरोधी जीन की पहचान के लिए अनुमति देते हैं। दो विशेष रूप से परियोजना के अभिन्न अंग हैं, QTL मानचित्रण की अपेक्षाकृत अनुभवी पद्धति और सीआरआईएसपीआर / कैस 9 जीन संपादन की हाल ही में विकसित विधि। लैंडर और बोटस्टीन ने अपने प्रभावशाली पत्र को 1989 में प्रकाशित किया था जिसमें क्यूएलएल मैपिंग का प्रदर्शन किया गया था जो आनुवंशिक लोकी के साथ फेनोटाइप 36 के साथ जुड़ा हुआ था। 2012 में हाल ही में, दांडा और चार्पेन्टेयर ने स्ट्रिपोकोकस प्यूजेंस में क्रिस्टीप / कैस 9 संपादन प्रणाली को वर्णित किया 22 जो कि टी गौंडी 13 , 17 सहित कई अलग-अलग मॉडलों में जल्दी आनुवंशिक उपकरण के रूप में अनुकूलित किया गया था। दोनों तरीकों यहाँ उपयोगी थे, जहां QTL मैपिंग ने ड्रग प्रतिरोधी उत्परिवर्तन युक्त उस स्थान को परिभाषित किया जिसे अंततः डब्ल्यूजीएस आधारित एसएनपी पहचान का उपयोग करने की पहचान की गई थी, और सीआरआईएसपी / सीएस 9 संपादन ने मुझे प्रदान किया एसएनआर 1 की पुष्टि करने के लिए ans sinefungin दवा प्रतिरोध जीन है।
एमई 4 9-एफयूडीआर आर एक्स वैंड-एसएनएफ आर क्रॉस 8 को मूल रूप से एक विषाणु फेनोटाइप 1 9 से पूछताछ करने के लिए विकसित किया गया था, लेकिन अभिभावकीय तनाव भी एक अतिरिक्त फेनोटाइपिक अंतर होता है जिसके लिए कारण जीन ज्ञात नहीं था, वैंड माता-पिता में साइनइनफिनिन प्रतिरोध। इससे पार के एक लाभ पर प्रकाश डाला गया है, जब माता-पिता में अतिरिक्त फेनोटाइपिक मतभेद मनाए जाते हैं तब उनका पुनर्मुद्रण किया जा सकता है। यह एक और टोक्सोप्लाज्मा क्रॉस के लिए मामला था, प्रकार 2 एक्स 3 टाइप करें, जहां अनेक जीन कई फीनोटाइप्स 37 , 38 , 39 , 40 मानचित्रण के द्वारा पाया गया। तिथि करने के लिए, चार अलग-अलग टी। गोंडी पार को वर्णित किया गया है और फेनोटाइप के लिए जिम्मेदार जीन को मैप करने के लिए उपयोग किया गया हैएसएस = "एक्सएएफ"> 8 , 37 , 41 , 42 , जिनमें से सभी के पास नए फ़िनोटीप्स को मैप करने का पुन: उपयोग करने की क्षमता है जिसके लिए आनुवांशिक आधार अज्ञात है। इन पंक्तियों के साथ, ज्ञात वैश्विक आनुवांशिक विविधता का प्रतिनिधित्व करते हुए 62 टी। गोंडी उपभेदों के लिए जीनोम क्रमश: 43 से क्रमबद्ध हैं। इस पुल से नई क्रॉस को ऐसे तनावों के लिए बनाया जा सकता है जो दिलचस्प फ़िनोटीप्स में भिन्न हैं। क्यू एल एल मैपिंग के फायदों का विस्तार करने के बाद, यह कहा जाना चाहिए कि क्रॉस पैदा करना एक लघु उपक्रम नहीं है वहाँ अन्य तरीकों का इस्तेमाल किया जा सकता है जो कारण जीन की पहचान करने के लिए किया जा सकता है। एक शक्तिशाली तकनीक म्यूटेंट बनाने के लिए रासायनिक mutagenesis का उपयोग करता है जिसे फ़िनोटाइप्स के लिए दिखाया जा सकता है। कारण जीन को खोजने के लिए, म्यूटेंट या तो कॉस्ममिड लाइब्रेरीज़ 44 या जेनोम शोधक तरीके से पूरक हो सकते हैं, कारण उत्परिवर्तन 45 को खोजने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। मो के लिएफिर से, कोलमेन एट अल द्वारा दो जॉव लेख देखें और वाल्विन एट अल इन तरीकों की रूपरेखा 46 , 47
कारण एसएनएफ आर उत्परिवर्तन (प्रोटोकॉल 2 और 3) की पहचान करने के लिए कई कदम ऐसे सॉफ्टवेयर के साथ आयोजित कम्प्यूटेशनल विधियों पर भरोसा करते हैं जो शैक्षणिक उपयोग के लिए स्वतंत्र रूप से उपलब्ध है। प्रत्येक चरण के लिए विस्तृत आदेश प्रदान किए जाते हैं और जब उचित फाइलों के साथ चलते हैं तो उपयोगकर्ता को एसएएनएफ एसएनपी कारण खोजने के लिए आवश्यक डेटासेट को फिर से बनाने की अनुमति होगी। ध्यान रखें कि आदेशों में से कुछ सिंटैक्स फ़ाइल नाम या निर्देशिका संरचना ($ PATH) को संदर्भित करता है जिसे उपयोगकर्ता वरीयता में संशोधित किया जा सकता है। यद्यपि यहां दिए गए आदेश निश्चित रूप से क्वालिटी विश्लेषण और डब्ल्यूजीएस आधारित एसएनपी पहचान के साथ क्रॉस का विश्लेषण करने के तरीकों को नहीं निकालेगा, लेकिन वे इस आलेख में वर्णित प्रयोग को दोहराने के लिए पर्याप्त हैं और यूजर को एम कैसे इन तरीकों से कदम फैशन के एक कदम में उपयोग किया जाता है के साथ परिचित अयस्क
यद्यपि QTL मैपिंग और डब्ल्यूजीएस अनुक्रम आधारित एसएनपी पहचान एक उम्मीदवार एसएनएफ आर जीन की पहचान के लिए पर्याप्त थे, लेकिन ड्रग प्रतिरोध में इसकी भूमिका की पुष्टि के लिए अतिरिक्त प्रयोगों की आवश्यकता है। यह स्पष्ट रूप से जीन व्यवधान या पीटकर तकनीक के माध्यम से दिखाया जा सकता है, जिनमें से दोनों सीआरआईएसपीआर / कास 9 जीन एडिटिंग का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है। सीआरआईएसपीआर / सीएस 9 का प्रयोग करने के लिए विस्तृत तरीके से इंडल म्यूटेशन बनाने या ट्रांसजेनिक संरचनाएं टी। गोंडी में लक्ष्य जीन में डाली जाती हैं। लक्ष्यीकरण विशिष्टता जो सीआरआईएसपीआर / सीएस 9 प्रदान करता है पारंपरिक तरीकों से जीन संपादन की दक्षता को बढ़ाती है। साथ ही, इसने कुशलता से बढ़कर जेनेटिक अध्ययन के लिए गैर-प्रयोगशाला अनुकूलित तनाव का उपयोग करना संभव बना दिया है जो कि पहले 13 को संशोधित करना मुश्किल था। भले ही अपनी प्रारंभिक अवस्था में, सीआरआईएसपीआर / कैस 9 पहले से ही जीन बाधाओं को बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा चुका हैटीज गोंडी में जीन नॉकआउट 16 , 1 9 , 50 , 51 , 52 , 53 , 54 बनाने के लिए, एक उपयोगी उपकरण बनने का वादा करने के लिए, 2 , 13 , 17 , 18 , 48 , 49 , टैग जीन 17 भविष्य में कई अन्य अध्ययनों के लिए
खोज कि एसएनआर 1 निष्क्रियता से साइनफ़िंगिन प्रतिरोध की ओर जाता है एसएनआर 1 स्थलीय ट्रांसजेन प्रविष्टि या आनुवंशिक पूरक के लिए एक होनहार साइट बनाता है। एसआरआईआर 1 स्थान में ट्रांसजीने के एकीकरण को निर्देशित करने के लिए सीआरआईएसपीआर / सीएस 9 मध्यस्थता वाले जीन का उपयोग करने की सफलता को अधिकतम करने के लिए निम्नलिखित पहलुओं का ध्यान रखना चाहिएप्रायोगिक डिजाइन के दौरान लाल। सबसे पहले, एक चयन मार्कर को तनाव निर्माण की दक्षता बढ़ाने के लिए ट्रांसजेनिक निर्माण में शामिल करने की सिफारिश की गई है। अगर कोई चयन मार्कर शामिल है, तो दोनों सकारात्मक और नकारात्मक चयन का उपयोग किया जा सकता है, जिसके परिणामस्वरूप दोगुनी चयनित परजीवी के 100% एसएनआर 1 लोकस पर GOI एकीकृत के साथ ट्रांसजेनिक होने का परिणाम है। इसके विपरीत, यदि ट्रांसजेनिक निर्माण में अतिरिक्त चयन योग्य लक्षण नहीं होते हैं और एसएनआर 1 लोकस पर नकारात्मक चयन पर निर्भर करते हैं, सफल ट्रांसजेनेसिस की दक्षता सीआरआईएसपीआर प्लाज्मिड और ट्रांसजेनिक संरचना के कोर्टरिसेंसिविटी की दक्षता पर निर्भर करती है।
दूसरा, हालांकि सीआरआईएसपीआर / कैस 9 मध्यस्थता वाले साइट-विशिष्ट एकीकरण गैर-मुताबिक डीएनए टुकड़ा का उपयोग अक्सर पूरक और ट्रांसजेनेसिस के लिए किया जाता है, लेकिन यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि इन मामलों में प्रविष्टि की गारंटी नहीं दी जा सकती है क्योंकि दिशा संभव है। यह समस्या पैदा हो सकती हैकुछ अनुप्रयोगों के लिए एमएस उदाहरण के लिए, अलग-अलग जीन एलील्स के साथ उत्परिवर्तक के पूरक के लिए, यह सुनिश्चित करना मुश्किल है कि सभी alleles उसी अभिविन्यास में डाली जाती हैं, और ओरिएंटेशन में अंतर अभिव्यक्ति अंतर पैदा कर सकता है। इस प्रकार के आवेदन के लिए, डीएनए एसएनआर 1 लोकस के अनुरुप अनुक्रमों के साथ तैयार करता है, जो उचित एकीकरण अभिविन्यास ( चित्रा 6 ) को चलाएगा ।
तीसरा, अभिकर्मक के दौरान, क्रिस्प्र प्लाज्मिड और ट्रांसजेनिक डीएनए अणु के बीच का अनुपात सफल ट्रांसजेनिक तनाव निर्माण के लिए महत्वपूर्ण है। चयन रणनीतियों के अनुसार इस अनुपात को समायोजित करने की आवश्यकता है। निम्नलिखित दिशानिर्देशों की सिफारिश की जाती है: 1) यदि ट्रांसजेनिक निर्माण में एक दवा प्रतिरोधी मार्कर होता है और इसी दवा ट्रांसजेनिक परजीवी उत्पन्न करने के लिए केवल एकमात्र चयन होती है, अर्थात् sinefungin का प्रयोग नहीं किया जाता है, ट्रांसजेनिक निर्माण और सीआरआईएसपीआर प्लाज़म के बीच सुझाए गए दाढ़ अनुपातआईडी 1: 5 है इस मामले में अधिक क्रिस्प्र प्लाज्मिड का प्रयोग संभवतः ट्रांसजेनिक निर्माण प्राप्त परजीवीओं को भी सीआरआईएसपीआर प्लाज्मिड प्राप्त होगा, इसलिए दवा प्रतिरोधी परजीवी को सीआरआईएसपीआर लक्ष्यीकरण साइट पर मार्कर डालने की अधिक संभावना है। यदि अनुपात उलट हो जाता है, ट्रांसजेनिक निर्माण प्राप्त करने वाले अधिकांश परजीवी को सीआरआईएसपीआर प्लाज्मिड नहीं मिलेगा। नतीजतन, दवा प्रतिरोधी परजीवी के विशाल बहुमत, सीआरआईएसपीआर / सीएएस 9 मध्यस्थता वाले साइट-विशिष्ट सम्मिलन से जुड़े नहीं होने वाले यादृच्छिक एकीकरण के माध्यम से ट्रांसजेनिक निर्माण प्राप्त करते हैं। 2) ट्रांसजेनिक निर्माण में एक दवा प्रतिरोधी मार्कर होता है और ट्रांस्जेनिक परजीवी का चयन करने के लिए इसी दवा का इस्तेमाल साइनइनफिनिन के साथ किया जाता है, ट्रांसजेनिक निर्माण और सीआरआईएसपीआर प्लाज्मिड के बीच सुझाए गए दाढ़ अनुपात 1: 1 है। यह रणनीति ट्रांसजेनिक तनाव निर्माण की उच्च दक्षता प्रदान करती है। 3) यदि ट्रांसजेनिक निर्माण में कोई चयन निर्माता शामिल नहीं है, तो नकारात्मक चयन पर निर्भरट्रांसजेनिक परजीवी प्राप्त करने के लिए अकेले साइनफिंगिन द्वारा, ट्रांसजेनिक निर्माण और सीआरएसपीआर प्लाज्मिड के बीच सुझाए गए दाढ़ अनुपात 5: 1 है। इस डिजाइन के लिए तर्क ऊपर के पहले दिशानिर्देश के समान है। चूंकि प्रोटोकॉल 5 में चयन के लिए दोनों पाइरीमेथामाइन और साइनफ़ागिन का उपयोग किया गया था, डीआरएचआरआर * मिनी जीन और एसआरआईआर 1 के बीच का अनुपात सीआरआईएसपीआर प्लाज्मिड को 1: 1 के रूप में निर्धारित किया गया था।
एक साथ उठाए गए तरीके, यहां दिए गए तरीकों पर एक विस्तृत विवरण दिया गया है जो मूल प्रकाशन में व्यक्त करना संभव नहीं था जो कि एसएनआर 1 2 की पहचान करता है ये प्रोटोकॉल; विशेष रूप से, कमांड लाइन सिंटैक्स, उपयोग किए जाने वाले कार्यक्रमों का अनुक्रमिक लेआउट, और क्रिस्पीआर / कास 9 के इस्तेमाल से फ़िनोटीप्स के लिए जिम्मेदार नए जीनों की पहचान करने के लिए भविष्य के प्रयासों को सहायता करनी चाहिए।
The authors have nothing to disclose.
हम एल। डेविड सिबली और असीस खान को मूल प्रकाशन में उनके योगदान के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं, जिस पर ये प्रोटोकॉल आधारित हैं। यह काम नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ ग्रांट AI108721 द्वारा वित्त पोषित किया गया था।
T25 flasks | Corning | 430639 | |
HFF | ATCC | SCRC-1041 | |
T. gondii ME49 strain | ATCC | 50840 | |
T. gondii VAND strain | ATCC | PRA-344 | |
DMEM (No Sodium Bicarbonate) | Life Sciences | 12800017 | |
Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | |
HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
Fetal Bovine Serum Premium Grade | VWR International | 97068-085 | |
L-Glutamine 200mM | Sigma Aldrich | G7513 | |
Gentamicin (10 mg/mL) | Life Technologies | 15710064 | |
Cell Scraper for Flasks | VWR International | 10062-904 | |
Syringe 10ml | BD | 309604 | |
Blunt needles 22g x 1" | BRICO Products | BN2210 | |
Nuclepore Filter 3.0 µm, 25mm | GE Healthcare | 110612 | |
Swin-Lok Filter Holder 25mm | GE Healthcare | 420200 | |
Hemacytometer | Propper MFG | 90001 | |
Sinefungin | Enzo Life Sciences | 380-070-M001 | |
R | The R Foundation | https://www.r-project.org/ | |
J/qtl | The Churchill Group | http://churchill.jax.org/software/jqtl.shtml | |
Bowtie2 | John Hopkins University | http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml | |
NCBI SRA Toolkit | NCBI | http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra/?view=toolkit_doc | |
SAMtools | Wellcome Trust Sanger Institute | http://www.htslib.org/ | |
VarScan | Washington University, St Louis | http://varscan.sourceforge.net/ | |
MUMmer | JCVI & Univ Hamburg | http://mummer.sourceforge.net/ | |
pSAG1::CAS9-U6::sgUPRT | Addgene | Plasmid #54467 | T. gondii CRISPR plasmid to cut the UPRT gene |
pSAG1::CAS9-U6::sg290860-6 | Addgene | Plasmid #59855 | T. gondii CRISPR plasmid to cut the TG*_290860 SNR1 gene |
pUPRT::DHFR-D | Addgene | Plasmid #58528 | Template for DHFR* mini gene |
Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit | New England Biolabs | E0552S | |
QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27106 | |
NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000 | |
LB Broth | Fisher Scientific | DF0446-07-5 | |
Potassium chloride | Sigma Aldrich | P9541 | |
Calcium chloride | Sigma Aldrich | 746495 | |
Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P9791 | |
Potassium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | P5504 | |
EDTA | Sigma Aldrich | E5134 | |
Magnesium chloride | Sigma Aldrich | M1028 | |
Adenosine triposhpate (ATP) | Sigma Aldrich | A6419 | |
L-glutathione (GSH) | Sigma Aldrich | G4251 | |
ECM 830 Electroporation System | BTX | 45-0002 | |
Electroporation Cuvette 4 mm | Harvard Apparatus | 45-0126 | |
Crytal Violet | Alfa Aesar | B21932-14 | |
6-well TC plate | Corning | 353046 | |
24-well TC plate | Corning | 353935 | |
Cover glass 12mm round | VWR International | 89015-724 | |
96-well TC plate | Corning | 353075 | |
Gibson Assembly Cloning Kit (Multi-fragment) | New England Biolabs | E5510S | |
Q5 High-Fidelity Polymerase | New England Biolabs | M0491S | |
Pyrimethamine | TCI AMERICA | P2037-1G | Use cuation when using pyrimethamine resistant parasites – see Protocol |