Detaljer presenteres om hvordan QTL-kartlegging med et helt genom-sekvensbasert genetisk kart kan brukes til å identifisere et stoffresistensgen i Toxoplasma gondii og hvordan dette kan verifiseres med CRISPR / Cas9-systemet som effektivt redigerer et genomisk mål, i dette tilfellet Stoffresistensgen.
Vitenskapelig kunnskap er iboende knyttet til tilgjengelige teknologier og metoder. Denne artikkelen vil presentere to metoder som tillates for identifisering og verifikasjon av et stoffresistensgen i Apicomplexan parasitt Toxoplasma gondii , metoden for kvantitativ karakteristikk (QTL) kartlegging ved hjelp av et generisk genetisk kart med hele genome (WGS) og metoden Av Clustered regelmessig interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) / Cas9-basert gen redigering. Tilnærming av QTL kartlegging tillater en å teste om det er en sammenheng mellom en genomisk region (er) og en fenotype. To datasett kreves for å kjøre en QTL-skanning, et genetisk kart basert på avkom av et rekombinant kryss og en kvantifiserbar fenotype vurdert i hvert av avkom fra det krysset. Disse datasettene formateres deretter for å være kompatible med R / qtl-programvare som genererer en QTL-skanning for å identifisere signifikante loci korrelert med fenotypen. Selv om dette i stor grad kan begrense søket wIndkomst av mulige kandidater, QTLs span regioner som inneholder en rekke gener som kausale genet må identifiseres for. Å ha WGS av avkom var kritisk for å identifisere årsaksmessig resistensmutasjon på gennivå. Når identifisert, kan kandidatmutasjonen verifiseres ved genetisk manipulering av narkotikafølsomme parasitter. Den mest enkle og effektive metoden for å genetisk modifisere T. gondii er CRISPR / Cas9-systemet. Dette systemet består av bare 2 komponenter som begge er kodet på et enkelt plasmid, en enkelt guide RNA (gRNA) som inneholder en 20 bp sekvens komplementær til det genomiske mål og Cas9 endonukleasen som genererer en dobbeltstreng DNA-pause (DSB) ved målet, Reparasjon som tillater innføring eller sletting av sekvenser rundt pauseområdet. Denne artikkelen gir detaljerte protokoller for å bruke CRISPR / Cas9-baserte genomredigeringsverktøy for å verifisere genet som er ansvarlig for sinfunginresistens og å konstruere transgene parasitter.
Vertsområde bestemmer omfanget av parasittenes prevalens. Noen parasitter har svært spesifikke vertsbehov som begrenser området de er funnet fra, andre er generalister. En slik generalist er Toxoplasma gondii ( T. gondii) . Denne parasitten finnes over hele verden, da den kan smitte alle pattedyr og mange fugler. Mennesker er også utsatt, og det er anslått at omtrent 1/3 av den globale befolkningen har blitt smittet. Heldigvis styrer en robust immunrespons normalt parasittenes vekst, men i situasjoner der immunsystemet er kompromittert, kan parasitten vokse ukontrollert og forårsake sykdommer, ofte encefalisk. Også denne parasitten kan forårsake medfødte sykdommer hvis tidligere uinfiserte kvinner blir smittet under graviditet, da de mangler immunforsvar for raskt å begrense parasittets spredning. I tillegg er det en byrde av okulær toksoplasmose som kan resultere i synstap 1 . For disse reasoNs T. gondii har blitt et fokus for studiet, og på grunn av de mange molekylære metodene som er utviklet for studien, en modell for Apicomplexan-parasitter. To metoder som vil bli diskutert her, er kvantitativ karakteristikk (QTL) kartlegging og klynget regelmessig interspaced kort palindromisk gjentakelse (CRISPR) / Cas9 genredigering. QTL kartlegging og CRISPR / Cas9 redigering er henholdsvis frem og tilbake genetiske tilnærminger som har blitt brukt i tidligere studier for å identifisere og / eller karakterisere T. gondii virulensgener. Her kombineres disse metodene for å identifisere og bekrefte funksjonen til et SNFr-gen, TgME49_290860, og dets orthologer (merket som SNR1 ) 2 .
Selv om T. gondii kan infisere et bredt spekter av mellomliggende verter, må det passere gjennom og infisere de tarmepitelceller av et felid for å fullføre livssyklusen. Katter er de endelige vertene av parasitten der sExual stadier blir produsert og genetisk rekombination via meiose forekommer. For å utføre en QTL-studie må man skape et genetisk kryss, og i tilfelle toxoplasma betyr dette at man passerer to forskjellige parasittstammer som avviger i en fenotypisk egenskap, foreldreflettene, gjennom en katt for å produsere rekombinant avkom 3 . Før de blir matet til katter, blir foreldreskjemaene resistente mot separate stoffer for å muliggjøre mer effektiv identifikasjon av rekombinanter ved dobbeltmedisinvalg av avkom 4 . Tre legemidler har blitt brukt i T. gondii for dette formålet; Fluorodeoxyribose (FUDR) for hvilken uracilfosforibosyltransferase ( UPRT ) er resistensgenet 5 , adenosin arabinosid (ARA) for hvilket Adenosin Kinase ( AK ) er resistensgenet 6 og sinusfungin (SNF) for hvilket resistensgenet var ukjent 7 . Flere genetiske kryss har værtOpprettet for T. gondii , men bare de 24 avkomene fra ME49-FUDR r X VAND-SNF r- krysset ble genotypet ved bruk av fullgenomsekvensering (WGS) 8 . Dette åpnet muligheten for kartlegging og identifisering av SNF-resistensgenet ved bruk av dette krysset idet VAND-forelder ble gjort resistent ved kjemisk mutagenese av den medikamentfølsomme VAND (VAND-SNF s ) -stammen, og VAND-referansegenomet ble sekventert ved bruk av VAND- SNF s- stamme, slik at det muliggjør identifisering av alle polymorfismer mellom avkommet WGS og VAND-SNFs referansegenomet, inkludert den arvelige foreldre VAND-SNF r- mutasjonen som gjorde noe av avkommet resistent mot avkom.
For å identifisere den kausale enkelt nukleotidpolymorfisme (SNP) i SNF r- avkomen, kan flere beregningsbaserte åpen kilde-ressurser brukes til å analysere dataene. Å opprette det genetiske kartet for ME49-FUDR r X VAND-SNF r krysse REDHORSE programvarepakke 9 ble utviklet som bruker WGS-tilpasninger av foreldrene og avkom til nøyaktig å detektere de genetiske posisjonene i genetiske kryssinger. Denne kartleggingsinformasjonen kan deretter kombineres med fenotypiske data (SNF r i avkommet) for å formatere et datasett som er kompatibelt med "qtl" -pakken 10 i R statistisk programmeringsprogramvare der en QTL-skanning kan kjøres for å avsløre signifikant lokalisering korrelert med fenotype. For å identifisere kausal SNP som befinner seg innenfor QTL-locuset, kan WGS-lesene av avkommet tilpasses individuelt til det senfungin-følsomme VAND-genomet ved hjelp av Bowtie 2-justeringsprogrammet 11 hvorfra SNP-er kan bli kalt ved hjelp av VarScan mpileup2snp-variantoppringerprogrammet 12 . Ved hjelp av disse SNPene kan QTL-locuset skannes for polymorfier som er tilstede i SNF r, men ikkeI SNFs avkom. Med det kausal SNP som er identifisert i det kodende område av et gen, kan genetisk modifisering av kandidat SNF r- genet utføres i en SNFs-stamme for å verifisere stoffresistensfunksjonen.
CRISPR / Cas9 genometredigeringssystemet ble nylig etablert i Toxoplasma 13 , som ga viktige verktøy for utforskning av den komplekse biologien til denne parasitten, spesielt for genetiske studier i ikke-laboratorie-tilpassede stammer. På grunn av den høyaktive ikke-homologe sluttforbindelsesaktiviteten (NHEJ) i WT Toxoplasma- celler, er målrettet genommodifikasjon vanskelig å oppnå, da eksogent innført DNA er tilfeldig integrert i genomet ved ekstremt høy frekvens 14 . For å øke suksessraten for lokusspesifikk modifikasjon, har forskjellige tilnærminger blitt anvendt for å øke effektiviteten av homolog rekombination og / eller redusere thE NHEJ aktivitet 15 , 16 . En av disse tilnærmingene er CRISPR / Cas9-systemet. Sammenlignet med andre metoder, er CRISPR / Cas9-systemet effektivt for å introdusere områdespesifikke modifikasjoner og er lett å designe 13 , 17 , 18 . I tillegg kan den brukes i hvilken som helst Toxoplasma- stamme uten ekstra modifikasjon til parasitten 13 , 19 .
CRISPR / Cas9-systemet stammer fra det adaptive immunsystemet til Streptococcus pyogenes , som bruker det til å forsvare invasjonen av mobile genetiske elementer som fagene 20 , 21 , 22 . Dette systemet benytter det RNA-guidede DNA-endonuklease-enzymet Cas9 for å introdusere dobbeltstrenget DNA-pause (DSB) inn i målet, som deretter repaEnten av den feilkrevne NHEJ for å inaktivere målgener gjennom korte indelmutasjoner, eller ved homologi-rettet rekombinasjon for å endre mållokalet nøyaktig som utformet 23 , 24 . Målspecifikiteten bestemmes av et lite RNA-molekyl som heter single guide RNA (gRNA), som inneholder en individuelt utformet 20 nt-sekvens som har 100% homologi til mål-DNA 22 . GRNA-molekylet inneholder også signaturer anerkjent av Cas9 som styrer nukleasen til målområdet, som inkluderer en spesiell Protospacer tilstøtende motiv (PAM, sekvens er 'NGG') 25 , 26 . Derfor arbeider gRNA-molekylet og PAM-sekvensen sammen for å bestemme Cas9-spaltningsstedet i genomet. Man kan enkelt endre gRNA-sekvensen for å målrette forskjellige steder for spaltning.
Når CRISPR / Cas9-systemet ble utviklet først i ToxopLasma, ble et enkelt plasmid som uttrykker Cas9-nukleasen og gRNA-molekylet brukt til å introdusere DSB på målingsstedet 13 , 17 . Det har blitt vist at CRISPR / Cas9-systemet drastisk øker effektiviteten av stedsspesifikke genommodifikasjon, ikke bare ved homolog rekombination, men også ikke-homolog integrering av eksogent DNA 13 . Det gjør dette i wildtype-stammer som inneholder NHEJ-aktivitet. Derfor kan dette systemet brukes i vesentlig hvilken som helst Toxoplasma- stamme for effektiv genomredigering. I et typisk eksperiment blir det mål-spesifikke CRISPR-plasmidet og DNA-fragmentet som brukes til å modifisere målet, transfektert inn i parasitter. Hvis DNA-fragmentet som brukes til å modifisere målet inneholder homologe sekvenser til mållokalet, kan homolog rekombination brukes til å reparere DSB introdusert av CRISPR / Cas9 for å tillate presis modifikasjon av målet. På den annen side, hvis intDNA-fragmentet ikke inneholder homolog sekvens, det kan fortsatt integreres i CRISPR / Cas9-målrettingsstedet. Sistnevnte brukes ofte til å forstyrre gener ved å sette inn selekterbare markører eller komplementere mutanter på steder som tillater negativt valg 13 . Her fungerer SNR1- locus som et eksempel for å vise hvordan CRISPR / Cas9 kan brukes til genforstyrrelser og generering av transgene parasitter.
Disse protokollene presenterer flere metoder som, når de kombineres, tillater identifisering av et medikamentresistensgen i T. gondii . To spesielt var integrert i prosjektet, den relativt erfarne metoden for QTL-kartlegging og den nylig utviklede metoden for CRISPR / Cas9-genredigering. Lander og Botstein publiserte sitt innflytelsesrike papir i 1989 og demonstrerte QTL-kartlegging som korrelerer genetiske loci med fenotyper 36 . Mer nylig i 2012 beskrev Dounda og Charpentier CRISPR / Cas9-redigeringssystemet i Streptococcus pyogenes 22 som raskt ble tilpasset som et genetisk verktøy i mange forskjellige modeller, inkludert T. gondii 13 , 17 . Begge metodene var nyttige her, hvor QTL-kartlegging definerte lokusen som inneholdt stoffresistansmutasjonen som i siste instans ble identifisert ved hjelp av WGS-basert SNP-deteksjon, og CRISPR / Cas9-redigering ga meg Ans for å bekrefte SNR1 er det senfungin narkotika resistensgenet.
ME49-FUDR r X VAND-SNF r- krysset 8 ble opprinnelig utviklet for å forhøre en virulensfenotype 19 , men foreldrenes stammer skjedde også å ha en ytterligere fenotypisk forskjell som ikke var kjent for årsakssystemet, sinusfeltresistens i VAND-foreldrene. Dette fremhever en fordel med kryss ved at de kan bli repurposed når flere fenotypiske forskjeller i foreldrene blir observert. Dette var tilfellet for et annet toxoplasma- kryss, type 2 x type 3, hvor flere gener involvert i virulens ble funnet ved å kartlegge flere fenotyper 37 , 38 , 39 , 40 . Hittil har fire forskjellige T. gondii kryss blitt beskrevet og brukt til å kartlegge gener som er ansvarlige for fenotyperSs = "xref"> 8 , 37 , 41 , 42 , som alle har potensial til å bli gjenbrukt for å kartlegge nye fenotyper som det genetiske grunnlaget er ukjent for. Langs disse linjene er genomene for 62 T. gondii- stammer som representerer det kjente globale genetiske mangfoldet blitt sekvensert 43 . Nye kryss kan gjøres fra dette bassenget for stammer som avviger i interessante fenotyper. Etter å ha forvirret fordelene ved QTL-kartlegging, må det sies at generering av et kryss er ikke et mindre foretak. Det finnes andre metoder som kan brukes til å identifisere årsaksgener. En kraftig teknikk bruker kjemisk mutagenese til å skape mutanter som kan screenes for fenotyper. For å finne årsaksgenet kan mutanter enten komplementeres med kosmidbiblioteker 44 eller genomsekventeringsmetoder kan brukes til å finne årsaksmutasjonen 45 . For moSe på to JoVE-artikler av Coleman et al. Og Walwyn et al. Som skisserer disse tilnærmingene 46 , 47 .
Mange av trinnene som fører til identifisering av årsakssammenheng SNF r mutasjon (Protokoll 2 og 3) stammer fra beregningsmetoder utført med programvare som er fritt tilgjengelig for akademisk bruk. Detaljert kommandoer for hvert trinn er gitt, og når du kjører med de riktige filene, kan brukeren gjenskape datasettene som er nødvendige for å finne årsakssammenheng SNF r SNP. Husk at noen av syntaksene i kommandoene refererer til filnavn eller katalogstruktur ($ PATH) som kan endres til brukerens preferanse. Selv om kommandoene som er gitt her, absolutt ikke utmater måtene man kan analysere et kryss med QTL-analyse og WGS-basert SNP-identifikasjon, er de omfattende nok til å gjenta eksperimentet beskrevet i denne artikkelen, og skal tillate brukeren å bli m Malm kjent med hvordan disse tilnærmingene benyttes i en trinnvis måte.
Selv om QTL-kartlegging og WGS-sekvensbasert SNP-deteksjon var tilstrekkelig til å identifisere et kandidat SNF- r- gen, er det nødvendig med ytterligere eksperimenter for å bekrefte sin rolle i stoffresistens. Dette kan overbevisende vises ved genforstyrrelser eller knockout-teknikker, som begge kan oppnås ved hjelp av CRISPR / Cas9-genredigering. Detaljert metoder for bruk av CRISPR / Cas9 for å enten generere indelmutasjoner eller sette inn transgene konstruksjoner i et målgen i T. gondii er gitt. Den målrettede spesifisiteten som CRISPR / Cas9 gir, øker effektiviteten av genredigering over tradisjonelle metoder. Også denne økningen har effektivt gjort det mulig å bruke ikke-laboratorie-tilpassede stammer for genetiske studier som tidligere var vanskelige å modifisere 13 . Selv om CRISPR / Cas9 i sin barndom allerede har blitt brukt til å gjøre genforstyrrelserLass = "xref"> 2 , 13 , 17 , 18 , 48 , 49 , merk gener 17 , og lag genuttrykk 16 , 19 , 50 , 51 , 52 , 53 , 54 i T. gondii , lovende å være et nyttig verktøy For mange andre studier i fremtiden.
Oppdagelsen av at SNR1- inaktivering fører til sinusfungende motstand, gjør SNR1- locuset et lovende sted for transgeninnføring eller genetisk komplementering. For å maksimere suksessen med å bruke CRISPR / Cas9-mediert genmålretting for å lede integrasjonen av transgen til SNR1- lokalet, bør følgende aspekter være viktigeRødt under eksperimentell design. Først anbefales en markeringsmarkør å bli inkludert i den transgene konstruksjonen for å øke effektiviteten av belastningskonstruksjon. Hvis en markeringsmarkør er inkludert, kan både positivt og negativt utvalg brukes, noe som resulterer i at nesten 100% av de dobbeltvalgte parasittene er transgene med GOI integrert på SNR1- locus. I motsetning dersom effekten av vellykket transgenese i stor grad avhenger av effektiviteten av cotransfeksjonen av CRISPR-plasmidet og den transgene konstruksjon, hvis den transgene konstruksjon ikke inneholder flere selekterbare egenskaper og avhenger av negativt utvalg på SNR1- locuset.
For det andre, selv om CRISPR / Cas9-mediert stedsspesifikk integrasjon av et ikke-homologt DNA-fragment ofte brukes for komplementering og transgenese, bør det bemerkes at orienteringen av innsetting ikke kan garanteres i slike tilfeller som begge retninger er mulige. Dette kan utgjøre problemerMs til noen applikasjoner. For eksempel, for å komplementere en mutant med forskjellige gen alleler, er det vanskelig å sikre at alle alleler er satt inn i samme orientering, og uoverensstemmelser i orientering kan forårsake uttrykksforskjeller. For denne typen søknad anbefales DNA-konstruksjoner med sekvenser som er homologe til SNR1- locuset, som vil drive riktig integrasjonsorientering ( figur 6 ).
For det tredje, under transfeksjonen, er forholdet mellom CRISPR-plasmidet og det transgene DNA-molekylet kritisk for vellykket transgenisk belastningskonstruksjon. Dette forholdet må justeres i henhold til utvalgsstrategiene. Følgende retningslinjer anbefales: 1) Hvis den transgene konstruksjonen inneholder en medikamentresistent markør og det tilsvarende legemidlet, er det eneste valget som brukes til å generere transgene parasitter, det vil si at senfungin ikke brukes, det foreslåtte molforholdet mellom den transgene konstruksjonen og CRISPR-plasmaetID er 1: 5. Ved å bruke mer CRISPR-plasmid i dette tilfellet øker sannsynligheten for at parasitter som mottar den transgene konstruksjonen også mottar CRISPR-plasmidet, derfor er det mer sannsynlig at stoffresistente parasitter har markøren satt inn på CRISPR-målingsstedet. Hvis forholdet er reversert, vil de fleste parasitter som mottar den transgene konstruksjonen ikke få CRISPR-plasmidet. Som et resultat oppnår det store flertallet av stoffresistente parasitter den transgene konstruksjonen gjennom tilfeldig integrasjon som ikke er forbundet med CRISPR / CAS9-mediert stedsspesifikk innføring. 2) Dersom den transgene konstruksjon inneholder en medikamentresistent markør og det tilsvarende legemiddel brukes sammen med sinfungin for å velge transgene parasitter, er det foreslåtte molforholdet mellom den transgene konstruksjon og CRISPR-plasmidet 1: 1. Denne strategien gir den høyeste effektiviteten av transgen belastning konstruksjon. 3) Hvis den transgene konstruksjonen ikke inneholder en valgbar produsent, stole på negativt valgVed sinfungin alene for å oppnå transgene parasitter, er det foreslåtte molforholdet mellom den transgene konstruksjon og CRISPR-plasmidet 5: 1. Begrunnelsen for denne utformingen er den samme som i den første retningslinjene ovenfor. Siden både pyrimethamin og sinfungin ble brukt til seleksjon i protokoll 5 ble forholdet mellom DHFR * mini-genet og SNR1- målretting-CRISPR-plasmidet satt til 1: 1.
Samlet sett har metodene som er skissert her detaljnivå som ikke var mulig å formidle i den opprinnelige publikasjonen som identifiserte SNR1 2 . Disse protokollene; Spesielt bør kommandolinjens syntaks, sekventiell utforming av programmene som brukes, og bruken av CRISPR / Cas9 hjelpe fremtidige bestrebelser for å identifisere nye gener som er ansvarlige for fenotyper.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gjerne takke L. David Sibley og Asis Khan for deres bidrag til den opprinnelige publikasjonen som disse protokollene bygger på. Dette arbeidet ble finansiert av National Institutes of Health grant AI108721.
T25 flasks | Corning | 430639 | |
HFF | ATCC | SCRC-1041 | |
T. gondii ME49 strain | ATCC | 50840 | |
T. gondii VAND strain | ATCC | PRA-344 | |
DMEM (No Sodium Bicarbonate) | Life Sciences | 12800017 | |
Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | |
HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
Fetal Bovine Serum Premium Grade | VWR International | 97068-085 | |
L-Glutamine 200mM | Sigma Aldrich | G7513 | |
Gentamicin (10 mg/mL) | Life Technologies | 15710064 | |
Cell Scraper for Flasks | VWR International | 10062-904 | |
Syringe 10ml | BD | 309604 | |
Blunt needles 22g x 1" | BRICO Products | BN2210 | |
Nuclepore Filter 3.0 µm, 25mm | GE Healthcare | 110612 | |
Swin-Lok Filter Holder 25mm | GE Healthcare | 420200 | |
Hemacytometer | Propper MFG | 90001 | |
Sinefungin | Enzo Life Sciences | 380-070-M001 | |
R | The R Foundation | https://www.r-project.org/ | |
J/qtl | The Churchill Group | http://churchill.jax.org/software/jqtl.shtml | |
Bowtie2 | John Hopkins University | http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml | |
NCBI SRA Toolkit | NCBI | http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra/?view=toolkit_doc | |
SAMtools | Wellcome Trust Sanger Institute | http://www.htslib.org/ | |
VarScan | Washington University, St Louis | http://varscan.sourceforge.net/ | |
MUMmer | JCVI & Univ Hamburg | http://mummer.sourceforge.net/ | |
pSAG1::CAS9-U6::sgUPRT | Addgene | Plasmid #54467 | T. gondii CRISPR plasmid to cut the UPRT gene |
pSAG1::CAS9-U6::sg290860-6 | Addgene | Plasmid #59855 | T. gondii CRISPR plasmid to cut the TG*_290860 SNR1 gene |
pUPRT::DHFR-D | Addgene | Plasmid #58528 | Template for DHFR* mini gene |
Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit | New England Biolabs | E0552S | |
QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27106 | |
NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000 | |
LB Broth | Fisher Scientific | DF0446-07-5 | |
Potassium chloride | Sigma Aldrich | P9541 | |
Calcium chloride | Sigma Aldrich | 746495 | |
Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P9791 | |
Potassium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | P5504 | |
EDTA | Sigma Aldrich | E5134 | |
Magnesium chloride | Sigma Aldrich | M1028 | |
Adenosine triposhpate (ATP) | Sigma Aldrich | A6419 | |
L-glutathione (GSH) | Sigma Aldrich | G4251 | |
ECM 830 Electroporation System | BTX | 45-0002 | |
Electroporation Cuvette 4 mm | Harvard Apparatus | 45-0126 | |
Crytal Violet | Alfa Aesar | B21932-14 | |
6-well TC plate | Corning | 353046 | |
24-well TC plate | Corning | 353935 | |
Cover glass 12mm round | VWR International | 89015-724 | |
96-well TC plate | Corning | 353075 | |
Gibson Assembly Cloning Kit (Multi-fragment) | New England Biolabs | E5510S | |
Q5 High-Fidelity Polymerase | New England Biolabs | M0491S | |
Pyrimethamine | TCI AMERICA | P2037-1G | Use cuation when using pyrimethamine resistant parasites – see Protocol |