Detaljer presenteras om hur QTL-kartläggning med en genomsekvensbaserad genetisk karta kan användas för att identifiera en läkemedelsresistensgen i Toxoplasma gondii och hur detta kan verifieras med CRISPR / Cas9-systemet som effektivt redigerar ett genomiskt mål, i detta fall Drogresistensgen.
Vetenskaplig kunskap är i grunden kopplad till tillgänglig teknologi och metoder. Denna artikel kommer att presentera två metoder som möjliggör identifiering och verifiering av en läkemedelsresistensgen i Apicomplexan parasit toxoplasma gondii , metoden för kvantitativ trait lokalisering (QTL) kartläggning med användning av en genomsättningssekvens för hela genomsekvensen (WGS) och metoden Av klyvda regelbundet interspaced kort palindromisk repetition (CRISPR) / Cas9-baserad genredigering. Införandet av QTL-kartläggning gör att man kan testa om det finns en korrelation mellan en genomisk region och en fenotyp. Två dataset krävs för att köra en QTL-skanning, en genetisk karta baserad på avkommet från ett rekombinant kors och en kvantifierbar fenotyp som utvärderas i var och en av detta kors avkomma. Dessa dataset formateras sedan för att vara kompatibla med R / qtl-programvara som alstrar en QTL-skanning för att identifiera betydande loci korrelerade med fenotypen. Även om detta i hög grad kan begränsa sökningen wIndrag av möjliga kandidater, QTLs spannar regioner som innehåller ett antal gener, från vilka kausalgenen behöver identifieras. Att ha WGS av avkomman var kritisk för att identifiera orsaksmedelsresistensmutationen på gennivå. Efter identifiering kan kandidatmutationen verifieras genom genetisk manipulation av läkemedelskänsliga parasiter. Den mest enkla och effektiva metoden att genetiskt modifiera T. gondii är CRISPR / Cas9-systemet. Detta system bestod av bara 2 komponenter som båda kodades på en enda plasmid, en enda styr-RNA (gRNA) innehållande en 20 bp sekvens komplementär till det genomiska målet och Cas9-endonukleaset som genererar en dubbelsträngs DNA-paus (DSB) vid målet, Reparation av vilket möjliggör införande eller radering av sekvenser runt brytplatsen. Denna artikel innehåller detaljerade protokoll för att använda CRISPR / Cas9-baserade genomredigeringsverktyg för att verifiera genen som är ansvarig för sinfunginresistens och för att konstruera transgena parasiter.
Värdena bestämmer omfattningen av en parasiternas prevalens. Vissa parasiter har mycket specifika värdkrav som begränsar området från vilket de hittas, andra är generalister. En sådan generalist är Toxoplasma gondii ( T. gondii) . Denna parasit finns över hela världen eftersom den kan infektera alla däggdjur och många fåglar. Människor är också mottagliga och det uppskattas att ungefär 1/3 av den globala befolkningen har smittats. Lyckligtvis kontrollerar ett robust immunsvar normalt parasitens tillväxt, men i situationer där immunförsvaret äventyras kan parasiten växa okontrollerat och orsaka sjukdomar, ofta encefaliska. Även denna parasit kan orsaka medfödda sjukdomar om tidigare oinfekterade kvinnor smittas under graviditeten eftersom de saknar immunförsvar för att snabbt begränsa parasitens spridning. Dessutom finns det en börda av okulär toxoplasmos som kan leda till synförlust 1 . För dessa reasoNs T. gondii har blivit ett fokus för studier, och på grund av de många molekylära metoder som utvecklats för sin studie, en modell för Apicomplexan-parasiter. Två metoder som kommer att diskuteras här är kartläggning av kvantitativ egenskap lokalisering (QTL) och kluster regelbundet interspaced kort palindroma repetitioner (CRISPR) / Cas9 genredigering. QTL-kartläggning och CRISPR / Cas9-redigering är respektive fram- och bakåtgenetiska metoder som har använts i tidigare studier för att identifiera och / eller karakterisera T. gondii virulensgener. Här kombineras dessa metoder för att identifiera och bekräfta funktionen av en senfunginresistens (SNF r ) gen, TgME49_290860 och dess orthologer (antecknad som SNR1 ) 2 .
Fastän T. gondii kan infektera ett stort antal mellanliggande värdar, måste det passera och infektera tarmepitelceller från en felid för att slutföra livscykeln. Katter är de definitiva värdarna av parasiten där sExamma steg produceras och genetisk rekombination via meios uppstår. För att utföra en QTL-studie måste man skapa ett genetiskt kors, och i fallet med toxoplasma innebär det att man passerar två olika parasitstammar som skiljer sig åt i ett fenotypiskt drag, föräldrafläckarna, genom en katt för att producera rekombinant avkomma 3 . Före matning till katter är föräldrastammarna resistenta mot separata läkemedel för att möjliggöra effektivare identifiering av rekombinanter genom dubbelt läkemedelsval av avkomman 4 . Tre droger har använts i T. gondii för detta ändamål; Fluoroxibribos (FUDR) för vilken uracilfosforibosyltransferas ( UPRT ) är resistensgenen 5 , adenosin-arabinosid (ARA) för vilken adenosinkinas ( AK ) är resistensgenen 6 och sinfungin (SNF) för vilken resistensgenen var okänd 7 . Flera genetiska kors har varitSkapades för T. gondii , men endast 24 avkomma från ME49-FUDR r X VAND-SNF r- korset genotyperades genom användning av helt genom-sekvensering (WGS) 8 . Detta öppnade möjligheten att kartlägga och identifiera SNF-resistensgenen med användning av detta kors, eftersom VAND-föräldern blev gjort resistent mot kemisk mutagenes av den läkemedelskänsliga VAND (VAND-SNF s ) -stammen och VAND-referensgenomet sekvenserades med användning av VAND- SNF s- stammen vilket möjliggör identifiering av alla polymorfier mellan avkomman WGS och VAND-SNFs referensgenomet, inklusive den ärftliga föräldra VAND-SNF r- mutationen som gjorde några av de avkommande senfungin resistenta.
För att identifiera den kausal enkla nukleotidpolymorfismen (SNP) i SNF r- avkomman kan flera beräkningsbaserade open source-resurser användas för att analysera data. För att skapa den genetiska kartan för ME49-FUDR r X VAND-SNF r över REDHORSE programvarusupport 9 har utvecklats som använder WGS-anpassningar av föräldrarna och avkomman för att noggrant detektera genomiska positioner för genetiska övergångar. Denna kartläggningsinformation kan sedan kombineras med fenotypiska data (SNF r i avkomman) för att formatera en dataset som är kompatibel med "qtl" -paketet 10 i den statistiska programmeringsprogrammet R där en QTL-sökning kan köras för att avslöja betydande loci korrelerade med fenotyp. För att identifiera kausal SNP som befinner sig inom QTL-locuset kan WGS-läsarna av avkomman anpassas individuellt till det senfungin-känsliga VAND-genomet med användning av Bowtie 2-anpassningsprogrammet 11 från vilket SNP kan anropas med hjälp av VarScan mpileup2snp-variant-ringsprogrammet 12 . Med hjälp av dessa SNP kan QTL-locuset sedan skannas för polymorfier som är närvarande i SNF- r men inteI SNF: s avkomma. Med det kausal SNP som identifieras i den kodande regionen hos en gen kan genetisk modifiering av den sökande SNFr-genen utföras i en SNFs-stam för att verifiera läkemedelsresistansfunktionen.
CRISPR / Cas9 genometredigeringssystemet etablerades nyligen i Toxoplasma 13 , vilket gav viktiga verktyg för undersökning av den komplexa biologin hos denna parasit, särskilt för genetiska studier i icke-laboratorie anpassade stammar. På grund av den högaktiva aktiviteten för icke-homologa slutförbindelser (NHEJ) i WT- toxoplasma- celler är målmedelsmodifiering svår att uppnå, eftersom exogent infört DNA är slumpmässigt integrerat med genomet vid extremt hög frekvens 14 . För att öka framgångsgraden för lokalspecifik modifiering har olika metoder använts för att öka effektiviteten hos homolog rekombination och / eller minskaE NHEJ aktivitet 15 , 16 . Ett av dessa tillvägagångssätt är CRISPR / Cas9-systemet. Jämfört med andra metoder är CRISPR / Cas9-systemet effektivt för att införa platsspecifika modifieringar och är lätt att designa 13 , 17 , 18 . Dessutom kan den användas i någon Toxoplasma- stam utan extra modifikation av parasiten 13 , 19 .
CRISPR / Cas9-systemet härstammar från det adaptiva immunsystemet av Streptococcus pyogenes , som använder det för att försvara invasionen av mobila genetiska element, såsom fag 20 , 21 , 22 . Detta system använder det RNA-styrda DNA-endonukleas-enzymet Cas9 för att introducera dubbelsträngs DNA-paus (DSB) i målet, vilket därefter repeterasAntingen av den felaktiga NHEJ att inaktivera målgener genom korta indelmutationer eller genom homologdirekt rekombination för att förändra mållocuset exakt som utformat 23 , 24 . Målspecifikiteten bestäms av en liten RNA-molekyl som heter singelstyrd RNA (gRNA), som innehåller en individuellt utformad 20 nt-sekvens som har 100% homologi med mål-DNA 22 . GRNA-molekylen innehåller också signaturer som kännetecknas av Cas9 som styr nukleaset till målplatsen, vilket inkluderar en speciell Protospacer-angränsande motiv (PAM, sekvensen är NGG) 25 , 26 . Därför arbetar gRNA-molekylen och PAM-sekvensen för att bestämma Cas9-klyvningsstället i genomet. Man kan enkelt ändra gRNA-sekvensen för att rikta olika ställen för klyvning.
När CRISPR / Cas9-systemet utvecklades först i ToxopLasma användes en enda plasmid som uttrycker Cas9-nukleaset och gRNA-molekylen för att introducera DSB vid målsättningsstället 13 , 17 . Det har visat sig att CRISPR / Cas9-systemet drastiskt ökar effektiviteten av platsspecifik genommodifiering, inte enbart genom homolog rekombination, men också icke-homolog integration av exogent DNA 13 . Det gör detta i vildtypstammar som innehåller NHEJ-aktivitet. Därför kan detta system användas i väsentligen vilken som helst Toxoplasma- stam för effektiv genomredigering. I ett typiskt experiment co-transfekteras den målspecifika CRISPR-plasmiden och DNA-fragmentet som används för modifiering av målet i parasiter. Om DNA-fragmentet som användes för modifiering av målet innehåller homologa sekvenser till mål-locuset kan homolog rekombination användas för att reparera DSB introducerad av CRISPR / Cas9 för att möjliggöra exakt modifiering av målet. Å andra sidan, om intDNA-fragmentet innehåller inte en homolog sekvens, den kan fortfarande integreras i CRISPR / Cas9-riktningsplatsen. Den senare används ofta för att störa gener genom införande av selekterbara markörer eller komplementära mutanter vid loci som tillåter negativt urval 13 . Här fungerar SNR1- locus som ett exempel för att visa hur CRISPR / Cas9 kan användas för genavbrott och generering av transgena parasiter.
Dessa protokoll presenterar flera metoder som vid kombination tillåter identifiering av en läkemedelsresistensgen i T. gondii . Två i synnerhet var integrerade i projektet, den relativt erfarna metoden för QTL-kartläggning och den nyligen utvecklade metoden för CRISPR / Cas9-genredigering. Lander och Botstein publicerade sitt inflytelserika papper 1989 och demonstrerade QTL-kartläggning som korrelerar genetiska loci med fenotyper 36 . Senast 2012 beskriver Dounda och Charpentier CRISPR / Cas9-editeringssystemet i Streptococcus pyogenes 22 som snabbt anpassades som ett genetiskt verktyg i många olika modeller, inklusive T. gondii 13 , 17 . Båda metoderna var användbara här, där QTL-kartläggning definierade locus som innehöll läkemedelsresistensmutationen som slutligen identifierades med användning av WGS-baserad SNP-detektering och CRISPR / Cas9-redigering gav mig Ans för att bekräfta SNR1 är den genfinnande narkotikaresistensgenen.
ME49-FUDR r X VAND-SNF r- korset 8 ursprungligen utvecklades för att förhöra en virulensfenotyp 19 , men föräldrastammarna råkade också ha en ytterligare fenotypisk skillnad för vilken kausala genen inte var känd, sinus-motstånd i VAND-föräldern. Detta belyser en fördel med kors genom att de kan återställas när ytterligare fenotypiska skillnader i föräldrarna observeras. Detta var fallet för ett annat Toxoplasma- kors, typ 2 x typ 3, där flera gener inblandade i virulens hittades genom att kartlägga flera fenotyper 37 , 38 , 39 , 40 . Hittills har fyra olika T. gondii- kors beskrivits och används för att kartlägga gener som är ansvariga för fenotyperSs = "xref"> 8 , 37 , 41 , 42 , som alla har potential att återanvändas för att kartlägga nya fenotyper för vilka den genetiska grunden är okänd. Längs dessa linjer har genomerna för 62 T. gondii- stammar som representerar den kända globala genetiska mångfalden sekvenserats 43 . Nya kors kan göras från denna pool för stammar som skiljer sig åt intressanta fenotyper. Efter att ha framhävt fördelarna med QTL-kartläggning måste det sägas att generering av ett kors inte är ett mindre företag. Det finns andra metoder som kan användas för att identifiera orsakssgener. En kraftfull teknik använder kemisk mutagenes för att skapa mutanter som kan screenas för fenotyper. För att hitta orsakssgenen kan mutanter antingen kompletteras med kosmidbibliotek 44 eller genomreekventeringsmetoder kan användas för att hitta orsaksmutationen 45 . För moRe på detta, se två JoVE artiklar av Coleman et al. Och Walwyn et al. Som beskriver dessa tillvägagångssätt 46 , 47 .
Många av stegen som leder till identifieringen av den kausal SNF r- mutationen (protokoll 2 och 3) är beroende av beräkningsmetoder som utförs med programvara som är fritt tillgänglig för akademisk användning. Detaljerade kommandon för varje steg tillhandahålls och när körning med de korrekta filerna tillåter användaren att återskapa de dataset som är nödvändiga för att hitta orsakssystemet SNF r SNP. Tänk på att en del av syntaxen i kommandona hänvisar till filnamn eller katalogstruktur ($ PATH) som kan ändras till användarinställningen. Även om de kommandon som ges här helt enkelt inte utesluter hur man kan analysera ett kors med QTL-analys och WGS-baserad SNP-identifiering, är de tillräckligt omfattande för att upprepa experimentet som beskrivs i denna artikel och borde tillåta användaren att bli m Malm som är bekant med hur dessa metoder utnyttjas stegvis.
Fastän QTL-kartläggning och WGS-sekvensbaserad SNP-detektion var tillräcklig för att identifiera en kandidat SNF- r- gen behövs ytterligare experiment för att bekräfta sin roll i läkemedelsresistens. Detta kan övertygande visas genom genavbrott eller knockout-tekniker, vilka båda kan uppnås genom att använda CRISPR / Cas9 genredigering. Detaljerade metoder för att använda CRISPR / Cas9 för att antingen generera indelmutationer eller införa transgena konstruktioner i en målgen i T. gondii ges. Den målspecifikitet som CRISPR / Cas9 tillhandahåller ökar effektiviteten hos genredigeringen över traditionella metoder. Dessutom har denna ökning effektivt gjort det möjligt att använda icke-laboratorieanpassade stammar för genetiska studier som tidigare var svåra att modifiera 13 . Även om CRISPR / Cas9 redan i sin linda har använts för att göra genstörningarLass = "xref"> 2 , 13 , 17 , 18 , 48 , 49 , taggen gener 17 och gör genutslag 16 , 19 , 50 , 51 , 52 , 53 , 54 i T. gondii , lovande att vara ett användbart verktyg För många andra studier i framtiden.
Upptäckten att SNR1- inaktivering leder till sinfuskresistens gör SNR1- locus till en lovande plats för transgeninsättning eller genetisk komplementering. För att maximera framgången med att använda CRISPR / Cas9-medierad geninriktning för att styra integrationen av transgen i SNRl- locuset, bör följande aspekter beaktasRöd under experimentell design. Först rekommenderas en selektionsmarkör att inkluderas i den transgena konstruktionen för att öka effektiviteten av belastningskonstruktionen. Om en markeringsmarkör ingår, kan både positivt och negativt urval användas, vilket resulterar i att nästan 100% av de dubbelt valda parasiterna är transgena med GOI integrerad på SNR1- locus. Om däremot den transgena konstruktionen inte innehåller ytterligare selekterbara egenskaper och bygger på negativt urval vid SNRl- locus, beror effektiviteten av framgångsrik transgenes i stor utsträckning på effektiviteten av samtransfektion av CRISPR-plasmiden och den transgena konstruktionen.
För det andra, även om CRISPR / Cas9-medierad platsspecifik integration av ett icke-homologt DNA-fragment ofta användes för komplementering och transgenes bör det noteras att orienteringen av införandet inte kan garanteras i sådana fall som någon riktning är möjlig. Detta kan orsaka problemMs till vissa applikationer. Till exempel, för att komplementera en mutant med olika gen alleler är det svårt att säkerställa att alla alleler sätts in i samma orientering, och avvikelser i orientering kan orsaka expressionsskillnader. För denna typ av applikation rekommenderas DNA-konstruktioner med sekvenser som är homologa med SNRl- locuset, vilket kommer att driva den korrekta integrationsorienteringen ( Figur 6 ).
För det tredje är förhållandet mellan CRISPR-plasmiden och den transgena DNA-molekylen kritisk för framgångsrik transgenstamkonstruktion under transfektion. Detta förhållande måste anpassas enligt urvalsstrategierna. Följande riktlinjer rekommenderas: 1) Om den transgena konstrukten innehåller en läkemedelsresistent markör och motsvarande läkemedel är det enda valet som används för att generera transgena parasiter, dvs sinfungin inte används, det föreslagna molära förhållandet mellan den transgena konstruktionen och CRISPR-plasmanId är 1: 5. Användning av mer CRISPR-plasmid i detta fall ökar sannolikheten för att parasiter som erhåller den transgena konstruktionen också kommer att erhålla CRISPR-plasmiden, därför är de läkemedelsresistenta parasiterna mer sannolikt att markören sätts in på CRISPR-målningsstället. Om förhållandet reverseras, kommer de flesta parasiter som mottar den transgena konstruktionen inte att få CRISPR-plasmiden. Som en konsekvens erhåller den stora majoriteten av läkemedelsresistenta parasiter den transgena konstruktionen genom slumpmässig integration som inte är associerad med CRISPR / CAS9-medierad platsspecifik införing. 2) Om den transgena konstruktionen innehåller en läkemedelsresistent markör och motsvarande läkemedel används tillsammans med sinfungin för att välja transgena parasiter är det föreslagna molförhållandet mellan den transgena konstruktionen och CRISPR-plasmiden 1: 1. Denna strategi ger den högsta effektiviteten av transgena stamkonstruktioner. 3) Om den transgena konstruktionen inte innehåller en valbar tillverkare, förlita sig på negativt urvalGenom sinfungin ensam för att erhålla transgena parasiter är det föreslagna molförhållandet mellan den transgena konstruktionen och CRISPR-plasmiden 5: 1. Skälen till denna design är densamma som i den första riktlinjen ovan. Eftersom både pyrimetamin och sinfungin användes för selektion i protokoll 5 sattes förhållandet mellan DHFR * mini-gen och den SNRl- riktade CRISPR-plasmiden som 1: 1.
Tillsammans har de metoder som beskrivs här en detaljnivå som inte kunde överföras i den ursprungliga publikationen som identifierade SNR1 2 . Dessa protokoll; Speciellt bör kommandoradssyntaxen, sekventiell layout av de använda programmen och användningen av CRISPR / Cas9 hjälpa framtida ansträngningar att identifiera nya gener som är ansvariga för fenotyper.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka L. David Sibley och Asis Khan för deras bidrag till den ursprungliga publikationen som dessa protokoll bygger på. Detta arbete finansierades av National Institute of Health grant AI108721.
T25 flasks | Corning | 430639 | |
HFF | ATCC | SCRC-1041 | |
T. gondii ME49 strain | ATCC | 50840 | |
T. gondii VAND strain | ATCC | PRA-344 | |
DMEM (No Sodium Bicarbonate) | Life Sciences | 12800017 | |
Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | |
HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
Fetal Bovine Serum Premium Grade | VWR International | 97068-085 | |
L-Glutamine 200mM | Sigma Aldrich | G7513 | |
Gentamicin (10 mg/mL) | Life Technologies | 15710064 | |
Cell Scraper for Flasks | VWR International | 10062-904 | |
Syringe 10ml | BD | 309604 | |
Blunt needles 22g x 1" | BRICO Products | BN2210 | |
Nuclepore Filter 3.0 µm, 25mm | GE Healthcare | 110612 | |
Swin-Lok Filter Holder 25mm | GE Healthcare | 420200 | |
Hemacytometer | Propper MFG | 90001 | |
Sinefungin | Enzo Life Sciences | 380-070-M001 | |
R | The R Foundation | https://www.r-project.org/ | |
J/qtl | The Churchill Group | http://churchill.jax.org/software/jqtl.shtml | |
Bowtie2 | John Hopkins University | http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml | |
NCBI SRA Toolkit | NCBI | http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra/?view=toolkit_doc | |
SAMtools | Wellcome Trust Sanger Institute | http://www.htslib.org/ | |
VarScan | Washington University, St Louis | http://varscan.sourceforge.net/ | |
MUMmer | JCVI & Univ Hamburg | http://mummer.sourceforge.net/ | |
pSAG1::CAS9-U6::sgUPRT | Addgene | Plasmid #54467 | T. gondii CRISPR plasmid to cut the UPRT gene |
pSAG1::CAS9-U6::sg290860-6 | Addgene | Plasmid #59855 | T. gondii CRISPR plasmid to cut the TG*_290860 SNR1 gene |
pUPRT::DHFR-D | Addgene | Plasmid #58528 | Template for DHFR* mini gene |
Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit | New England Biolabs | E0552S | |
QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27106 | |
NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000 | |
LB Broth | Fisher Scientific | DF0446-07-5 | |
Potassium chloride | Sigma Aldrich | P9541 | |
Calcium chloride | Sigma Aldrich | 746495 | |
Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P9791 | |
Potassium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | P5504 | |
EDTA | Sigma Aldrich | E5134 | |
Magnesium chloride | Sigma Aldrich | M1028 | |
Adenosine triposhpate (ATP) | Sigma Aldrich | A6419 | |
L-glutathione (GSH) | Sigma Aldrich | G4251 | |
ECM 830 Electroporation System | BTX | 45-0002 | |
Electroporation Cuvette 4 mm | Harvard Apparatus | 45-0126 | |
Crytal Violet | Alfa Aesar | B21932-14 | |
6-well TC plate | Corning | 353046 | |
24-well TC plate | Corning | 353935 | |
Cover glass 12mm round | VWR International | 89015-724 | |
96-well TC plate | Corning | 353075 | |
Gibson Assembly Cloning Kit (Multi-fragment) | New England Biolabs | E5510S | |
Q5 High-Fidelity Polymerase | New England Biolabs | M0491S | |
Pyrimethamine | TCI AMERICA | P2037-1G | Use cuation when using pyrimethamine resistant parasites – see Protocol |