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Medicine

심장 수술 후 혈청 샘플의 영향을 건강한 자원 봉사자와 그들의 철새 잠재력에서 내피 전구 세포의 분리

doi: 10.3791/55192 Published: February 14, 2017

Summary

내피 전구 세포 (내피 전구 세포는) 결정적으로 허혈성 조직의 혈관 신생에 관여한다. 이 방법은 말초 혈액에서 인간 내피 전구 세포의 분리뿐만 아니라, 심장 수술 환자의 혈청 샘플에 대한 그들의 이동성 전위의 식별을 설명한다.

Abstract

내피 전구 세포 (내피 전구 세포)은 저산소증과 같은 병리 적 조건에서 골수로부터 모집 결정적 허혈성 조직의 혈관 신생에 관여한다. 내피 전구 세포의 기원, 분류 및 특성은 복잡; 에도 불구하고, 내피 전구 세포의 두 눈에 띄는 하위 유형이 설립되었습니다 소위 "초"내피 전구 세포는 늦게-가지 내피 전구 세포 (후기 내피 전구 세포) (이후로-초기 내피 전구 세포 함). 이들은 생물학적 특성에 의해뿐만 아니라, 체외 배양시 그 모양에 따라 분류 할 수있다. "초기"내피 전구 세포는 EC-특정 미디어의 말초 혈액 유래 단핵구 세포의 배양 후보다 일주일에 표시되지만, 늦은 가지 내피 전구 세포 2 ~ 3 주 후에 찾을 수 있습니다. 늦게 가지 내피 전구 세포는 "초기"내피 전구 세포가 Endogen 사 등 다양한 혈관 신생 인자를 표현하는 반면, 직접 주로 성숙 내피 세포로 분화 할 수있는 능력을 통해, 혈관 신생에 관여하는 것으로 인정 받고 있습니다OU에화물이 분비 방식으로 혈관 신생을 촉진합니다. 심근 허혈 / 재관류 (I / R) 동안, 다양한 요소가 혈관 형성의 영역에 내피 전구 세포의 원점 복귀를 제어 할 수 있습니다.

대 식세포 이동 억제 인자 (MIF)은 케 모킨과 같은 염증성 사이토킨 및 보편적으로 발현하고 최근 생리적 농도 1 내피 전구 세포 이주 같은 주요 조절 기능하도록 설명 하였다. 흥미롭게 MIF는 세포 풀에 저장되고 신속하게 여러 자극 후의 혈류 내로 (예를 들면, 심근 경색)을 해제 할 수있다.
이 프로토콜은 혈청 샘플에 대한 시험 관내 마이그레이션 분석에 사용 피브로넥틴 - 코팅 된 플레이트에 내피 성장 인자가 포함 된 배지에서 이후의 문화와 CD34 양성 선택에 따라 성인의 말초 혈액에서 초기 내피 전구 세포의 신뢰성 분리 및 배양하는 방법을 설명합니다 심장 수술 환자. 또한,다른 잘 알려진 혈관 신생 촉진 사이토 카인에 비해 내피 전구 세포의 화학 주성에 MIF의 철새 영향이 설명된다.

Introduction

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내피 전구 세포 (내피 전구 세포)는 인간의 혈액 순환 및이 내피 세포로 분화 할 수있는 능력을 가지고있다. 이들은 혈관 형성에 참여하고 다양한 방법으로 3,4- 염증 및 허혈 / 재관류 (I / R) 손상에 의한 피해를 최소화 할 수있다. 예를 들어, 내피 전구 세포는 카탈라아제, 글루타티온 과산화 망간 슈퍼 옥사이드 dismutases (MnSOD) 5와 같은 세포 내 항산화 효소의 높은 수준을 보여줍니다. 산화 적 스트레스에 대한 높은 저항은 내피 전구 세포가 허혈 손상 6 후 상승 된 활성 산소 종 (ROS)와 미세 환경에서 작동 할 수 있습니다. 이전의 연구는 또한 내피 전구 세포의 개수는 혈관 내피 전구 세포 수리하고 순환 수가 감소는 심혈 관계 사건 (7)의 발생을 예측하는 것이 상관 될 수 있음을 지적클래스 = "외부 참조"> 8. 그러나, EPC 명확한 정의은 아직 발견하지 못했다. 지금까지가 내피 전구 세포에 대한 특정한 세포 표면 마커 또는 일관성 표현형이 없으며 이들 세포는 말초 혈액 (9)은 매우 드물다. 인간 EPC는 손상된 내피 새로운 혈관 구조의 재구성에 기여하는 기능과 순환 셀로서 고려되어야한다.

단리 및 내피 전구 세포를 특징 짓는 한 가지 방법은, 피브로넥틴의 밀착성을 통해서이다. 따라서, 이들 전지의 용량은 실시 예 3, 10, 11, 1, 콜라겐을 입력 비해 코팅 요리 피브로넥틴 우수한 밀착성을 표시하는 데 사용된다. 그러나, 다른 임의의 이전 또는 추가의 정제 단계없이 피브로넥틴 코팅 접시에 단핵구 도금하는 골수 전구 세포, 단핵구 및 T 림프구를 포함 하나 콜로니 리드 것으로2, 13, 14. 또한,이 경우, 혈소판 단핵 세포 (MNC) 부분을 오염시킬 수 있으며 따라서 임의의 부착 세포 (15) 세포막 단백질을 옮긴다.

시험 관내 접착 분석을 통해 특성화 이외에 다른 세포 표면 마커의 조합은 EPC 간주 세포 유형을 서술하기 위해 사용된다. 이 때, 피브로넥틴 매개을 접착 한 후, 세포는 내피 세포와 같은 특성에 관하여 분석된다. 이 과정에서, 두 개의 내피 세포 - 관련 마커 아세틸 - 저밀도 지단백질 (acLDL) 및 혈관 내피 성장 인자 수용체 2 (VEGFR-2, KDR)에 역할을한다. 내피 세포와 대 식세포는 특히 "폐품 세포 경로"(16)라고하는 과정에서 acLDL을 차지하는 것으로 나타났다. 또 다른 마커 단백질은 내피 세포의 주 VEGF 수용체로 KDR입니다세포 17. 일반 내피 전구 세포는 혈관 내피 성장 인자 및 소 태아 혈청이 보충 된 배지에서 배양 그러나, 마크로파지 것은 또한 실수, 전시 내피 형 마커 프로필 격리되었을 수있는 것이 가능하다. 이전에 도시 된 바와 같이, 내피 에어컨 배지에서 배양하면, 대 식세포는 "내피 별"단백질 18 표현한다.

일반적으로, 혈액에서 발견 될 수 있거나 시험 관내에서 배양 이상의 아형 내의 내피 전구 세포의 두 가지 종류가있다. 늦게 가지 내피 전구 세포 (후기 내피 전구 세포)를 배양 2-3 주 후에 나타납니다. 이러한 세포는 인간 제대 정맥 내피 세포의 단층으로 빠른 통합되어 모세관 튜브 (19)를 형성 할 수있다. 또한, 혈관 내피 성장으로 제공하는 혈관 신생 분자를 통해 더 수동적 인 방법으로 일주일 정도 및 행위의 혈액 순환 "초기 내피 전구 세포 소위"인자 (VEGF), 또는 CXCL8 19. 관상 동맥 질환 (CAD) 환자들은 CAD (20)가없는 대조군에 비해 초기 내피 전구 세포의 매우 낮은 양을 보여 주었다. 흥미롭게도, 같은 그룹은 대조군에 비해 늦은 내피 전구 세포의보다 많은 양을 보였다. 또 다른 연구는 초기 내피 전구 세포가 분비 방식으로 6 산화 조건에서 세포 사멸에서 차별화 된 내피 전구 세포를 보호하는 것으로 나타났다. 따라서, 초기 내피 전구 세포는 말초 혈액 내에서 자동 또는 분비 방식으로 다른 세포의 이동을 통해 관련 보호 효과를 제공 할 수 있습니다.

이 프로토콜은 먼저 인간의 말초 혈액에서 PBMC-부분을 분리하고 이후에 원치 않는 세포에서이 세포 현탁액을 취소 할 PBMC-부분에서 CD34 + 세포를 분리하여 초기 내피 전구 세포를 정화하는 방법을 설명합니다. CD34 인간 조혈 줄기 세포 (9)의 분리에 사용되는 마커 인 + 세포가 피브로넥틴 코팅 조직 배양 표면에 배양한다. 사흘, 배지함으로써 모든 비 부착 세포를 잃고, 변경된다. 마지막으로, 고립 된 내피 전구 세포는 acLDL의 흡수 및 형광 활성화 된 셀 정렬 (FACS)를 사용하여 내피 세포 마커로 KDR의 존재를 확인하기 위해 염색된다. 추가적인 마커로서, 우리는 또한 내피 세포에서 발생 혈소판 내피 세포 부착 분자 (PECAM-1, CD31)을 분석 하였다.

내피 전구 세포의 강화 된 채용에 의해 손상되거나으로 경색 심근 조직의 복원은 심혈관 질환에 집중적으로 조사 치료 전략에 속한다. 그러나, 임상으로 실험 결과의 번역은 다양한 병태 생리 학적 조건에서 인체의 복잡한 세포의 상호 작용 주어, 여전히 도전이다. 또한, 심근 난 / R 부상 다양한 사이토 카인, 호르몬과 성장 FAC의 과도한 분비를 유발 혈관 형성 (13)의 영역에 내피 전구 세포의 유도를 제어 TORS. 이미 도시 된 바와 같이, CXCL8, 간질 세포 유래 인자 1α (SDF-1α, CXCL12)은 VEGF 및 대 식세포 이동 억제 인자 (MIF)를 크게 심근 I / R 손상 다음 혈청 샘플에서 증가된다. 이들 요소 중에서, MIF 주로 친 염증 특성을 갖는다면 발현 케모카인과 같은 사이토 카인이다. 역사적 이름 달리 MIF는 다양한 세포 유형 1 (21, 22)에 대한 진정한 케모카인으로 작용 친 이동성 기능을 갖는다. MIF 매개 세포 채용 프로세스 MIF는 결합 및 비 - 동족 방법 (21)에 활성화 케모카인 수용체 CXCR4 및 CXCR2에 연결되어있다. 참고로, 내피 전구 세포는 또한 저산소 조건 하에서 상향 조정되고 그 표면에 수용체를 모두 표현엉덩이 = "외부 참조"> 23, 24. 또한, 축적 증거는 MIF 심장 22, 25, 26의 I / R 손상시 전체 심장 보호 효과가 있음을 시사한다. 이러한 맥락에서, 상기 MIF는 손상된 심근 (27)의 제한된 복구 메커니즘을 고려하면, 특히 관련이있다 저산소 스트레스 동안의 혈관 신생을 지원할 수 있음을 보여왔다. 전 임상 마우스 모델에서 이전 체외 연구와 실험은 내피 전구 세포 모집 4 MIF의 역할에 대해 첫 번째 증거를 제공했다. 참고로, MIF는 허혈성 사이트 (28) 내에서 내피 전구 세포 모집 중에 해제 될 수 내피 전구 세포의 저명한화물 단백질이다. 그러나, 다른 (혈관) 혈청 사이토 카인에 비해 특히 임상에서 연구하기 어려운 남아있다.

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Protocol

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내피 전구 세포의 분리를위한 혈액은 지역 윤리위원회에 따라 동의 후 건강한 자원자로부터 얻은 것입니다. 마이그레이션 분석에 사용 된 혈청 샘플 심폐 (CPB)를 이용하여 종래의 심장 수술을받은 환자로부터 얻었다. 제외 기준은 비상 운영, 알려진 또는 의심되는 임신했다 18 년 이상 이하 연령, 동의를 얻기 위해 실패를 patient`s. 혈청 샘플은 임상 측정 루틴 (즉시 수술 전 즉시 심근 재관류 / 대동맥의 개시 후) 후속 최종 분석까지 -80 ℃에서 보관 이외에 그려졌다. 제도적 검토위원회 (윤리위원회, RWTH 아헨 대학)이 연구를 승인했다. 환자는 68.6 년의 평균 연령 81.7 kg의 평균 중량을 나타내었다. 기존 질환 포함 고혈압 (65 %), 만성 폐 질환 (19 %), 추가 심장 arteriopathy (16 %), 뇌 기능 장애 (6 %), 불안 정형 협심증 (3 %), 최근 심근 경색 (90 (D) 내에 28 %), 만성 신장 질환 (14 %), 간 질환 (2 %), 당뇨병 (34 %).

T75 플라스크 1. 코팅 :

  1. 5 ㎖의 피브로넥틴 용액을 T75 플라스크 당 (15ml의 초순수로 희석하여 1 mg의 인간 피브로넥틴)을 준비한다.
  2. T75 플라스크에 솔루션을 추가하고 물이 증발 될 때까지 기다립니다. 증발에 의한 분리 공정 동안 불필요한 중단을 방지하기 위해, 사전에이 프로세스를 수행하는 (예를 들면 밤새) 실온에서. 이 솔루션은 4.44 μg의 피브로넥틴 / ㎠를 제공합니다.
  3. 제조자의 성장 인자로 보충 기저 MV2 매체를 보충하여 내피 세포 성장 배지 MV2를 준비한다.

60 mL의 혈액에서 내피 전구 세포 (내피 전구 세포) 2. 절연 :

참고 : CD34 양성 선택 칵테일 A와ND 자성 비드는 제조자가 제공되는 농도가없는, 선택지의 선택 세트에서 상업적으로 이용 가능하다. 그러나, 항체는 약 100 μL를 5 × 108 개의 셀을 처리하기에 충분하다. 자기 구슬이 물에 희석, 덱스 트란이 코팅 된 약 5,000 배 더 작은 다른 시중에서 판매하는 구슬에 비교했다. 자세한 내용은 제조자의 지침을 참조하십시오.

  1. 칼슘 -mg 2 + - 무료 PBS로 1 : (또는 항응고제 제외) 혈액 1 섞는다.
  2. 50 ㎖ 튜브 당 밀도 구배 용액 15 mL를 넣고. 자세한 내용은 제조자의 지침을 참조하십시오.
  3. 천천히 밀도 구배 용액의 상부에 희석 된 혈액 층을 포함한다.
  4. 원심 분리기 샘플 속도가 느린 가속 및 제동없이 30 분 동안 2,500 XG에.
  5. 조심스럽게 멸균 플라스틱 피펫을 사용하여 모든 관 (그림 1)의 버피 코트 층을 수집하고 다른 튜브에 넣어.밀도 구배 솔루션의 컬렉션을 피하십시오. 예상 PBMC 수율은 약 3-4 × 10 6 세포 / mL의 혈액이다.

그림 1
그림 1 : 피콜 솔루션에 Bbuffy 코트의 밀도 구배 원심 분리. 밀도 구배 용액에 30 분 동안 2,500 XG에서 밀도 구배 원심 분리의 결과가 도시되어있다. 적혈구 및 과립구 (적색), 단핵 세포 분획 (백색 층) 플라즈마 (옐로우), 및 밀도 구배 용액 (백탁)이다 묘사했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

  1. PBS 중 적어도 3 볼륨으로 말초 혈액 단핵 세포 분획을 희석하고 혼합한다. 200 x g에서 15 분 동안 실온에서 원심 분리한다.
  2. 두 번 단계를 반복 2.6. </ 리>
  3. 5 ㎖ MV2 배지 상등액과 세포 펠렛 재현 탁 대기음.
  4. 사용 버피 코트 당 (5 × 10 8 셀을 처리하기위한 충분한) 인간 CD34 항체의 100 μL를 추가하고 5 % CO 2와 37 ° C에서 15 분 동안 회전합니다.
  5. 사용 버피 코트 당 덱스 트란 코팅 자기 구슬 50 μL를 추가하고 5 % CO 2와 37 ° C에서 10 분 동안 회전합니다.
  6. 부화 후, 각각의 튜브에 3 mL를 최대 FACS 튜브에 정지를 전송합니다. 더 많은 양의 자석으로 허용되지 않습니다.
  7. 자석 (들)에 FACS 튜브 (들)을 넣고 5 분 동안 기다립니다.
  8. 자석 밖으로 FACS 튜브를 당기없이 상층 액을 버린다.
  9. 자석의 외부에 3 ㎖ MV2 매체 각각 FACS 튜브에 세포를 재현 탁.
  10. 반복 두 번 2.12-2.14 단계를 반복합니다.
  11. 자석 밖으로 FACS 튜브를 당겨 3 ㎖ MV2 배지에서 세포를 재현 탁.
  12. 프레 코트 T75의 F에 세포 현탁액을 전송lasks 및 플라스크 당 17 mL의 MV2 매체를 추가 할 수 있습니다.
    주 : 매체 3 일 후 변경해야합니다. 일주 후, 세포는 스핀들 같은 구조 (그림 2)를 표시하고 사용할 준비가 된 것입니다. 분리의 간과를 들어 그림 3을 참조하십시오.

그림 2
그림 2 : 격리 된 내피 전구 세포의 현미경 이미지. 분리에 앞서 T75 플라스크에서 격리 된 초기 내피 전구 세포의 대표 이미지가 보여진다. 겉보기은 내피 전구 세포의 스핀들 형 구조이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3 : 흐름도는 EPC 격리 절차를 표시합니다. 도시는 방식 쇼EPC를 분리 프로토콜의 단일 단계를 보내고. 자세한 프로토콜에 대한 프로토콜 섹션의 제 2 장을 참조하십시오.

3. 마이그레이션 분석

  1. T75 플라스크에 내피 전구 세포에서 매체를 제거합니다.
  2. 조심스럽게 흔들어 5 mL의 PBS로 세척.
  3. PBS를 제거하고 5 ㎖ 상업 세포 분리 솔루션을 추가 할 수 있습니다. 세포가 분리 될 때까지 (현미경으로 확인) 기다립니다. 조심스럽게 플라스크의 바닥을 탭하여 분리를 가속화합니다.
  4. 세포가 분리되는 경우, 신속 MV2 완전 배지 5 ㎖를 추가하여 다른 튜브에 세포 현탁액을 전송.
  5. 5 분 동안 2,000 XG에 원심 분리기.
  6. 5 분 동안 2000 × g으로 다시 50-10 ㎖의 PBS에서 세포를 재현 탁 및 원심 분리기.
  7. 단계를 반복 3.6.
  8. MV2 결핍 배지에서 세포 펠릿 (윤회 웰 당 75 μL가 필요한 50,000 세포)에 재현 탁.
    주 : 필요한 이동 시스템은 세포 형태 및 분석에 따라 달라진다. 사랑하는 있습니다 erent 기공 직경 및 판 크기 (우물의 수). 내피 전구 96 웰 시스템에 5 ㎛의 공극 크기가 최적이다.
  9. 하부 챔버 (그림 4)에 : 혈청 샘플의 235 μL를 추가하여 마이그레이션 판을 준비 (MV2 굶어 매체에 5 혈청 1 희석).

그림 4
그림 4 : 수정 된 보이든 상공 회의소에서 마이그레이션 분석. 수정 된 보이든 챔버의 일반적인 설계가 도시. 세포 배양 인서트 (= 상부 챔버) 진한 청색으로 표시되고, 상기 하부 챔버 내에 삽입된다. 이 인서트의 바닥 (그러나 벽)은 공극을 포함하는 필터 시스템을 나타낸다. (a)는 시점 제로 설정을 표시합니다. (b) 선택된 시점 후에, 세포를 자극쪽으로 필터를 통해 이주된다.fig4large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

  1. 얼마 전에 세포 용액을 첨가 삽입을 추가합니다.
  2. 상부 챔버 내로 세포 용액 75 μL (= 50,000 세포)를 추가한다.
  3. 내피 전구 세포 2 (이동 시간은 세포 유형 및 시스템에 따라 다름) 37 ° C에서 3 시간 5 % CO에 대한 마이그레이션 할 수 있습니다.
    1. 혈청 자동 형광 유물을 방지하기 위해, 반 자동화 된 소프트웨어 "ImageJ에"를 사용하여 세포를 현미경으로 잘 사진을 복용하여 마이그레이션 세포를 정량화 계산합니다.
  4. 상부 챔버 (모든 이주되지 않은 세포를 포함)를 제거합니다.
  5. (1,000 1 희석) 훽스트 염료를 포함, 70 μL 3.6 % 파라 포름 알데히드 용액을 추가합니다. 플레이트를 37 ℃ 및 5 % CO 2에서 밤새 저장 될 수있다.
  6. 1 ~ 2 분 동안 2,000 XG에서 같은 초점면에 모든 세포를 얻기 위해 곧 접시를 원심 분리기.
  7. w 당 5 사진을 촬영엘 (도 56) 100 배 배율.

그림 5
그림 5 : 촬영 한 사진의 위치를 표시 제도. 계획은 잘 관련 마이그레이션 세포의 판정에 필요한 다섯 찍은 사진의 위치를 ​​나타낸다. 사진은 세포를 계산하고 잘 모든에 대한 평균 값을 계산 가져옵니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6
그림 6 : 셀 정량화에 대한 현미경 이미지. 세포 정량 찍은 대표적인 이미지는 보여진다. 세포를 염색 USI을 고정시켰다3.6 % 파라 포름 알데히드에 NG 훽스트 (Hoechst) 염료. 점은 고정 내피 전구 세포를 염색 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

  1. 건강의 국립 연구소에 의해 반 자동화 된 소프트웨어 "ImageJ에"를 사용하여 마이그레이션 된 세포를 계산합니다.

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Representative Results

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격리 된 내피 전구 세포의 특성

먼저 acLDL의 흡수가 확인되었다뿐만 아니라 단리 된 세포 집단의 표면에 KDR의 발현, 및 CD31. 도 7a에서 보듯이, 고립 된 내피 전구 세포의 85.1 %가 acLDL의 흡수를 보여 CD31를 표명했다. 두 마커에 대한 부정적인 작은 인구있을 것 같습니다 있지만,도 7B7C는 상기 두 마커의 균일 한 분포를 보여줍니다. 제 2 단계에서, KDR과 조합 acLDL의 FACS 분석을 수행 하였다. 도 8a는 분리 된 세포의 80 % 이상이 acLDL의 흡수 및 그 표면에 KDR의 발현을 보였다 보여준다. 도 8B8C는 이러한 마커의 동질성을 보여줍니다.

importanc을 확인하려면문화 시간 동안 피브로넥틴 코팅 요리 전자, (우리의 프로토콜에 명시된 바와 같이) 피브로넥틴 코팅 접시에 배양 7 일 후 격리 된 내피 전구 세포와 피브로넥틴 코팅 된 표면에 문화 이틀 후 분리 된 세포 사이의 세 마커의 비교 이전 CD34 + -selection으로 모두 수행 하였다. 도 9a에 도시 된 바와 같이, 이틀간 배양 세포의 46.4 %가 피브로넥틴의 배양 후 7 일 후의 세포의 85 %에 비해 acLDL의 흡수뿐만 아니라, 그 표면에 CD31의 발현을 보였다. 또한, 히스토그램 (도 9B9C)이 칠일에 비해 문화 이틀 후 두 마커의 적은 강도를 표시 (도 7B7C). 동일 마커 acLDL과 KDR의 조합 마찬가지입니다. 피브로넥틴에 문화 이틀 후, 모든 셀의 68.0 %가 자신의 표면에 acLDL의 흡수뿐만 아니라 KDR의 발현을 보였다 (그림님의 10A-10C). 피브로넥틴에 문화 7 일 후, 세포의 83.6 %가 표면 (도 8a-8C)에 KDR의 acLDL의 이해와 표현을 보여 주었다.

다음 단계에서, 내피 전구 세포의 분리시 CD34 + -selection의 중요성을 평가 하였다. 따라서, 세포 밀도 기울기 원심 분리 및 피브로넥틴에 문화 7 일을 포함하는 본 프로토콜에 따라 선택하지만, 이는 -selection가 분리 하였다 +를 CD34을 놓쳤다. 도 10a에 도시 된 바와 같이, 모든 분리 된 세포의 18 % 이상도 명시 CD31을 아니고 CD31 발현 acLDL의 흡수를 보여 CD34 + -selection 후 8 % 미만에 비해 acLDL의 흡수를 보여준다 (도 7a) . 또한, 분리 된 세포는 관련된 비교 마커 모두에 대하여 매우 불균일 한 것을도 11b 및도 11c에 도시한다 + -selection와 세포 집단에서 같은 마커를 표시 trong>도 7B 및 7C.

심장 수술시 혈청 사이토 카인 수준

MIF, CXCL12, CXCL8 및 VEGF의 혈청 순환 농도에 심근 I / R 다음 심장 수술의 영향을 확인하기 위해, 혈청 샘플을 상업적으로 입수 가능한 ELISA (도 12)에 의해 후속 분석을 위해 사전 및 내부에 작동 그려진 . MIF의 혈청 수준 (100.3 NG / ㎖ 127.4 NG / ㎖, p = 0.027) 기준선 값에 비해 수술 상당한 증가를 나타내었다. 마찬가지로, CXCL12 레벨 수술 동안 혈청의 상당한 증가 (0.101 NG / ㎖ 0.198 NG / ㎖, p = 0.011)을 나타냈다. MIF 및 CXCL12과 마찬가지로, CXCL8 크게 (0.15 NG / mL의 0.3 NG / mL로, P = 0.022) 수술 중 증가했다. 계속에서RAST는 VEGF 농도는 관찰 기간 동안의 임의의 유의 한 변화를 보이지 않았다 (0.154 NG / ㎖ 0.134 NG / ㎖, p = 0.583) 1.

내피 전구 세포의 마이그레이션 용량

patients' 혈청 샘플의 직접적 영향을 조사하고, 그 내부는 EPC 이전에 사이토킨 / 케모카인 / 혈관 신생 인자를 포함하기 전 및 수술 동안 그려진 혈청 샘플을 이용한 생체 마이그레이션 분석이 수행되었다. 내피 전구 세포는 건강한 지원자에서 고립되었다. 도 13에 도시 된 바와 같이, EPC 이동 속도가 상당히 이전에 동작하는 샘플에 비해 내부에 동작하는 샘플을 향해 증가 (기준선에 비해 + 35 %, p = 0.047).

이전의 연구가 이미 나는 것을 증명하기 때문에 / R은 SEV의 분비를 유발MIF, CXCL12, CXCL8 및 VEGF를 포함하여 이러한 잠재적 인 화학 유인 물질을 사용하여 백혈구 주 화성 및 마이그레이션, 마이그레이션 분석을 조절 대한 일반적인 사이토 카인을 시행 하였다. 또한, 장치가 수행 된 마이그레이션의 하부 챔버에 상기 사이토 카인의 생리 학적 측정 농도를 적용, 시험 관내 이주 실험에서 추가 생체 내에서 EPC 모집에 이러한 사이토 카인의 영향에 대한 이해를 얻을 수 있습니다.

100 130 NG 사이 MIF 혈청 농도 / ㎖ (그림 12), 100 NG의 농도를 측정했다 AS / 재조합 MIF의 mL의 매체 제어에 비해 EPC 마이그레이션에> 6 배 증가 (주도하는 사용 그림 14). 300 pg / ml 인 - 반면, CXCL12, CXCL8 및 VEGF의 혈청 농도는 150의 범위에 있었다. 참고로,이 농도는 체외에서 EPC 마이그레이션에 어떤 영향을 중재하지 않았다(그림 14). 이들 네 가지 사이토 카인 중, MIF는 생체 내 1 EPC 마이그레이션에 상대적으로 강한 영향을 나타내는 것으로, 따라서 생각할 수있다.

그림 7
그림 7 일 7에 고립 된 내피 전구 세포의 FACS 분석 (A) 피브로넥틴 - 코팅 요리에 CD34 + 선택과 7 일간의 배양 기간 후 격리 된 내피 전구 세포의 acLDL 및 CD31 세포 표면 식의 흡수가 보여진다. 위 왼쪽 : 세포가 acLDL의 흡수를 보여 주지만, CD31을 표현하지 않습니다. 오른쪽 상단 : 세포가 acLDL의 흡수를 보여 CD31를 표현한다. 왼쪽 아래 : 세포가 acLDL의 더 흡수를 표시하지 않고 CD31을 표현하지 않습니다. 오른쪽 아래 : 세포가 acLDL의 더 흡수를 보여 없지만, CD31를 표현한다. 표시됨 (b)는 격리 된 내피 전구 세포에 의해 흡수 후 PE - 복합 acLDL의 히스토그램이다. 표시됨 (c)는 FITC-접속사의 히스토그램격리 된 내피 전구 세포의 세포 표면의 CD31에 결합 후 비공 액 CD31 항체. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 8
그림 8 : 주 7 격리 된 내피 전구 세포의 FACS 분석 (A) 피브로넥틴 - 코팅 요리에 CD34 + 선택 7 일간의 배양 기간 후 격리 된 내피 전구 세포의 acLDL 및 KDR 세포 표면 식의 흡수가 보여진다. 위 왼쪽 : 세포가 acLDL의 흡수를 보여 주지만, KDR을 표현하지 않습니다. 오른쪽 상단 : 세포가 acLDL의 흡수를 보여 KDR을 표현한다. 왼쪽 아래 : 세포가 acLDL의 더 흡수를 표시하지 않고 KDR을 표현하지 않습니다. 오른쪽 아래 : 세포가 acLDL의 더 흡수를 보여 없지만, KDR을 표현한다. 표시됨 (b)는 격리 된 내피 전구 세포에 의해 흡수 후 PE - 복합 acLDL의 히스토그램이다. 표시됨 (c)는 인절연 내피 전구 세포의 세포 표면에 결합 KDR 후 FITC 공액 KDR 항체 히스토그램. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 9
그림 9 : 주 2 격리 된 내피 전구 세포의 FACS 분석 (A) 피브로넥틴 - 코팅 요리에 CD34 + 선택 2 일 배양 기간 후 격리 된 내피 전구 세포의 acLDL 및 CD31 세포 표면 식의 흡수가 보여진다. 위 왼쪽 : 세포가 acLDL의 흡수를 보여 주지만, CD31을 표현하지 않습니다. 오른쪽 상단 : 세포가 acLDL의 흡수를 보여 CD31를 표현한다. 왼쪽 아래 : 세포가 acLDL의 더 흡수를 표시하지 않고 CD31을 표현하지 않습니다. 오른쪽 아래 : 세포가 acLDL의 더 흡수를 보여 없지만, CD31를 표현한다. 표시됨 (b)는 격리 된 내피 전구 세포에 의해 흡수 후 PE - 복합 acLDL의 히스토그램이다. ( 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 10
그림 10 : 주 2 격리 된 내피 전구 세포의 FACS 분석 (A) 피브로넥틴 - 코팅 요리에 CD34 + 선택 2 일 배양 기간 후 격리 된 내피 전구 세포의 acLDL 및 KDR 세포 표면 식의 흡수가 보여진다. 위 왼쪽 : 세포가 acLDL의 흡수를 보여 주지만, KDR을 표현하지 않습니다. 오른쪽 상단 : 세포가 acLDL의 흡수를 보여 KDR을 표현한다. 왼쪽 아래 : 세포가 acLDL의 더 흡수를 표시하지 않고 KDR을 표현하지 않습니다. 오른쪽 아래 : 세포가 acLDL의 더 흡수를 보여 없지만, KDR을 표현한다. 표시됨 (b)는 흡수 후의 PE 공역 acLDL의 히스토그램격리 된 내피 전구 세포에 의해. 표시됨 (c)는 절연 내피 전구 세포의 세포 표면에 결합 KDR 후 FITC 공액 KDR 항체의 히스토그램이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 11
그림 11 : 주 7 격리 된 내피 전구 세포의 FACS 분석 (A) 피브로넥틴 - 코팅 요리에 7 일간 배양 기간을 포함하여 이전 CD34 + 선택하지 않고 고립 된 내피 전구 세포의 acLDL 및 CD31 세포 표면 발현 흡수하지만,이 보여진다. 위 왼쪽 : 세포가 acLDL의 흡수를 보여 주지만, CD31을 표현하지 않습니다. 오른쪽 상단 : 세포가 acLDL의 흡수를 보여 CD31를 표현한다. 왼쪽 아래 : 세포가 acLDL의 더 흡수를 표시하지 않고 CD31을 표현하지 않습니다. 오른쪽 아래 : 세포가 acLDL의 더 흡수를 보여 없지만, CD31를 표현한다. (b) 표시됨격리 된 내피 전구 세포에 의해 흡수 후 PE - 복합 acLDL의 히스토그램이다. 표시됨 (c)는 절연 내피 전구 세포의 세포 표면 CD31에 결합 후, FITC 공액 CD31 항체의 히스토그램이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 12
그림 12 : 심장 수술시 혈청 사이토 카인 수준. ELISA를 이용하여 심장 수술을 시행 CXCL8, VEGF, CXCL12, 환자의 MIF의 혈청 농도의 측정. SEM ± 내 수술 농도에 비해 수술 전의 평균 값이 표시됩니다 (* P <0.05; 전 영업 이익)

그림 13
도표 13 : 나는n은 환자의 혈청을 향해 내피 전구 세포의 체외 마이그레이션. 심장 수술을받은 환자의 혈청 샘플을 향한 건강한 지원자의 EPC 마이그레이션에서 내 수술의 증가가 도시. MV2 혈청 결핍 배지에 웰당 50,000 세포를 트랜스 웰 시스템의 상부 챔버에 첨가 하였다. 동일 배지 5 : 하부 챔버의 혈청 샘플 1로 희석 하였다. 세포를 5㎛의 멤브레인을 37 ° C, 5 % CO 2에서 3 시간 동안 이주. 막대는 SEM ± 평균 값을 나타냅니다 (* P <0.05)

그림 14
그림 14 : 재조합 사이토 카인을 향해 내피 전구 세포의 체외 마이그레이션합니다. 재조합 CXCL8의 대표 농도 대한 내피 전구 세포의 마이그레이션이 도시되어, CXCL12, VEGF, 및 MIF는 혈청 결핍 배지 (= 기준)에 비해. 만 MIF는 할 수 있었다생리 학적 측정 농도의 증가 된 EPC 마이그레이션을 중재합니다. 재조합 사이토 카인은 MV2 혈청 결핍 배지에 희석 하였다. 세포는 5 ㎛ 멤브레인을 통해 3 시간 동안 이주. (: P <0.01 대 혈청 결핍 매체 **) 막대는 SEM ± 평균 값을 나타냅니다

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Discussion

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본 연구의 첫 번째 부분은 심장 수술 환자의 혈액의 포괄적 인 평가를 가능하게 건강한 지원자의 말초 혈액에서 인간의 내피 전구 세포의 분리를 포함했다. 따라서, 밀도 구배 원심 분리 혈장, 적혈구 및 과립구로부터 PBMC의 분획을 분리 하였다. 오염 혈소판의 대부분을 제거하려면,이 세포 분획 짧은 하였다 느린 세척, (30)를 29 단계를 반복합니다. 다음으로, CD34 + 세포는 나머지 림프구 및 단핵구에서 선조 세포를 분리하는 나머지 부분으로부터 분리 하였다. 최종적으로, 세포 현탁액은 골수 혈통 (3)의 다른 (선조) 세포로부터 혈관 내피 전구 세포를 분리하는 시판 내피 세포 성장 배지 피브로넥틴 코팅 접시에 배양 하였다. 참고로, 혈소판은 CD34 세포 표면 표현이 표시 될 수 있음을 설명이온도. 이전의 연구는 혈소판 일부 항 CD34 항체의 결합을 보여하지만,이 때문에 다른 (CD34 양성) 셀 (31), (32)와 혈소판의 응집에 유물이 될 수 있습니다. 그러나, 대부분의 혈소판 느린 반복 세척 단계에 의해 분리 할 수있다. 혈소판 게다가 그들의 전구체 - 거핵구 -이 조혈 전구 세포 항원을 발현 할 그들이 주로 골수 (33), (34)에서 발견되지만, 말초 혈에 존재하는 것이다. 또한,이 프로토콜에서 사용되는 세포 표면 마커 CD34이 성숙 내피 세포 35 매우 낮은 수준으로 발현되는 것을 설명한다. 따라서 내피 전구 세포를 분리 할 때 조심스럽게, 혈소판 / 거핵 세포 또는 성숙 내피 세포에 의한 오염 가능성을 고려하는 것이 중요합니다. 따라서, 단계 2.6는 isolatio 동안 특정 관련이있다내피 전구 세포의 N은 혈소판을 제거합니다.

이일 및 피브로넥틴에 문화의 7 일 후에 피브로넥틴 코팅 요리, 세포 집단에서 분리 된 세포를 배양의 중요성을 명확히하기 위해 이전 CD34 양성 선택과 모두를 비교 하였다. 하루 두에서 고립 된 세포의보다 절반은 표면에 CD31의 acLDL의 흡수와 동시 발현을 보였다. 또한, 대한 히스토그램에 모두 마커의 덜 강렬한 식을 볼 수 있습니다. 이 데이터는 내피 세포의 특정 매체에 피브로넥틴에 문화 7 일이 특성 내피 세포 발현 패턴을 보여주는 내피 전구 세포를 얻을하는 데 필요한 것으로 나타났다. 이 단계에서는, 피브로넥틴 적절한 농도 / 양을 사용하여 중요하다. Wijelath와 동료들은 이전에 피브로넥틴은 VEGF (36)과 함께 가장 가능성이 내피 세포와 같은 패턴의 발현을 촉진하는 것을 보여 주었다.

다음 세인트프로토콜의 EP가 세포 현탁액의 CD34 + -selection의 중요성과 이전 CD34 + -selection없이 피브로넥틴 코팅 접시에 배양 7 일 후, 분리 된 세포를 비교 조사 하였다. 두 마커 (acLDL 흡수 및 CD31 발현) 누락 세포의 양이 분리 단계를 포함하는 이전에 비해 CD34 + 세포 -selection없이 차단 후 훨씬 높았다. CD34 + -selection와 분리 된 세포에 비해 CD31의 불균일 한 표현으로 나타낸 바와 같이 흥미롭게도, 피브로넥틴에 문화의 7 일 후에, 세포가 누락 된 CD34 + -selection은 덜 균일 한 세포 집단을 보였다. 이러한 데이터는 CD34 + -selection 다른 단핵구 / 대 식세포에서 내피 전구 세포를 분류 할 필요가 있음을 보여준다. 이 프로토콜의 설립 동안, 우리는 37 ° C의 MV2 매체 CD34 + -selection 훨씬 낮은 TE와 비교하여, 생존 세포 수의 증가를 초래한다는 발견필요 mperatures는 조심스럽게 앞으로의 연구에서 조사한다. 우리는 37 ° C에서이 프로토콜 칼슘 함유 매체에 항체 배양을 적용 할 때하는 비특이적 상호 작용과 결합으로 이어질 수 있음을 인정해야합니다. 미래에, 저온에서 칼슘 결핍 버퍼 시스템을 테스트하고 이러한 잠재적 혼동 인자 않도록 설정되어야한다.

이전에 (예를 들어 인간 제대 정맥 내피 세포, HUVEC) (37)는 서로 다른 셀 유형 바와 같이 특히, 혈청 샘플을 세포 이동 실험 우리 예비 분석에서, 측정은 우선, 형광 마이크로 플레이트 리더 및 세포의 칼 세인 염색을 이용하여 수행 하였다. 챔버들 사이의 서로 다른 흡광 값은 단독 혈청 샘플들뿐만 아니라, 매체뿐만 아니라 이미 신중하게 고려되어야하는 형광 측정에 현저한 영향을 미치는 것으로 나타났다. 따라서, wE가 우리의 프로토콜을 채택하고, 세포가 반자동 소프트웨어가 광학 현미경을 통해 관찰하여 계산 될 수있는 측정 시스템으로 전환.

내피 전구 세포는 말초 혈액 세포의 약 0.1 %를 차지하고, 이러한 특정 셀 (38)을 분리하는 것이 곤란하지만 연구 인상적인 번호 내피 전구 세포가 유익한 효과를 제공하며, 사지 및 심근 39 허혈성 사건 이후 조직 혈관을 향상시킬 수 있음을 지적 40. 그러나, 아직 임상 적으로 이러한 결과를 해석하고 그의 임상 적 관련성을 평가하기위한 지속적인 도전이다. 그 이유는 이전에 (22), (41) 표시되었습니다 다른 화학 유인 물질의 분비에 많은 수술 전후 요인의 중요한 영향 때문일 수 있습니다. 따라서, 본 연구는, 다른 (C)의 역할의 두 번째 부분에심근 I의 설정에서 내피 전구 세포의 이동에 ytokines는 / R 평가 하였다. 따라서, 심장 수술 환자에서 사이토 카인의 혈중 농도를 측정 하였다. MIF뿐만 아니라 CXCL12 및 CXCL8 상당한 내부 동작의 증가를 보였다. 다시 시험 관내 실험에 이러한 연구 결과를 번역 할 때, 본 결과는 CXCL12-이나 시험관 내에서 측정 된 생리 학적 농도에서 EPC 마이그레이션에 CXCL8 매개 효과도가 있음을 보여 주었다. 상술 EPC 분리 모델과 후속 이동 분석법을 사용하여, MIF는 EPC 이주 (42)의 주된 매개체 인 것이 확인되었다. 이러한 맥락에서, Kanzler 등. MIF와 VEGF는 저산소증 (23)에서 EPC 마이그레이션에 강력한 효과를 실험 마우스 모델에서 보여 주었다. 흥미롭게도, VEGF의 측정은 결합 오 발생할 수있는 VEGF의 혈중 농도에 유의 한 수술 중 변화가 없음을 보여헤파린의 수술 표준화 된 응용 프로그램에 F VEGF. 따라서, MIF는 심장 수술 환자에서 내피 전구 세포의 채용에 혈관 신생 케모카인들 사이에서 지배적 인 역할을하고, 시작하고 그러나 부상 (43), (44)의 사이트에 내피 전구 세포의 인신 매매를 통해 심근 I / R 후 치유 과정에 기여할 수있다 MIF 수준은 심근의 I / R, 그것은 내피 전구 세포의 채용에 MIF 매개 효과는 심근 I / R (23) 후 심장 마비의 예방에 상당한 영향을 미칠 심장 리모델링과 혈관 신생을 영향을 미칠 수 있는지 여부를 추측 남아 직후 증가했다. 그러나, 분석을 진행하기 전에, 더 내피 전구 세포의 다른 아형의 특성을 인간 생물학의 기능적 역할을 평가하는 것이 중요하다. 이와 관련하여, 본 프로토콜은 I 있도록 인간 말초 혈액 내피 전구 세포를 분리하는 방법에 대한 신뢰할 수있는 방법을 제공한다더 포괄적 인 특성화 및 미래 연구의 TS.

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Disclosures

저자는 공개 아무것도 없어.

Acknowledgments

저자는 어떤 승인이 없습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fibronectin Biochrom AG L7117 Coating of T-75 flasks
Aqua ad iniectabilia Fresenius Kabi
Endothelial cell growth medium MV2 Promo Cell C-22221
Endothelial cell growth medium MV2 SupplementMix Promo Cell C-39226
Ficoll-Paque plus GE Healthcare 17-1440-03 Density centrifugation
EasySep human CD34 positive Selection Kit Stemcell Technologies 18056 Isolation of CD34+ cells
EasySep magnet Stemcell Technologies 18000
Accutase Sigma-Aldrich A6964-100ML Detachment of cells
Corning HTS transwell 96 well permeable supports Sigma-Aldrich CLS3387-8EA Migration system
Hoechst solution ThermoFisher 33342 Staining of migrated cells
ImageJ National institutes of health xxx Counting of migrated cells

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심장 수술 후 혈청 샘플의 영향을 건강한 자원 봉사자와 그들의 철새 잠재력에서 내피 전구 세포의 분리
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Emontzpohl, C., Simons, D., Kraemer, S., Goetzenich, A., Marx, G., Bernhagen, J., Stoppe, C. Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Healthy Volunteers and Their Migratory Potential Influenced by Serum Samples After Cardiac Surgery. J. Vis. Exp. (120), e55192, doi:10.3791/55192 (2017).More

Emontzpohl, C., Simons, D., Kraemer, S., Goetzenich, A., Marx, G., Bernhagen, J., Stoppe, C. Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Healthy Volunteers and Their Migratory Potential Influenced by Serum Samples After Cardiac Surgery. J. Vis. Exp. (120), e55192, doi:10.3791/55192 (2017).

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