Summary
ובתאי אנדותל (EPCs) מעורבים באופן מכריע על נאווסקולריזציה של רקמות איסכמי. שיטה זו מתארת את הבידוד של EPCs אדם מדם היקפי, כמו גם זיהוי של פוטנציאל הנדידה שלהם נגד דגימות סרום חולי הכירורגיים לב.
Abstract
ובתאי אנדותל (EPCs) מגויס ממח העצם בתנאים פתולוגיים כמו היפוקסיה ומעורב באופן מכריע על נאווסקולריזציה של רקמות איסכמי. מקורו, סיווג ואפיון של EPCs הם מורכבים; יחד עם זאת, שני סוגי המשנה הבולטים של EPCs הוקמו: מה שנקרא "מוקדם" EPCs (המכונה לאחר מכן כבר-EPCs) ומאוחר-תולדה EPCs (מאוחרת EPCs). הם יכולים להיות מסווגים לפי מאפיינים ביולוגיים כמו גם לפי המראה שלהם במהלך בתרבות חוץ גופית. בעוד "מוקדם" EPCs מופיעים פחות משבוע אחרי התרבות של תאים mononuclear היקפי הנגזרות דם במדיה EC-ספציפי, בסוף-תוצאה ניתן למצוא EPCs לאחר 2-3 שבועות. EPCs מאוחרת-תולדה הוכרו להיות מעורבים ישירות נאווסקולריזציה, בעיקר באמצעות יכולתם להתמיין לתאי אנדותל בוגרים, ואילו "מוקדם" EPCs להביע גורמים angiogenic שונים כמו endogenמטען מפוקפק לקדם אנגיוגנזה באופן paracrine. במהלך איסכמיה לבבית / reperfusion (I / R), גורמים שונים לשלוט ביות של EPCs לאזורים של היווצרות כלי דם.
מקרופאג גורם הגירה מעכבת (MIF) הוא ציטוקין פרו-דלקתי דמוי chemokine ו ubiquitously הביע תואר לאחרונה לתפקד רגולטור מפתח כמו הגירת EPCs בריכוזים פיסיולוגיים 1. מעניין, MIF מאוחסן ברכות תאיות ניתן לשחרר במהירות לתוך זרם הדם לאחר כמה גירויים (למשל אוטם שריר לב).
פרוטוקול זה מתאר שיטה לבידוד האמין והתרבות של מוקדם EPCs מדם היקפי אדם בוגר המבוסס על מבחר CD34 חיובי עם תרבות עוקבת במדיום המכיל גורמי גדילה האנדותל על צלחות מצופות פיברונקטין לשימוש מבחני הגירה במבחנה נגד דגימות סרום חולי הכירורגיים לב. יתר על כן,שפעת נדידה של MIF על chemotaxis של EPCs לעומת ציטוקינים ממגר אנגיוגנזה ידועה אחרים באה לידי ביטוי.
Introduction
ובתאי אנדותל (EPCs) הם במחזור הדם האנושי ויש להם את היכולת להתמיין לתאי אנדותל 2. הם משתתפים vasculogenesis ומסוגלים מזעור הנזק נגרם על ידי דלקת איסכמיה / reperfusion (I / R) פציעות בדרכים שונות 3, 4. לדוגמה, EPCs מראים רמות גבוהות של אנזימים נוגדי חמצון תוך תאיים כמו catalase, peroxidase גלוטתיון או סופראוקסיד דיסמוטאז מנגן (MnSOD) 5. ההתנגדות המוגבהת מפני סטרס חמצונים מאפשרת EPCs לתפקד microenvironments עם מיני חמצן תגובתי גבוהים (ROS) לאחר פגיעה איסכמית 6. גם מחקרים קודמים הצביעו על כך שמספר EPCs עלול להיות מתואמים תיקון כלי הדם וכי מספר מופחת של מחזורי EPCs מנבא את התרחשותם של אירועים קרדיווסקולריים 7,class = "Xref"> 8. עם זאת, הגדרה ברורה של EPC לא נמצאה עדיין. עד עכשיו, אין סמן משטח תאים ספציפי או פנוטיפ עקבית EPCs ותאים אלה הם נדירים מאוד בדם ההיקפי 9. EPC אדם צריך להיחשב כתא במחזור עם יכולת שיקומה של האנדותל נפצע ומבנים וסקולרית חדשים.
אחת הדרכים לבודד ולאפיין EPCs היא באמצעות הדבקה על פיברונקטין. ובכך, את היכולת של תאים אלה משמשת להראות הידבקות מעולה כדי פיברונקטין מנות צופה לעומת להקליד 1 קולגן, למשל 3, 10, 11. עם זאת, אחרים מצאו כי תאי ציפוי mononuclear על מנות מצופות פיברונקטין וללא שום צעד טיהור קודם או יותר מובילים מושבות כוללות ובתאים מיאלואידית, מונוציטים, ו- T לימפוציטים 12, 13, 14. יתר על כן, במקרה זה, טסיות עלול לזהם את תא mononuclear (MNC) החלק ובכך להעביר חלבונים בממברנה פלזמה לכל תאים חסידים 15.
מלבד אפיון באמצעות מבחני הידבקות במבחנה, שילוב של סמנים פני תא שונים משמש לתיאור סוג תא נחשב כסוג של EPC. במקרה זה, לאחר הידבקות בתיווך פיברונקטין, התאים מנותחים בדבר תכונות אנדותל דמוי שלהם. בתהליך זה, סמנים האנדותל שני הקשורים התא, ליפופרוטאין בצפיפות acetylated-נמוך (acLDL) ו הקולטן לגורם הצמיחה של אנדותל כלי הדם 2 (VEGFR-2, KDR), לשחק תפקיד. תאי מקרופאגים האנדותל הוכחו תופסי acLDL במיוחד בתהליך הנקרא "מסלול תא נבלות" 16. חלבון סמן נוסף הוא KDR בשם רצפטור VEGF העיקרי על האנדותלתאים 17. עם זאת, כפי EPCs בכלל בתרבית התקשורת השלימה עם גורמי גדילת האנדותל נסיוב עגל עוברי, יתכן כי מקרופאגים, אשר ייתכן גם שהוא מבודד בטעות, תערוכת פרופיל סמן אנדותל הדמוי. כפי שהוצג קודם, אם תורבתו בינוני אנדותל ממוזג, מקרופאגים להביע חלבונים "ספציפי האנדותל" 18.
באופן כללי, ישנן שתי קטגוריות של EPCs בתוך תת יותר, אשר ניתן למצוא בדם או להיות מתורבת במבחנה. EPCs מאוחרת-תולדה (סוף-EPCs) מופיעים לאחר 2-3 שבועות של תרבות. תאים אלה משולבים מהר לתוך monolayer של בתאי האנדותל וריד אדם הטבור והוא יכול ליצור צינורות נימי 19. חוץ מזה, מה שנקרא "מוקדם EPCs" לזרום בדם במשך כשבוע ולפעול בצורה פסיבית יותר באמצעות מולקולות angiogenic ומספק, כגון צמיחה אנדותל כלי הדםגורם (VEGF), או CXCL8 19. חולים עם מחלת עורקים כליליים (CAD) הראו כמויות נמוכות משמעותית של מוקדם EPCs בהשוואה לקבוצת ביקורת ללא CAD 20. מעניין לציין, כי אותה הקבוצה הראתה כמויות גדולות יותר של EPCs מאוחר בהשוואה לקבוצת ביקורת. מחקר אחר הראה כי מוקדם EPCs להגן EPCs הבדיל מן אפופטוזיס בתנאים חמצוני באופן paracrine 6. לכן, EPCs מוקדם עשוי לספק השפעות מגנות רלוונטיות באמצעות ההגירה של תאים אחרים בצורה וקישוט רכב או paracrine בתוך הדם ההיקפי.
פרוטוקול זה מתאר שיטה לטהר מוקדם EPCs על ידי הבידוד הראשון-שבריר PBMC מדם היקפי אדם ובהמשך לבודד CD34 + תאים מן-שבריר PBMC כדי לנקות השעית תא זה תאים לא רצויים. CD34 הוא סמן, המשמש לבידוד של תאי גזע hematopoietic אדם 9 + תאים בתרבית על משטחים בתרבית רקמה מצופה פיברונקטין. אחרי שלושה ימים, את המדיום משתנה, ובכך לאבד את כל התאים שאינם חסידים. לבסוף, EPCs מבודד מגואלות לאמת את הספיגה של acLDL ואת הנוכחות של KDR כמו אנדותל תא סמן באמצעות תא קרינת מיון מופעל (FACS). כסמן נוסף, ניתחנו מולקולה הידבקות התא טסיות האנדותל (PECAM-1, CD31), אשר מתרחשת גם על תאי האנדותל.
שיקום של רקמת שריר הלב פגום או אוטם ידי גיוס משופרת של EPCs שייך אסטרטגיות טיפול נחקר באינטנסיביות במחלות לב וכלי דם. עם זאת, התרגום של תוצאות ניסוי לתוך פרקטיקה קלינית עדיין מאתגר, בהתחשב הגומלין הסלולר מורכב בגוף האדם במהלך תנאי pathophysiological שונים. יתר על כן, אני הלבבי / פציעות R לעורר הפרשת יתר של ציטוקינים שונים, הורמוני fac הצמיחה tors, השולט על הביות של EPCs לאזורים של היווצרות כלי דם 13. כפי שמוצגות, CXCL8, סטרומה תא הנגזרות 1α גורם (SDF-1α, CXCL12), VEGF גורם מעכבות הגירה מקרופאג (MIF) עולה במידה ניכרת בדגימות הבא אני לבבי / R פציעה 1. בין גורמים אלה, MIF הוא ציטוקין pleiotropic chemokine דמוי עם מאפיינים פרו-דלקתיים בעיקרה. בניגוד השם ההיסטורי שלה, MIF יש פונקציות פרו-נודדות, מתנהג כמו chemokine נכון על סוגי תאים שונים 1, 21, 22. MIF בתיווך תהליכי גיוס תא קושרו אל CXCR2 קולטנים chemokine ו CXCR4, אשר MIF נקשר, ומפעיל באופן שאינו מאותו מקור 21. מן הראוי לציין כי EPCs מבטאות הן של קולטנים אלה על פני השטח שלהם, אשר בנוסף להיות למעלה מוסדר בתנאים היפוקסיהתחת = "Xref"> 23, 24. יתר על כן, הראיות המצטברות עולה כי יש MIF השפעה קרדיו-מגן הכוללת במהלך I / R פציעה של הלב 22, 25, 26. בהקשר זה, מוכיח עוד כי MIF עשוי לתמוך נאווסקולריזציה במהלך מתח היפוקסי חשוב ורלוונטי במיוחד, כאשר בוחנים את מנגנוני התאוששות המוגבלים של שריר הלב הפגוע 27. מחקרים קודמים במבחנה וניסויים בעכברי מודל הפרה-קליני ספקו ראיות ראשונות על תפקידו של MIF ב EPCs גיוס 4. ראוי לציין, MIF גם הוא חלבון מטען בולט של EPCs העשויים להתפרסם במהלך גיוס EPCs בתוך אתרים איסכמי 28. עם זאת, מחקרים במסגרות קליניות בפרט בהשוואה אחר (אנגיוגנזה) ציטוקינים בסרום להישאר חמקמקים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
דם עבור בידוד של EPCs התקבל מתנדבים בריאים לאחר הסכמה מדעת בהתאם ועדת האתיקה המקומית. דגימות סרום המשמש מבחני הגירה התקבלו מחולים שעברו ניתוחי לב קונבנציונלי עם השימוש מכונת לב-ריאה (CPB). קריטריוני הכללה היו פעולות חירום, הריון ידוע או חשוד, המטופלת בגיל פחות מ -18 שנים, ואי קבלת הסכמה מדעת. דגימות סרום נמשכו בנוסף מדידות שגרתיות קליני (מיד לפני הניתוח ומיד לאחר רה-פרפוזיה בשריר הלב / פתיחת מהדק צלב אבי העורקים) ומאוחסן לאחר מכן ב -80 ° C עד לניתוח הסופי. הדירקטוריון סקירה מוסדיים (ועדת האתיקה, אוניברסיטת אאכן RWTH) אישר את המחקר הזה. המטופלים הראו בגיל ממוצע של 68.6 שנים משקל ממוצע של 81.7 ק"ג. מחל טרום קיימים-כלולות: יתר לחץ דם (65%), מחלת ריאות כרונית (19%), arteriopathy לב נוסף (16%), חוסר תפקוד מוחי (6%), תעוקת חזה בלתי יציב (3%), אוטם שריר לב האחרון (28% תוך 90 ד), מחלת כליות כרונית (14%), מחלה כבדה (2%) וסוכרת (34%).
1. ציפוי של T75 Flask:
- הכן 5 פתרון פיברונקטין מ"ל (1 מ"ג פיברונקטין האדם מדולל 15 מים ultrapure מ"ל) לכל בקבוק T75.
- מוסיפים את הפתרון בבקבוק T75 ולהמתין עד שהמים מתאדים. כדי למנוע הפרעות מיותרות במהלך תהליך הבידוד בשל אידוי, לבצע תהליך זה מראש (לילה למשל) בטמפרטורת החדר. פתרון זה נותן 4.44 מיקרוגרם פיברונקטין / 2 ס"מ.
- הכן את MV2 מדיום הגידול תא האנדותל ידי להשלים את המדיום MV2 הבזליים עם תוספי גורם הגדילה שסיפק היצרן.
בידוד 2. של ובתאי אנדותל (EPCs) מ- 60 מיליליטר דם:
הערה: ככל קוקטייל מבחר CD34 חיוביnd החרוזים המגנטיים זמינים מסחרי ערכת מבחר משולבת, אין ריכוזים שספקו יצרן. עם זאת, כ -100 μL של הנוגדן מספיק לעיבוד עד 5 x 10 8 תאים. החרוזים המגנטיים מדוללים במים, dextran צופה וכ 5,000x קטן יותר בהשוואת חרוזים זמינים מסחרי אחרים. לפרטים נוספים, ראה הוראות manufacturer's.
- מערבבים דם (עם או בלי תרופות נגד קרישת דם) 1: 1 עם Ca 2 + 2 + ללא -Mg PBS.
- הוסף 15 מ"ל של תמיסת שיפוע צפיפות לכל צינור 50 מ"ל. לפרטים נוספים, ראה הוראות manufacturer's.
- לאט שכבת הדם מדולל על גבי שיפוע פתרון צפיפות.
- צנטריפוגה דגימות ב 2500 XG במשך 30 דקות עם אצה איטית וללא בלימה.
- בזהירות לאסוף את שכבת מעיל באפי כל צינור (איור 1) בעזרת פיפטה פלסטיק סטרילית והכניס אותו לתוך צינור נוסף.הימנע אוסף של פתרון שיפוע צפיפות. תשואת PBMC הצפויה היא כ 3-4 x 10 6 תאים / מיליליטר דם.
איור 1: צפיפות Gradient צנטריפוגה של מעיל Bbuffy על פתרון Ficoll. מוצג הוא התוצאה של צנטריפוגה שיפוע הצפיפות ב 2500 XG במשך 30 דקות על פתרון שיפוע צפיפות. מתואר הם אריתרוציטים, גרנולוציטים (אדום), את החלק היחסי התא mononuclear (שכבה לבנה), פלזמה (צהוב), והפתרון שיפוע צפיפות (לבנבן). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
- לדלל את שבריר התא mononuclear הדם ההיקפיים עם לפחות 3 כרכים של PBS ומערבבים. צנטריפוגה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות ב 200 x ז.
- חזור על שלב 2.6 פעמים. </ Li>
- לשאוב התא גלולה supernatant ו resuspend ב 5 בינוני מ"ל MV2.
- הוספת 100 μL של נוגדן CD34 האדם (מספיק לעיבוד עד 5 x 10 8 תאים) לכל מעיל באפי בשימוש ולסובב במשך 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2.
- הוסף 50 μL של חרוזים מגנטיים מצופה dextran לכל מעיל באפי בשימוש ולסובב במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2.
- לאחר דגירה, להעביר את ההשעיה לצינורות FACS עם מקסימום של 3 מ"ל בצינור אחד. כמויות גדולות יותר לא תהיינה מותרות עם המגנט.
- הכנס FACS צינור (ים) לתוך המגנט (ים) ולחכות 5 דקות.
- בטל supernatant ללא משיכת צינורות FACS מתוך המגנט.
- Resuspend התאים בצינור אחד FACS עם 3 בינוני מ"ל MV2 מחוץ המגנט.
- חזור על שלבים 2.12-2.14 פעמיים.
- משוך את צינורות FACS מתוך למגנטים resuspend התאים 3 בינוני מ"ל MV2.
- מעבירים את ההשעיה התא לתוך f T75 מראש מצופהlasks ולהוסיף 17 בינוני מ"ל MV2 לכל בקבוק.
הערה: הבינוני צריך להיות שונה לאחר 3 ימים. לאחר שבוע, תאים מראים מבני ציר דמוי (איור 2) והם מוכנים לשימוש. לקבלה לתצפית על הבידוד ראה איור 3.
איור 2: תמונה מיקרוסקופית של EPCs המבודד. המוצג הוא תמונה מייצגת של מוקדם EPCs מבודד בבקבוק T75 לפני ניתוק. לכאורה הוא מבנה דמוי כישור של EPCs. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: תרשים הזרימה מציגה הליך בידוד EPC. המתואר הוא ערכה, להראותing הצעדים היחידים של פרוטוקול בידוד EPC. עבור פרוטוקול מפורט יותר ראה סעיף 2 בפרק הפרוטוקול.
3. Assay הגירה
- הוצא את המדיה EPCs בבקבוק T75.
- לשטוף עם 5 מ"ל PBS על ידי רועדת אותו בזהירות.
- הסר PBS ולהוסיף 5 פתרון ניתוק התא מסחרי מ"ל. מתן עד התאים מנותקים (לבדוק תחת מיקרוסקופ). להאיץ את הניתוק ידי הקשה בתחתית בזהירות של הבקבוק.
- כאשר התאים מנותקים, להוסיף במהירות 5 מיליליטר של מדיום מלא MV2 ולהעביר את השעית התא לתוך צינור נוסף.
- צנטריפוגה XG ב 2000 למשך 5 דקות.
- Resuspend התאים 5-10 מ"ל PBS ו צנטריפוגות שוב XG ב 2000 למשך 5 דקות.
- חזור על שלב 3.6.
- Resuspend תא גלול במדיום מורעב MV2 (50,000 תאים 75 μL לכל טוב גלגול נדרש).
הערה: איזו מערכת הגירה נדרשת תלוי בסוג התא assay. יש הבדל בקטרים נקבוביים erent וגדל צלחת (מספר הבארות). לקבלת EPCs גודל נקבובי של 5 מיקרומטר 96 המערכת גם הוא אופטימלי. - מכין את צלחת ההגירה על ידי הוספת 235 μL של מדגם הסרום (נסיוב מדולל 1: 5 ב MV2 בינוני מורעב) לתוך התא התחתון (איור 4).
איור 4: Assay הגירה בתוך לשכת בוידן השתנה. המוצג הוא העיצוב הכללי של חדר בוידן שונה. מוסיף תרבית תאים (= חדר העליון) מסומן בכחול כהה מוכנסים לתוך בתא התחתון. התחתי (אבל לא הקירות) מוסיפים אלה מייצגים את מערכת הסינון כולל את הנקבוביות. (א) מציג את ההתקנה בשלב נקודת האפס. (ב) אחרי נקודת זמן שנבחר, תאים נדדו דרך המסנן כלפי גירוי.fig4large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
- מוסיפים את הכנס זמן קצר לפני הוספת פתרון התא.
- הוסף 75 μL של פתרון התא (= 50,000 תאים) לתוך החדר העליון.
- תנו EPCs להעביר במשך 3 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 (זמן ההעברה תלוי בסוג מערכת התא).
- כדי למנוע חפצים פלואורסצנציה אוטומטי בסרום, לכמת תאים היגרו באמצעות צילומים של הבאר תחת מיקרוסקופ לספור את התאים באמצעות תוכנת חצי אוטומטי "ImageJ".
- הסר את החדר העליון (המכיל את כל התאים שאינם שהועברו).
- להוסיף 70 μL 3.6% פתרון paraformaldehyde, כולל צבע Hoechst (בדילול 1: 1,000). הצלחת יכולה להיות מאוחסן על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 לילה.
- צנטריפוגה צלחת זמן קצר כדי לקבל את כל התאים לאותו מישור המוקד XG ב 2000 במשך 1-2 דקות.
- קחו 5 תמונות לכל well (איורים 5 ו -6) עם הגדלה 100x.
איור 5: תכנית המראה את המיקום של התמונות שצולמו. התכנית מתארת את עמדת החמש התמונות שצולמו, אשר יש צורך בקביעת תאים הגרו, ביחס הבאר. התמונות נלקחות לספור את התאים לחשב ערך ממוצע לכל היטב. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 6: תמונה מיקרוסקופית עבור כימות Cell. המוצג הוא תמונה מייצגת, אשר נלקח כימות התא. התאים היו מוכתמים קבועים using Hoechst לצבוע ב paraformaldehyde 3.6%. נקודות מייצגות קבועות מוכתמות ובתאים אנדותל. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
- ספירת התאים נדדו באמצעות תוכנת חצי אוטומטי "ImageJ" על ידי המכון הלאומי לבריאות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
אפיון של ובתאי אנדותל מבודדים
ראשית, את הספיגה של acLDL אומתה, כמו גם את הביטוי של KDR, ו CD31 על פני השטח של אוכלוסיית התא המבודדת. כפי שמראה איור 7 א, 85.1% של EPCs המבודד הראו ספיגה של acLDL והביעו CD31. דמויות 7b ו 7c נוספת להפגין חלוקה הומוגנית של שני הסמנים, למרות נראה שיש אוכלוסייה קטנה, שלילית עבור שני הסמנים. במקום השני בשלב, ניתוח FACS של acLDL בשילוב עם KDR בוצע. 8a האיור מראה כי למעלה מ -80% של התאים המבודדים הראו ספיגה של acLDL והביטוי של KDR על פני השטח שלהם. דמויות 8b ו 8C להראות ההומוגניות של סמנים אלה.
כדי לאמת את importancדואר של מנות מצופה פיברונקטין בזמן התרבות, השוואה של שלושה סמנים בין תאים בודדים לאחר יומיים של התרבות על משטח מצופה פיברונקטין עם EPCs מבודד לאחר שבעה ימים של תרבות על מנות מצופה פיברונקטין (כאמור בפרוטוקול שלנו) בוצע, הוא עם CD34 + -selection הקודמים. כפי שניתן לראות 9a איור, רק 46.4% של ימים-תרבותי תאים הראו ספיגה של acLDL גם כביטוי של CD31 על פני השטח שלהם, לעומת 85% מכלל התאים לאחר שבעה ימים של תרבות על פיברונקטין. יתר על כן, היסטוגרמות (9b דמויות 9c) להראות פחות אינטנסיבית של שני הסמנים לאחר ימים של התרבות לעומת שבעה ימים (7b דמויות 7c). הדבר נכון גם עבור שילוב של סמנים acLDL ו KDR. לאחר ימים של תרבות על פיברונקטין, רק 68.0% מכלל התאים הראו ספיגה של acLDL וכן כביטוי KDR על פני השטח שלהם (איור10a-10C ים). לאחר שבעה ימים של תרבות על פיברונקטין, 83.6% מכלל התאים הראו ספיגה של acLDL וביטוי של KDR על פני השטח שלהם (איורים 8 א-8C).
בצעד הבא, את החשיבות של CD34 + -selection במהלך הבידוד של EPCs הוערכה. לכן, תאים שנבחרו בהתאם לפרוטוקול הנוכחי, כולל צנטריפוגה שיפוע צפיפות ושבעה ימים של תרבות על פיברונקטין, אך החמיצו את CD34 + -selection בודד. כפי שניתן לראות 10a איור, מעל 18% מכלל התאים המבודדים לעשות לא CD31 המפורש ולא להראות ספיג של acLDL, לעומת פחות מ -8% לאחר CD34 + -selection, אשר מראה ביטוי CD31 וכן ספיג של acLDL (איור 7 א) . בנוסף, דמויות 11b ולהראות 11C כי התאים המבודדים הם הומוגניות מאוד הן לגבי הסמנים לעומת הנוגעים
רמות ציטוקינים סרום במהלך ניתוחי לב
כדי לזהות את ההשפעה של ניתוחי לב הבאים שריר לב I / R על הריכוזי במחזור הרמות בסרום של MIF, CXCL12, CXCL8 ו VEGF, דגימות סרום נמשכו טרום תוך ניתוח לניתוח שלאחר מכן על ידי זמינה מסחרי ELISA (איור 12) . רמות בסרום של MIF הראו עלייה תוך ניתוחית משמעותית לעומת ערכי הבסיס (100.3 ng / mL לעומת 127.4 ng / mL, p = 0.027). כמו כן, רמות CXCL12 הראו עלייה משמעותית בנסיוב במהלך הניתוח (0.101 ng / mL לעומת 0.198 ng / mL, p = 0.011). בדומה MIF ו CXCL12, CXCL8 גדל באופן משמעותי במהלך הניתוח (0.15 ng / mL לעומת 0.3 ng / mL, p = 0.022). ב המשךראסט, ריכוזי VEGF לא הראו כל שינוי משמעותי במהלך תקופת המעקב (0.154 ng / mL לעומת 0.134 ng / mL, p = 0.583) 1.
קיבולת הגירה של לתאי אנדותל ובתאים
כדי לחקור את ההשפעה הישירה של דגימות סרום patients' ואת בו הכיל ציטוקינים / כמוקינים / גורמים angiogenic על הגירה EPC, ב assay הגירה לשעבר vivo באמצעות דגימות סרום, אשר צוירו לפני ובמהלך הניתוח, בוצע. EPCs בודד מתנדב בריא. כפי שמתואר באיור 13, שיעור גירת EPC גדל באופן משמעותי כלפי הדגימות שנלקחו תוך ניתוח לעומת דגימות שנלקחו מראש הניתוח (+ 35% לעומת בסיס, p = 0.047).
מאז מחקרים קודמים כבר הראו כי I / R מעורר הפרשת sevציטוקינים eral לווסת chemotaxis לויקוציטים והגירה, מבחני הגירה באמצעות chemoattractants פוטנציאליים אלה, כולל MIF, CXCL12, CXCL8, ו VEGF בוצעו. כדי להגיע להבנה טובה יותר של ההשפעה של ציטוקינים אלה על גיוס EPC in vivo, נוסף בניסויים במבחנה הגירה, החלת הריכוזים שנמדדו פיזיולוגית של ציטוקינים מעל לתא התחתון של הגירה התקנים בוצעו גם.
כמו ריכוזים בסרום MIF בין 100 ל 130 ng / mL נמדד (איור 12), בריכוז של 100 ng / mL של רקומביננטי MIF שמש, אשר הביא לגידול 6 פי> גירת EPC לעומת השליטה הבינונית ( איור 14). לעומת זאת, ריכוזים בסרום של CXCL12, CXCL8, ו VEGF היו בטווח של 150 - 300 pg / mL. מן הראוי לציין כי ריכוזים אלה לא לתווך השפעה כלשהי על הגירה EPC במבחנה(איור 14). לכן מתקבל על הדעת כי בין ארבעת ציטוקינים אלה, MIF מציג את ההשפעה החזקה ביותר ביחס על הגירה EPC in vivo 1.
איור 7: FACS ניתוח של EPCs המבודד ביום 7. (א) מוצגת הוא ספיגת ביטוי שטח פני תא acLDL ו CD31 של EPCs המבודד לאחר CD34 + מבחר התקופה תרבות 7 יום על מנות מצופות פיברונקטין. השמאלי העליון: תאים להראות ספיגת של acLDL, אך אינם מבטאים CD31. ימני עליון: תאים להראות ספיג של acLDL ולהביע CD31. צד שמאל למטה: והתא לא מראה ספיגת של acLDL ו מחווים CD31. למטה מימין: והתא לא מראה ספיגת של acLDL, אבל להביע CD31. (ב) המוצג הוא היסטוגרמה של acLDL PE מצומדות לאחר ספיגת ידי EPCs מבודד. (ג) המוצג הוא היסטוגרמה של FITC-conjugated CD31 נוגדן לאחר קשירת CD31 פני תא של EPCs המבודד. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 8: FACS ניתוח של EPCs המבודד ביום 7. (א) מוצגת הוא ספיגת ביטוי שטח פני תא acLDL ו KDR של EPCs המבודד לאחר CD34 + מבחר התקופה תרבות 7 יום על מנות מצופות פיברונקטין. השמאלי העליון: תאים להראות ספיגת של acLDL, אך אינם מבטאים KDR. ימני עליון: תאים להראות ספיג של acLDL ולהביע KDR. צד שמאל למטה: ותא לא מראה ספיג של acLDL ו מחווה KDR. למטה מימין: והתא לא מראה ספיגת של acLDL, אבל להביע KDR. (ב) המוצג הוא היסטוגרמה של acLDL PE מצומדות לאחר ספיגת ידי EPCs מבודד. (ג) המוצג הואהיסטוגרמה של נוגדן KDR-מצומדות FITC לאחר קשירת KDR פני תא של EPCs המבודד. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 9: FACS ניתוח של EPCs המבודד ביום 2. (א) מוצגת הוא ספיגת ביטוי שטח פני תא acLDL ו CD31 של EPCs המבודד לאחר CD34 + מבחר התקופה תרבות 2 יום על מנות מצופות פיברונקטין. השמאלי העליון: תאים להראות ספיגת של acLDL, אך אינם מבטאים CD31. ימני עליון: תאים להראות ספיג של acLDL ולהביע CD31. צד שמאל למטה: והתא לא מראה ספיגת של acLDL ו מחווים CD31. למטה מימין: והתא לא מראה ספיגת של acLDL, אבל להביע CD31. (ב) המוצג הוא היסטוגרמה של acLDL PE מצומדות לאחר ספיגת ידי EPCs מבודד. (
איור 10: FACS ניתוח של EPCs המבודד ביום 2. (א) מוצגת הוא ספיגת ביטוי שטח פני תא acLDL ו KDR של EPCs המבודד לאחר CD34 + מבחר התקופה תרבות 2 יום על מנות מצופות פיברונקטין. השמאלי העליון: תאים להראות ספיגת של acLDL, אך אינם מבטאים KDR. ימני עליון: תאים להראות ספיג של acLDL ולהביע KDR. צד שמאל למטה: ותא לא מראה ספיג של acLDL ו מחווה KDR. למטה מימין: והתא לא מראה ספיגת של acLDL, אבל להביע KDR. (ב) המוצג הוא היסטוגרמה של acLDL PE מצומדות לאחר ספיגתעל ידי EPCs מבודד. (ג) המוצג הוא היסטוגרמה של נוגדן KDR FITC- מצומדות לאחר קשירת KDR פני תא של EPCs המבודד. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 11: FACS ניתוח של EPCs המבודד ביום 7. (א) מוצגת הוא ספיגת ביטוי שטח פני תא acLDL ו CD31 של EPCs המבודד ללא CD34 + לבחירה קודם, אבל כגון אורך חיי תרבות 7 יום על מנות מצופות פיברונקטין. השמאלי העליון: תאים להראות ספיגת של acLDL, אך אינם מבטאים CD31. ימני עליון: תאים להראות ספיג של acLDL ולהביע CD31. צד שמאל למטה: והתא לא מראה ספיגת של acLDL ו מחווים CD31. למטה מימין: והתא לא מראה ספיגת של acLDL, אבל להביע CD31. (ב) מוצגהוא היסטוגרמה של acLDL מצומדות PE לאחר ספיגת ידי EPCs מבודד. (ג) המוצג הוא היסטוגרמה של נוגדן CD31 FITC- מצומדות לאחר קשירת CD31 פני תא של EPCs המבודד. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 12: רמות ציטוקינים סרום במהלך ניתוחי לב. מדידת ריכוזים בסרום של CXCL8, VEGF, CXCL12, ו MIF של חולים שעברו ניתוח לב באמצעות ELISA. מוצגים הם ערכים ממוצעים של טרום ניתוחית בהשוואה לריכוז תוך אופרטיבי ± SEM (*: p <0.05; לעומת-OP מראש)
איור 13: אניn Vitro הגירה של EPCs לקראת סרום החולה. מוצג הוא גידול תוך אופרטיבי גירת EPC של מתנדבים בריאים כלפי דגימות סרום של חולים, שעברו ניתוח לב. 50,000 תאים לכל היטב במדיום מורעב בסרום MV2 נוספו בחדר העליון של מערכת Transwell. הדגימות בסרום בתא התחתון דוללו 1: 5 עם אותו בינוני. התאים נדדו במשך 3 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 דרך קרום 5 מיקרומטר. עמודות אלו מייצגות ערכים ממוצעים ± SEM (*: p <0.05)
איור 14: במבחנה הגירה של EPCs לקראת ציטוקינים רקומביננטי. המוצג הוא הגירה של EPCs כלפי ריכוזי נציג CXCL8 רקומביננטי, CXCL12, VEGF, ו MIF לעומת בינוני מורעבים בסרום (= Baseline). רק MIF הצליחלתווך הגירת EPC מוגברת בריכוזים נמדד פיזיולוגית. הציטוקינים רקומביננטי דוללו במדיום מורעב בסרום MV2. התאים נדדו במשך 3 שעות דרך קרום 5 מיקרומטר. העמודות אלו מייצגות ערכים ממוצעים ± SEM (**: p <0.01 לעומת בינוני בסרום מורעב)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
החלק הראשון של מחקר כלל את הבידוד של EPCs אדם מהדם ההיקפי של מתנדבים בריאים כדי לאפשר הערכה מקיפה של הדם של חולים לאחר ניתוח לב. לכן, צנטריפוגה שיפוע צפיפות בוצעה על מנת להפריד את החלק היחסי PBMC מפלסמה, גרנולוציטים ו אריתרוציטים. כדי להסיר ביותר של טסיות זיהום, שבריר התא הזה היה נתון קצר ושטיפה איטית שלבים 29, 30. לאחר מכן, CD34 + תאים בודדו את החלק היחסי שנותר להפריד ובתאים מן לימפוציטים הנותרים, ומונוציטים. לבסוף, את השעית התא הייתה מתורבתת על מנות מצופות פיברונקטין בתוך מדיום גידול תא האנדותל, זמין מסחרי להפריד ובתאי אנדותל מ אחרים (אבי) תאים של השושלת מיאלואידית 3. ראוי לציין, זה נדון כי טסיות עשוי להראות מפורש פני תא CD34יון, מדי. למרות שמחקרים קודמים הראו עקדת כמה נוגדנים נגד CD34 כדי טסיות, זה יכול להיות פריט אמנות שימושית עקב צבירה של טסיות עם אחרים (CD34 חיובי) תאים 31, 32. עם זאת, רוב טסיות יכול להיות מופרד על ידי צעדי כביסה איטיים חזרו. לצד טסיות, המבשרים שלהם - megakaryocytes - מבטאי אנטיגן לתא אבות היווצרות הדם הזה עלול להיות נוכח דם היקפי, למרות שהם נמצאים בעיקר במח העצם 33, 34. יתר על כן, זה גם מתואר כי CD34 סמן תא השטח, להשתמש בפרוטוקול זה מתבטא ברמות נמוכות מאוד על תאי אנדותל בוגרים 35. לכן, חשוב לשקול זיהום אפשרי בזהירות על ידי טסיות / megakaryocytes או לתאי אנדותל בוגרים, כאשר לבודד EPCs. לפיכך, בשלב 2.6 הוא של שייכות מיוחדת במהלך isolation של EPCs להסיר טסיות.
כדי להבהיר את החשיבות של culturing התאים הבודדים על מנות מצופות פיברונקטין, אוכלוסיות תאים לאחר ימים ושבעה ימים של תרבות על פיברונקטין הושוו הוא עם מבחר CD34 חיובי קודם. ביום שני, פחות ממחצית התאים המבודדים הראתה ספיגה של acLDL וביטוי סימולטני של CD31 על פני השטח שלהם. יתר על כן, ביטוי פחות אינטנסיבי של שני סמנים על היסטוגרמות בנוגע אפשר היה לראות. נתונים אלה מראים כי שבעה ימים של תרבות על פיברונקטין במדיום תא ספציפי האנדותל נחוצים כדי לקבל EPCs מראה דפוסי ביטוי אנדותל אופייני. בשלב זה, יש חשיבות לשימוש ריכוז / כמות של פיברונקטין התקין. Wijelath ועמיתיו הראו בעבר כי פיברונקטין מקדם את הביטוי של דפוסים דמויי תא האנדותל, ככל הנראה בשילוב עם VEGF 36.
בחודש הבא stEP של הפרוטוקול, את החשיבות של CD34 + -selection של השעית התא נחקר, השוואת תאים מבודדים לאחר 7 ימים של תרבות על מנות מצופות פיברונקטין, עם ובלי קודם CD34 + -selection. כמות התאים חסרי סמנים הם (ספיגת acLDL וביטוי CD31) הייתה גבוהה בהרבה לאחר בידוד תא ללא CD34 קודם + -selection לעומת בידוד כולל שלב זה. מעניין, לאחר שבעה ימים של תרבות על פיברונקטין, תאים חסרי CD34 + -selection הראה אוכלוסיית תאים הומוגנית פחות, כפי שצוין על ידי ביטוי הומוגניות של CD31 בהשוואה לתאים, מבודדים עם CD34 + -selection. נתונים אלה מראים כי CD34 + -selection יש צורך לברר EPCs מ מונוציטים / מאקרופאגים אחרים. במהלך ההקמה בפרוטוקול זה, מצאנו כי CD34 + -selection במדיום MV2 על 37 מעלות צלזיוס מוביל לעלייה במספר התאים ששרדו, בהשוואה נמוך בהרבה temperatures, אשר צריך להיחקר בזהירות במחקרים עתידיים. אנו חייבים להודות שכאשר אנו מחיילים בפרוטוקול זה, דגירת הנוגדן במדיום מכיל סידן ב 37 ° C עלול להוביל לאינטראקציות הלא ספציפיים מחייב. בעתיד, מערכות חיץ חסרות סידן בטמפרטורות נמוכות צריכות להיבדק והקימו להימנע גורמים בלבול פוטנציאל זה.
יש לציין, במהלך הניתוח הראשוני שלנו של ניסויי נדידת תאים עם דגימות סרום, מדידות נערכו לראשונה באמצעות קורא microplate פלואורסצנטי calcein מכתים של התאים, כפי שתוארו לעיל עבור סוגי תאים שונים (תאי אנדותל וריד טבור אנושיים למשל, HUVEC) 37. ערכי ההכחדה השונים בין התאים עולים כי לא רק דגימות הסרום לבד, אלא גם המדיום כבר יש השפעה יוצאת דופן על הקרינה הנמדדת, אשר צריך להיחשב בזהירות. לכן, wדואר מותאם הפרוטוקול שלנו ועבר מערכת מדידה שבה התא ניתן לצפות באמצעות מיקרוסקופ אור נספר על ידי תוכנות אוטומטיות למחצה.
בעוד EPCs מהווים כ 0.1% של תאים בדם ההיקפי וקשה לבודד תאים ספציפיים אלה 38, מספר מרשים של מחקרים הצביעו על כך EPCs עשויה לספק השפעות מועילות ולשפר כלי הדם ברקמה לאחר אירועים איסכמיים בגפיים ובסופו של שריר הלב 39 , 40. עם זאת, זה עדיין אתגר מתמשך לתרגם ממצאים אלה לפועל קליני כדי להעריך את הרלוונטיות הקלינית שלה. הסיבות יכולות להיות בגלל ההשפעה המהותית של גורמים סביב ניתוח רבים על הפרשת chemoattractants השונה, אשר הוכחה בעבר 22, 41. לכן, בחלק השני של מחקר זה, את התפקיד של ג שונהytokines על ההגירה של EPCs בקביעה לי שריר לב / R הוערך. לכן, הריכוזים בסרום של ציטוקינים בחולים ניתוחי לב נמדדו. MIF, כמו גם CXCL12 ו CXCL8 הראה עליית תוך אופרטיבית משמעותית. כאשר תרגום ממצאים אלה חזרו לתוך הניסויים במבחנה, תוצאות הראו שנסיעה אין לא CXCL12- ולא השפעה בתיווך CXCL8 על גירת EPC בריכוזים הפיסיולוגיים נמדדו במבחנה. השימוש במודל בידוד EPC תאר ואת assay ההגירה עוקבת MIF זוהה כמתווך עיקרי של הגירת EPC 42. בהקשר זה, Kanzler et al. הפגינו מודל עכבר ניסיוני כי MIF ו VEGF לספק המשפיע ביותר על הגירה EPC תחת היפוקסיה 23. מעניין לציין, כי מדידות של VEGF מראות כי אין שינוי תוך אופרטיבי משמעותי בריכוזי דם VEGF, עלול לנבוע o מחייבf VEGF לבקשה סטנדרטית תוך ניתוחית של הפרין. לכן, MIF עשוי לשחק תפקיד מכריע בקרב כמוקינים angiogenic בגיוס EPCs בחולים ניתוחי לב ועשויה לפתוח ולתרום את תהליך ההחלמה לאחר שאני שריר הלב / R באמצעות סחר של EPCs לאתר הפציעה 43, 44 עם זאת, כפי רמות MIF עלה מיד אחרי שאני שריר הלב / R, הוא נשאר ספקולטיבי אם ההשפעה בתיווך MIF על גיוס EPCs עשוי להשפיע שיפוץ לב אנגיוגנזה, אשר יש השלכות משמעותיות במניעת אי ספיקת לב אחרי שאני שריר הלב / R 23. עם זאת, לפני קידום ניתוח כזה, חשוב עוד יותר לאפיין את תת-הסוגים השונים של EPCs ולהעריך התפקיד הפונקציונלי שלה בביולוגיה אנושית. בהקשר זה, בפרוטוקול הנוכחי מספק שיטה אמינה על איך לבודד EPCs מדם היקפי אנושי כדי לאפשר iTS אפיון מקיף נוסף במחקרים עתידיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים אין לי מה לחשוף.
Acknowledgments
יש המחברים לא בתודות.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibronectin | Biochrom AG | L7117 | Coating of T-75 flasks |
| Aqua ad iniectabilia | Fresenius Kabi | ||
| Endothelial cell growth medium MV2 | Promo Cell | C-22221 | |
| Endothelial cell growth medium MV2 SupplementMix | Promo Cell | C-39226 | |
| Ficoll-Paque plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | Density centrifugation |
| EasySep human CD34 positive Selection Kit | Stemcell Technologies | 18056 | Isolation of CD34+ cells |
| EasySep magnet | Stemcell Technologies | 18000 | |
| Accutase | Sigma-Aldrich | A6964-100ML | Detachment of cells |
| Corning HTS transwell 96 well permeable supports | Sigma-Aldrich | CLS3387-8EA | Migration system |
| Hoechst solution | ThermoFisher | 33342 | Staining of migrated cells |
| ImageJ | National institutes of health | xxx | Counting of migrated cells |
References
- Emontzpohl, C., et al. Key role of MIF in the migration of endothelial progenitor cells in patients during cardiac surgery. Int J Cardiol. 181C, 284-287 (2014).
- Smadja, D. M., et al. Interleukin 8 is differently expressed and modulated by PAR-1 activation in early and late endothelial progenitor cells. J Cell Mol Med. 13 (8B), 2534-2546 (2009).
- Asahara, T., et al. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science. 275 (5302), 964-967 (1997).
- Simons, D., et al. Hypoxia-induced endothelial secretion of macrophage migration inhibitory factor and role in endothelial progenitor cell recruitment. J Cell Mol Med. 15 (3), 668-678 (2011).
- Dernbach, E., et al. Antioxidative stress-associated genes in circulating progenitor cells: evidence for enhanced resistance against oxidative stress. Blood. 104 (12), 3591-3597 (2004).
- Yang, Z., et al. Paracrine factors secreted by endothelial progenitor cells prevent oxidative stress-induced apoptosis of mature endothelial cells. Atherosclerosis. 211 (1), 103-109 (2010).
- Asahara, T., Kawamoto, A., Masuda, H. Concise review: Circulating endothelial progenitor cells for vascular medicine. Stem Cells. 29 (11), 1650-1655 (2011).
- Schmidt-Lucke, C., et al. Reduced number of circulating endothelial progenitor cells predicts future cardiovascular events: proof of concept for the clinical importance of endogenous vascular repair. Circulation. 111 (22), 2981-2987 (2005).
- Yoder, M. C. Human endothelial progenitor cells. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (7), a006692 (2012).
- Ito, H., et al. Endothelial progenitor cells as putative targets for angiostatin. Cancer Res. 59 (23), 5875-5877 (1999).
- Hill, J. M., et al. Circulating endothelial progenitor cells, vascular function, and cardiovascular risk. N Engl J Med. 348 (7), 593-600 (2003).
- Yoder, M. C., et al. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109 (5), 1801-1809 (2007).
- Rohde, E., et al. Blood monocytes mimic endothelial progenitor cells. Stem Cells. 24 (2), 357-367 (2006).
- Rohde, E., et al. Immune cells mimic the morphology of endothelial progenitor colonies in vitro. Stem Cells. 25 (7), 1746-1752 (2007).
- Prokopi, M., et al. Proteomic analysis reveals presence of platelet microparticles in endothelial progenitor cell cultures. Blood. 114 (3), 723-732 (2009).
- Voyta, J. C., Via, D. P., Butterfield, C. E., Zetter, B. R. Identification and isolation of endothelial cells based on their increased uptake of acetylated-low density lipoprotein. J Cell Biol. 99 (6), 2034-2040 (1984).
- Koch, S., Claesson-Welsh, L. Signal transduction by vascular endothelial growth factor receptors. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (7), a006502 (2012).
- Hirschi, K. K., Ingram, D. A., Yoder, M. C. Assessing identity, phenotype, and fate of endothelial progenitor cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28 (9), 1584-1595 (2008).
- Hur, J., et al. Characterization of two types of endothelial progenitor cells and their different contributions to neovasculogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24 (2), 288-293 (2004).
- Tagawa, S., et al. Determination of Early and Late Endothelial Progenitor Cells in Peripheral Circulation and Their Clinical Association with Coronary Artery Disease. Int J Vasc Med. , 2015 (2015).
- Bernhagen, J., et al. MIF is a noncognate ligand of CXC chemokine receptors in inflammatory and atherogenic cell recruitment. Nat Med. 13 (5), 587-596 (2007).
- Stoppe, C., et al. Interaction of MIF Family Proteins in Myocardial Ischemia/Reperfusion Damage and Their Influence on Clinical Outcome of Cardiac Surgery Patients. Antioxid Redox Signal. 23 (11), 865-879 (2015).
- Kanzler, I., et al. Differential roles of angiogenic chemokines in endothelial progenitor cell-induced angiogenesis. Basic Res Cardiol. 108 (1), 310 (2013).
- Walenta, K. L., Bettink, S., Bohm, M., Friedrich, E. B. Differential chemokine receptor expression regulates functional specialization of endothelial progenitor cell subpopulations. Basic Res Cardiol. 106 (2), 299-305 (2011).
- Rassaf, T., Weber, C., Bernhagen, J. Macrophage migration inhibitory factor in myocardial ischaemia/reperfusion injury. Cardiovasc Res. 102 (2), 321-328 (2014).
- Stoppe, C., et al. High postoperative blood levels of macrophage migration inhibitory factor are associated with less organ dysfunction in patients after cardiac surgery. Mol Med. 18, 843-850 (2012).
- Amin, M. A., et al. Migration inhibitory factor mediates angiogenesis via mitogen-activated protein kinase and phosphatidylinositol kinase. Circ Res. 93 (4), 321-329 (2003).
- Kupatt, C., et al. Embryonic endothelial progenitor cells expressing a broad range of proangiogenic and remodeling factors enhance vascularization and tissue recovery in acute and chronic ischemia. FASEB J. 19 (11), 1576-1578 (2005).
- Colotta, F., et al. Expression of a monocyte chemotactic cytokine by human mononuclear phagocytes. J Immunol. 148 (3), 760-765 (1992).
- Casale, T. B., Kaliner, M. A rapid method for isolation of human mononuclear cells free of significant platelet contamination. J Immunol Methods. 55 (3), 347-353 (1982).
- Lewandowska, K., Kaplan, D., Husel, W. CD34 expression on platelets. Platelets. 14 (2), 83-87 (2003).
- Stellos, K., et al. Platelet-derived stromal cell-derived factor-1 regulates adhesion and promotes differentiation of human CD34+ cells to endothelial progenitor cells. Circulation. 117 (2), 206-215 (2008).
- Thornton, M. A., Poncz, M. In vitro expansion of megakaryocytes from peripheral blood hematopoietic progenitors. Methods Mol Med. 31, 337-345 (1999).
- Ivetic, N., et al. Producing megakaryocytes from a human peripheral blood source. Transfusion. 56 (5), 1066-1074 (2016).
- Friedrich, E. B., Walenta, K., Scharlau, J., Nickenig, G., Werner, N. CD34-/CD133+/VEGFR-2+ endothelial progenitor cell subpopulation with potent vasoregenerative capacities. Circ Res. 98 (3), e20-e25 (2006).
- Wijelath, E. S., et al. Novel vascular endothelial growth factor binding domains of fibronectin enhance vascular endothelial growth factor biological activity. Circ Res. 91 (1), 25-31 (2002).
- Hulkower, K. I., Herber, R. L. Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery. Pharmaceutics. 3 (1), 107-124 (2011).
- Yao, E. H., et al. Effects of the antioxidative beta-blocker celiprolol on endothelial progenitor cells in hypertensive rats. Am J Hypertens. 21 (9), 1062-1068 (2008).
- Takahashi, T., et al. Ischemia- and cytokine-induced mobilization of bone marrow-derived endothelial progenitor cells for neovascularization. Nat Med. 5 (4), 434-438 (1999).
- Kawamoto, A., et al. Therapeutic potential of ex vivo expanded endothelial progenitor cells for myocardial ischemia. Circulation. 103 (5), 634-637 (2001).
- Kim, B. S., et al. Myocardial Ischemia Induces SDF-1alpha Release in Cardiac Surgery Patients. J Cardiovasc Transl Res. 9 (3), 230-238 (2016).
- Frangogiannis, N. G., Smith, C. W., Entman, M. L. The inflammatory response in myocardial infarction. Cardiovasc Res. 53 (1), 31-47 (2002).
- Zernecke, A., Bernhagen, J., Weber, C. Macrophage migration inhibitory factor in cardiovascular disease. Circulation. 117 (12), 1594-1602 (2008).
- White, D. A., et al. Pro-inflammatory action of MIF in acute myocardial infarction via activation of peripheral blood mononuclear cells. PLoS One. 8 (10), e76206 (2013).
