Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

عزل الخلايا البطانية السلف من المتطوعين الأصحاء وإمكاناتهم الكثيرة تأثر عينات المصل بعد جراحة القلب

Published: February 14, 2017 doi: 10.3791/55192
Automatic Translation
1,2, 3, 4, 4, 1, 5,6, 1
1Department of Intensive Care Medicine, University Hospital Aachen, 2Institute of Biochemistry and Molecular Biology, University Hospital Aachen, 3Department of Radiology, German Cancer Research Center, 4Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, University Hospital Aachen, 5Department of Vascular Biology, Institute for Stroke and Dementia Research (ISD), Klinikum der Universität München, 6Deutsches Zentrum für Herz-/Kreislaufkrankheiten (DZHK), Munich Heart Alliance

Summary

الخلايا الاصلية البطانية (EPCS) تشارك بشكل حاسم في اتساع الأوعية الدموية في الأنسجة الدماغية. يصف هذا الأسلوب عزلة EPCS الإنسان من الدم المحيطي، وكذلك التعرف على إمكانات المهاجرة ضد عينات مصل الدم من المرضى لعمليات جراحية في القلب.

Abstract

ويتم تجنيد الخلايا الاصلية البطانية (EPCS) من نخاع العظام في ظل ظروف مرضية مثل نقص الأكسجة وتشارك بشكل حاسم في اتساع الأوعية الدموية في الأنسجة الدماغية. الأصل، وتصنيف وتوصيف EPCS معقدة. بالرغم من ذلك، تم إنشاء اثنين من أبرز أنواع فرعية من EPCS: ما يسمى ب "في وقت مبكر" EPCS (يشار لاحقا إلى المبكرة EPCS ع) EPCS وفي وقت متأخر من ثمرة (أواخر EPCS). ويمكن تصنيفها حسب الخصائص البيولوجية، فضلا عن ظهورها في المختبر خلال الثقافة. في حين تظهر EPCS "الأولى" في أقل من أسبوع بعد ثقافة الخلايا وحيدة النواة المشتقة من الدم الطرفية في EC-محددة وسائل الإعلام، EPCS في وقت متأخر من ثمرة يمكن العثور على بعد 2-3 أسابيع. وقد تم الاعتراف EPCS في وقت متأخر من ثمرة أن تشارك مباشرة في اتساع الأوعية الدموية، وذلك أساسا من خلال قدرتها على التمايز إلى خلايا البطانية ناضجة، في حين أن "في وقت مبكر" EPCS تعبر عن العوامل عائية المختلفة وendogenالبضائع الأوس لتعزيز الأوعية الدموية بطريقة نظير الصماوي. خلال عضلة القلب نقص التروية / ضخه (I / R)، عوامل مختلفة تتحكم صاروخ موجه من EPCS إلى مناطق تكوين الأوعية الدموية.

بلعم عامل الهجرة المثبطة (MIF) هو الموالية للالتهابات، وأعرب عن بتواجد مطلق خلوى مثل chemokine وصفت مؤخرا على العمل المنظم الرئيسي اعتبارا من الهجرة EPCS في تركيزات الفسيولوجية 1. ومن المثير للاهتمام، يتم تخزين MIF في برك داخل الخلايا ويمكن بسرعة أن تطلق في مجرى الدم بعد عدة مؤثرات (مثل احتشاء عضلة القلب).
يصف هذا البروتوكول وسيلة لعزل موثوقة وثقافة المبكر EPCS من البالغين الدم المحيطي البشري استنادا إلى التحديد-CD34 الإيجابي مع الثقافة اللاحقة في المتوسط تحتوي على عوامل النمو البطانية على لوحات فبرونيكتين المغلفة للاستخدام في فحوصات في المختبر الهجرة ضد عينات مصل من المرضى لعمليات جراحية في القلب. علاوة على ذلك،ويتجلى تأثير الهجرة من MIF على الكيميائي من EPCS مقارنة مع السيتوكينات تحفيز الأوعية الدموية الأخرى المعروفة.

Introduction

الخلايا الاصلية البطانية (EPCS) تنتشر في دم الإنسان ولها القدرة على التمايز إلى خلايا بطانة الأوعية الدموية 2. يشاركون في تكون الأوعية وقادرون على التقليل من الأضرار الناجمة عن التهاب ونقص التروية / ضخه (I / R) إصابات بطرق مختلفة 3، 4. على سبيل المثال، EPCS تظهر مستويات مرتفعة من الانزيمات المضادة للأكسدة داخل الخلايا مثل الكاتلاز، البيروكسيديز الجلوتاثيون أو سوبر أكسيد ديسميوتاز المنغنيز (MnSOD) 5. المقاومة مرتفعة ضد الاكسدة تسمح EPCS للعمل في microenvironments مع الأنواع مرتفعة الاكسجين التفاعلية (ROS) بعد الإصابة الدماغية 6. وأشارت دراسات سابقة إلى أن عدد من EPCS قد تكون مرتبطة إلى إصلاح الأوعية الدموية وانخفاض عدد تعميم EPCS يتوقع وقوع أحداث القلب والأوعية الدموية 7،الطبقة = "XREF"> 8. ومع ذلك، لم يتم العثور على تعريف واضح لEPC حتى الان. حتى الآن، ليس هناك أية علامة سطح الخلية المحددة أو النمط الظاهري ثابت لEPCS وهذه الخلايا نادرة جدا في الدم المحيطي 9. وينبغي النظر في EPC الإنسان باعتبارها الخلية تعميم لديهم القدرة على المساهمة في إعادة بناء البطانة الجرحى والهياكل الأوعية الدموية الجديدة.

طريقة واحدة لعزل وتوصيف EPCS هي من خلال الانضمام إلى فبرونيكتين. وبالتالي، يتم استخدام قدرة هذه الخلايا لإظهار التصاق متفوقة على الفيبرونكتين أطباق المغلفة مقارنة الكولاجين من صنف 1، على سبيل المثال 3 و 10 و 11. ومع ذلك، وجد آخرون أن خلايا الطلاء وحيدات النوى على الأطباق المغلفة فبرونيكتين دون أي خطوة تنقية السابقة أو يؤدي إلى مزيد من المستعمرات بما في ذلك الخلايا الاولية الدم النخاعي، وحيدات، والخلايا اللمفية تي 12، 13، 14. وعلاوة على ذلك، في هذه الحالة، قد الصفائح الدموية تلوث الخلية وحيدة النواة (MNC) جزء، وبالتالي نقل البروتينات غشاء البلازما إلى أي خلايا ملتصقة 15.

وبالاضافة الى توصيف من خلال فحوصات في المختبر الالتصاق، يتم استخدام مزيج من مختلف علامات سطح الخلية لوصف نوع من الخلايا تعتبر الاتفاقية الأوروبية. في هذه الحالة، بعد التصاق بوساطة فبرونيكتين، والخلايا يتم تحليل بشأن سمات مثل البطانية الخاصة بهم. في هذه العملية، وهما البطانية علامات الخلايا المرتبطة، الأسيتيل-البروتين الدهني منخفض الكثافة (acLDL) وعامل النمو البطاني الوعائي مستقبلات 2 (VEGFR-2، KDR)، تلعب دورا في ذلك. وقد تبين أن الخلايا البطانية والبلاعم لاتخاذ خصيصا acLDL في عملية تسمى "طريق خلية زبال" 16. بروتين آخر علامة هو KDR كما مستقبلات عامل نمو بطانة الاوعية الرئيسي على البطانيةخلايا 17. لكن، وكما EPCS بشكل عام يتم تربيتها في وسائل الإعلام تستكمل مع عوامل النمو البطانية والجنين مصل العجل، فمن الممكن أن الضامة، والتي قد أيضا تم عزلها عن طريق الخطأ، يحمل ملف تعريف علامة تشبه البطانية. كما هو موضح سابقا، إذا مثقف في المتوسط مكيفة البطانية، الضامة تعبر عن البروتينات "، البطانية محددة" (18).

بشكل عام، هناك نوعان من EPCS ضمن أكثر أنواع فرعية، والتي يمكن أن تكون موجودة في الدم أو يكون المثقف في المختبر. تظهر في وقت متأخر من ثمرة EPCS (في وقت متأخر من EPCS) بعد 2-3 أسابيع من الثقافة. يتم دمج هذه الخلايا بشكل أسرع إلى أحادي الطبقة من الوريد السري الخلايا البطانية الإنسان ويمكن أن تشكل الأنابيب الشعرية (19). الى جانب ذلك، ما يسمى ب "المبكر EPCS" تدور في الدم لمدة أسبوع واحد والتصرف بطريقة أكثر سلبية من خلال تقديم الجزيئات عائية، مثل نمو بطانة الأوعية الدمويةعامل (عامل نمو بطانة الاوعية)، أو CXCL8 19. المرضى الذين يعانون من مرض الشريان التاجي (CAD) وجود كميات أقل بكثير من EPCS المبكرة مقارنة مع مجموعة السيطرة من دون 20 CAD. ومن المثير للاهتمام، وأظهرت نفس المجموعة كميات أكبر من وقت متأخر من EPCS مقارنة مع مجموعة السيطرة. وأظهرت دراسة أخرى أن المبكر EPCS حماية EPCS متباينة من الخلايا تحت ظروف الأكسدة بطريقة نظير الصماوي 6. لذلك، EPCS مبكرة قد توفر آثار وقائية ذات الصلة من خلال هجرة الخلايا الأخرى بطريقة صناعة السيارات في أو نظير الصماوي في الدم المحيطي.

يصف هذا البروتوكول وسيلة لتنقية EPCS المبكرة من خلال عزل لأول مرة PBMC-جزء من الدم المحيطي البشري وبالتالي عزل CD34 + الخلايا من PBMC-جزء لمسح هذا تعليق خلية من الخلايا غير المرغوبة. CD34 هو علامة، والذي يستخدم لعزل الخلايا الجذعية المكونة للدم الإنسان 9 + يتم تربيتها على الأسطح زراعة الأنسجة المغلفة فبرونيكتين. بعد ثلاثة أيام، يتم تغيير المتوسطة، وبالتالي فقدان كل الخلايا غير ملتصقة. وأخيرا، ملطخة EPCS معزولة للتحقق من امتصاص acLDL وجود KDR كما البطانية خلية علامة باستخدام مضان تنشيط الخلايا الفرز (FACS). كما علامة إضافية، قمنا بتحليل الصفائح الدموية البطانية جزيء التصاق الخلية (PECAM-1، CD31)، والذي يحدث أيضا على الخلايا البطانية.

ترميم الأنسجة عضلة القلب التالفة أو محتشية خلال تعزيز توظيف EPCS ينتمي إلى استراتيجيات العلاج التحقيق بشكل مكثف في أمراض القلب والأوعية الدموية. ومع ذلك، فإن ترجمة النتائج التجريبية في الممارسة السريرية لا تزال صعبة، نظرا للتفاعل الخلوي تعقيدا في جسم الإنسان خلال مختلف الظروف المرضية. وعلاوة على ذلك، وأنا عضلة القلب / إصابات R تؤدي إلى إفراز مفرط من مختلف السيتوكينات والهرمونات والقوات المسلحة الكونغولية النمو الاختصاصات، التي تسيطر على صاروخ موجه من EPCS إلى مناطق تكوين الأوعية الدموية 13. كما هو مبين بالفعل، CXCL8، المستمدة الخلايا اللحمية عامل 1α (SDF-1α، CXCL12)، وزيادة عامل نمو بطانة الاوعية والبلاعم الهجرة عامل مثبط (MIF) بشكل كبير في عينات مصل التالية عضلة القلب I / R إصابة 1. ومن بين هذه العوامل، MIF هو مثل chemokine خلوى عديد المظاهر ذات الخصائص الغالب الموالية للالتهابات. وعلى النقيض من الاسم التاريخي لها، MIF وظائف المؤيدة للهجرة، بوصفها chemokine صحيح على مختلف أنواع الخلايا 1 و 21 و 22. وقد تم ربط عمليات تجنيد خلية MIF بوساطة لمستقبلات chemokine CXCR2 وCXCR4، الذي يربط MIF لوينشط بطريقة غير المشابهة 21. وتجدر الإشارة، EPCS تعبر عن كل من هذه المستقبلات على سطوحها، والتي أصبحت بالإضافة إلى ذلك يصل ينظم تحت ظروف نقص الأوكسجينالحمار = "XREF"> 23، 24. وعلاوة على ذلك، تشير الأدلة المتراكمة التي MIF له التأثير الكلي القلب واقية أثناء I / R إصابة القلب 22 و 25 و 26. وفي هذا السياق، فقد تبين أيضا أن MIF قد دعم اتساع الأوعية الدموية أثناء الإجهاد ميتة التي هي ذات أهمية خاصة، عند النظر في آليات استرداد محدودة من عضلة القلب المصاب (27). في الدراسات المختبرية والتجارب السابقة في نماذج الماوس ما قبل السريرية قدمت أول دليل حول دور MIF في EPCS توظيف 4. وتجدر الإشارة، MIF أيضا هو بروتين البضائع بارز من EPCS التي قد يتم الافراج خلال تجنيد EPCS داخل مواقع الدماغية 28. ومع ذلك، لا تزال الدراسات في المرافق الصحية ولا سيما في مقارنة مع غيرها (عائية) السيتوكينات المصل بعيد المنال.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم الحصول على الدم لعزل EPCS من المتطوعين الأصحاء بعد الموافقة المسبقة وفقا للجنة الأخلاقيات المحلية. تم الحصول على عينات من مصل الدم المستخدمة في المقايسات الهجرة من المرضى الذين خضعوا لجراحة القلب التقليدية مع استخدام المجازة القلبية الرئوية (بروتوكول قرطاجنة). وكانت معايير الاستبعاد عمليات الطوارئ، الحمل المعروفة أو المشتبه بهم، patient`s سن أقل من 18 عاما، وعدم الحصول على الموافقة المسبقة. واستخلصت عينات مصل بالإضافة إلى القياسات الدورية في العيادات (فورا قبل الجراحة ومباشرة بعد ضخه عضلة القلب / افتتاح الأبهر عبر الشبك) وتخزينها بعد ذلك في -80 درجة مئوية حتى التحليل النهائي. وافقت (لجنة الأخلاقيات، جامعة آخن) مجلس المراجعة المؤسسية هذه الدراسة. وأظهر المرضى متوسط ​​أعمارهم 68.6 عاما ومتوسط ​​وزن 81.7 كجم. وتشمل أمراض موجودة من قبل: ارتفاع ضغط الدم (65٪)، وأمراض الرئة المزمنة (19٪)، اعتلال الشرايين القلبية إضافي (16٪)، والخلل الوظيفي الدماغي (6٪)، والذبحة الصدرية غير المستقرة (3٪)، واحتشاء عضلة القلب مؤخرا (28٪ في غضون 90 د)، مرض الكلى المزمن (14٪)، وأمراض الكبد (2٪) والسكري (34٪).

1. طلاء T75 قارورة:

  1. إعداد 5 مل من محلول فبرونيكتين (1 ملغ فبرونيكتين الإنسان مخففة في 15 مل من الماء عالى النقاء) في قارورة T75.
  2. إضافة الحل إلى قارورة T75 والانتظار حتى يتم تبخر الماء. لتجنب أي انقطاع غير الضرورية أثناء عملية العزلة بسبب التبخر، نفذ هذه العملية في وقت مبكر (على سبيل المثال بين عشية وضحاها) وفي درجة حرارة الغرفة. هذا الحل يعطي 4.44 ميكروغرام فبرونيكتين / سم 2.
  3. إعداد البطانية نمو الخلايا المتوسطة MV2 من خلال استكمال القاعدية MV2 المتوسطة مع الملاحق عامل النمو المقدمة من قبل الشركة المصنعة.

2. عزل الخلايا البطانية السلف (EPCS) من 60 مل الدم:

ملاحظة: كما في-CD34 إيجابي اختيار كوكتيلالثانية هي حبات مغناطيسية المتاحة تجاريا في مجموعة مختارة مجتمعة، لا توجد تركيزات المقدمة من قبل الشركة المصنعة. ومع ذلك، نحو 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة تكفي لمعالجة ما يصل إلى 5 × 10 8 خلايا. والمخفف حبات مغناطيسية في الماء، ديكستران المغلفة وحول 5،000x أصغر مقارنة مع حبات أخرى متاحة تجاريا. لمزيد من المعلومات، راجع تعليمات manufacturer's.

  1. خلط الدم (مع أو بدون مضادات التخثر) 1: 1 مع الكالسيوم 2+ -Mg 2+ خالية من برنامج تلفزيوني.
  2. إضافة 15 مل من كثافة حل التدرج في أنبوب 50 مل. لمزيد من المعلومات، راجع تعليمات manufacturer's.
  3. طبقة ببطء الدم المخفف على رأس من الحل التدرج الكثافة.
  4. عينات الطرد المركزي في 2500 x ج لمدة 30 دقيقة مع تسارع بطيء ودون الكبح.
  5. جمع بعناية طبقة معطف الشهباء من كل أنبوب (الشكل 1) باستخدام ماصة بلاستيكية معقمة ووضعها في أنبوب آخر.تجنب جمع من الحل التدرج الكثافة. العائد PBMC المتوقع هو حوالي 3-4 × 10 6 خلية / مل دم.

شكل 1
الشكل 1: التدرج الكثافة الطرد المركزي من Bbuffy معطف على Ficoll الحل. أظهرت هو نتيجة الطرد المركزي التدرج الكثافة في 2500 x ج لمدة 30 دقيقة على حل التدرج الكثافة. يصور هي كريات الدم الحمراء والمحببة (الحمراء)، وجزء الخلية وحيدة النواة (الطبقة البيضاء)، البلازما (الصفراء)، والحل التدرج الكثافة (بيضاء). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. تمييع الطرفية وحيدة النواة خلايا الدم جزء لا تقل عن 3 مجلدات من برنامج تلفزيوني وتخلط. أجهزة الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة في 200 × ز.
  2. كرر الخطوة 2.6 ضعف. </ لى>
  3. نضح طاف و resuspend بيليه خلية في 5 مل MV2 المتوسطة.
  4. إضافة 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة CD34 البشري (كافية لمعالجة ما يصل إلى 5 × 10 8 خلايا) في استخدام معطف الشهباء وتناوب لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2.
  5. إضافة 50 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي المغلفة ديكستران في استخدام معطف الشهباء وتناوب لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2.
  6. بعد الحضانة، ونقل تعليق لأنابيب FACS بحد أقصى 3 مل في كل أنبوب. سوف كميات أكبر لا يجوز مع المغناطيس.
  7. إدراج نظام مراقبة الأصول الميدانية أنبوب (ق) في المغناطيس (ق) والانتظار لمدة 5 دقائق.
  8. تجاهل طاف دون سحب أنابيب FACS من المغناطيس.
  9. resuspend الخلايا في كل أنبوب FACS مع 3 مل MV2 المتوسطة خارج المغناطيس.
  10. كرر الخطوات 2،12-2،14 مرتين.
  11. سحب أنابيب FACS من المغناطيس وresuspend الخلايا في 3 مل MV2 المتوسطة.
  12. نقل تعليق خلية إلى ما قبل المغلفة T75 وlasks وإضافة 17 مل MV2 المتوسطة في قارورة.
    ملاحظة: يجب تغيير المتوسطة بعد 3 أيام. بعد أسبوع واحد، والخلايا تظهر هياكل مثل مغزل (الشكل 2) وتكون جاهزة للاستخدام. ليتجاهل من العزلة انظر الشكل 3.

الشكل 2
الشكل 2: صورة مجهرية من EPCS المعزولة. أظهرت هو صورة ممثل معزولة المبكر EPCS في قارورة T75 قبل مفرزة. الظاهر هو هيكل مثل مغزل من EPCS. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل (3): مخطط انسيابي عرض إجراء EPC العزلة. صورت هو مخطط، وتظهرجي الخطوات واحدة من البروتوكول EPC العزلة. لبروتوكول أكثر تفصيلا انظر القسم 2 في قسم البروتوكول.

3. الهجرة الفحص

  1. إزالة المتوسطة من EPCS في قارورة T75.
  2. يغسل مع 5 مل برنامج تلفزيوني عن طريق هز بعناية.
  3. إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 5 مل من محلول التجارية خلية مفرزة. انتظر حتى يتم فصل الخلايا (الاختيار تحت المجهر). تسريع مفرزة من خلال استغلال بعناية أسفل القارورة.
  4. عندما يتم فصل الخلايا، وبسرعة إضافة 5 مل من MV2 المتوسطة كاملة ونقل تعليق الخلية في أنبوب آخر.
  5. أجهزة الطرد المركزي في 2000 x ج لمدة 5 دقائق.
  6. و resuspend الخلايا في 5-10 مل برنامج تلفزيوني وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى في 2000 x ج لمدة 5 دقائق.
  7. كرر الخطوة 3.6.
  8. resuspend الكرية خلية في MV2 المتوسطة المتعطشة (50،000 الخلايا في هناك حاجة إلى 75 ميكرولتر لكل بئر التهجير).
    ملاحظة: أي نظام الهجرة هناك حاجة تعتمد على نوع من الخلايا والفحص. هناك فرق بأقطار erent المسام والأحجام لوحة (عدد الآبار). لEPCS حجم المسام من 5 ميكرون في 96 نظام جيد هو الأمثل.
  9. إعداد لوحة الهجرة وذلك بإضافة 235 ميكرولتر من عينة مصل الدم (المصل المخفف 1: 5 في MV2 تجويع المتوسطة) في مجلس النواب (الشكل 4).

الشكل (4)
الشكل 4: الهجرة الفحص في غرفة بويدن التعديل. أظهرت هو التصميم العام للغرفة بويدن تعديلها. يشار إلى أن إدراج ثقافة خلية (= الغرفة العليا) في الأزرق الداكن، وإدراجها في مجلس النواب. أسفل (ولكن ليس على الحائط) من هذه إدراج يمثل نظام التصفية بما في ذلك المسام. (أ) يبين الإعداد في نقطة زمنية الصفر. (ب) بعد نقطة زمنية محددة، يتم ترحيل الخلايا من خلال تصفية نحو التحفيز.fig4large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. إضافة إدراج قريبا مضيفا قبل حل الخلية.
  2. إضافة 75 ميكرولتر من محلول الخلية (= 50،000 الخلايا) في مجلس الشيوخ.
  3. دع EPCS الهجرة لمدة 3 ساعات في 37 درجة مئوية، وثاني أكسيد الكربون 5٪ 2 (وقت الهجرة يعتمد على نوع من الخلايا والنظام).
    1. لتجنب المصل المصنوعات اليدوية لصناعة السيارات في مضان، تحديد خلايا هاجر من التقاط الصور من البئر تحت المجهر وعدد الخلايا باستخدام برنامج شبه الآلي "يماغيج".
  4. إزالة الغرفة العليا (التي تحتوي على جميع الخلايا غير ترحيلها).
  5. إضافة 70 ميكرولتر 3.6٪ محلول امتصاص العرق، بما في ذلك هويشت صبغ (المخفف 1: 1000). ويمكن تخزين لوحة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 بين عشية وضحاها.
  6. أجهزة الطرد المركزي لوحة قريبا للحصول على كل الخلايا في المستوى البؤري نفسها في 2000 x ج لمدة 1-2 دقيقة.
  7. تأخذ 5 صور في ثالذراع (الشكلان 5 و 6) مع التكبير 100X.

الرقم 5
الرقم 5: مخطط عرض الموقف من التقاط الصور. مخطط يصور الموقف من الصور التي التقطت خمسة، والتي هي بحاجة لتحديد خلايا هاجر، فيما يتعلق أيضا. تؤخذ الصور لعدد الخلايا وحساب متوسط ​​قيمة لكل جيدا. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (6)
الشكل 6: صورة مجهرية لالكمي الخلية. أظهرت هو صورة تمثيلية، الذي اتخذ الكمي الخلية. كانت ملطخة الخلايا وثابتة باليودنانوغرام هويشت صبغ في 3.6٪ امتصاص العرق. النقاط تمثل ثابتة وملطخة الخلايا الاولية البطانية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. عد الخلايا هاجر باستخدام البرمجيات الآلي شبه "يماغيج" من قبل المعهد الوطني للصحة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

توصيف عزل الخلايا البطانية السلف

أولا، تم التحقق من امتصاص acLDL، وكذلك التعبير عن KDR، وCD31 على سطح السكان خلية معزولة. كما يظهر 7A الشكل، أظهرت 85.1٪ من EPCS معزولة على امتصاص acLDL وأعرب CD31. الأرقام 7B و7C مزيد يبرهن على وجود توزيع متجانس من كلا علامات، على الرغم من أنه يبدو أن هناك عدد سكانها أقل، السلبي لكلا علامات. في الخطوة الثانية، تم إجراء تحليل FACS من acLDL في تركيبة مع KDR. ويبين الشكل 8A أن أكثر من 80٪ من الخلايا المعزولة وأظهرت لامتصاص acLDL والتعبير عن KDR على سطحها. الأرقام 8B و8C تظهر تجانس هذه العلامات.

للتحقق من importanc(ه) من الأطباق المغلفة فبرونيكتين خلال فترة والثقافة، والمقارنة بين العلامات الثلاث بين الخلايا المعزولة بعد يومين من الثقافة على سطح فبرونيكتين المغلفة مع EPCS معزولة بعد سبعة أيام من الثقافة على الأطباق المغلفة فبرونيكتين (كما ورد في بروتوكول لدينا) وقد أجريت، سواء مع CD34 السابق + -الاختيار. كما هو مبين في الشكل 9A، وأظهرت٪ فقط 46.4 الخلايا لمدة يومين في تربيتها على امتصاص acLDL فضلا عن التعبير عن CD31 على سطحها، مقارنة ب 85٪ من الخلايا بعد سبعة أيام من الثقافة على فبرونيكتين. وعلاوة على ذلك، رسوم بيانية (أرقام 9B و9C) تظهر كثافة أقل من كلا علامات بعد يومين من ثقافة مقارنة مع سبعة أيام (أرقام 7B و7C). وينطبق الشيء نفسه على مزيج من علامات acLDL وKDR. بعد يومين من الثقافة على فبرونيكتين، وأظهرت٪ فقط 68.0 من كل الخلايا على امتصاص acLDL وكذلك تعبيرا عن KDR على سطحها (الشكلالصورة 10A-10C). بعد سبعة أيام من الثقافة على فبرونيكتين، أظهرت 83.6٪ من الخلايا على امتصاص acLDL والتعبير عن KDR على سطحها (أرقام 8A-8C).

في الخطوة التالية، تم تقييم أهمية CD34 + -الاختيار خلال عزل EPCS. ولذلك، الخلايا المحددة وفقا لهذا البروتوكول، بما في ذلك الكثافة الطرد المركزي التدرج وسبعة أيام الثقافة على فبرونيكتين، ولكن الذي غاب عن CD34 + تم عزل -الاختيار. كما هو مبين في الشكل 10A، أكثر من 18٪ من مجموع خلايا معزولة تفعل لا صريح CD31 ولا تظهر على امتصاص acLDL، مقارنة مع أقل من 8٪ بعد CD34 + -الاختيار، والتي تظهر على التعبير CD31 وامتصاص acLDL (الشكل 7A) . وبالإضافة إلى ذلك، أرقام 11B وعرض 11C أن الخلايا المعزولة هي غير متجانسة للغاية فيما يتعلق بكل من علامات مقارنة المتعلقة و7C تظهر نفس علامات في السكان الخلية مع CD34 السابق + -الاختيار.

مستويات مصل خلوى أثناء جراحة القلب

للتعرف على تأثير جراحة القلب التالية عضلة القلب I / R على تركيزات تعميم مستويات المصل من MIF، CXCL12، CXCL8 وعامل نمو بطانة الاوعية، واستخلصت عينات مصل الدم قبل وداخل الجراحة لتحليلها لاحقا من قبل ELISA متوفرة تجاريا (الشكل 12) . وأظهرت مستويات المصل MIF زيادة جراحة داخلية كبيرة مقارنة مع قيم خط الأساس (100.3 نانوغرام / مل مقابل 127.4 نانوغرام / مل، ع = 0.027). وبالمثل، أظهرت مستويات CXCL12 زيادة كبيرة في مصل الدم أثناء الجراحة (0.101 نانوغرام / مل مقابل 0.198 نانوغرام / مل، ع = 0.011). على غرار MIF وCXCL12، CXCL8 زيادة كبيرة خلال عملية جراحية (0.15 نانوغرام / مل مقابل 0.3 نانوغرام / مل، ع = 0.022). في تتمةراست، لم تركيزات VEGF لا تظهر أي تغييرات كبيرة خلال فترة المراقبة (0.154 نانوغرام / مل مقابل 0.134 نانوغرام / مل، ع = 0.583) 1.

القدرة هجرة الخلايا البطانية السلف

للتحقيق في تأثير مباشر من عينات المصل patients' وفيه يرد السيتوكينات / كيموكينات / العوامل عائية على الهجرة EPC، وهو خارج الحي فحص الترحيل باستخدام عينات مصل الدم، والتي وضعت قبل وأثناء الجراحة، تم تنفيذ. تم عزل EPCS من المتطوعين الأصحاء. كما هو مبين في الشكل 13، ومعدل الهجرة EPC زيادة كبيرة نحو العينات المأخوذة داخل الجراحة مقارنة العينات التي أخذت الجراحة قبل (+ 35٪ بالمقارنة مع خط الأساس، ع = 0.047).

منذ أظهرت دراسات سابقة بالفعل أن I / R يتسبب في إفراز بغازيأجريت السيتوكينات األطراف التي تعدل الكيميائي الكريات البيض والهجرة، فحوصات الترحيل باستخدام هذه chemoattractants المحتملة، بما في ذلك MIF، CXCL12، CXCL8، وعامل نمو بطانة الاوعية. للحصول على فهم أفضل لتأثير هذه السيتوكينات على تجنيد EPC في الجسم الحي، إضافية في تجارب الهجرة المختبر، وتطبيق التركيزات المقاسة من الناحية الفسيولوجية من السيتوكينات المذكورة أعلاه إلى مجلس النواب للهجرة أجريت الأجهزة أيضا.

باسم / مل تم قياس تركيزات مصل MIF بين 100 و 130 نانوغرام (الشكل 12)، تركيز 100 نانوغرام / مل من المؤتلف MIF تم استخدامه، مما أدى إلى زيادة> 6 أضعاف في الهجرة EPC مقارنة بالمجموعة الضابطة المتوسطة ( الشكل 14). في المقابل، كانت تركيزات مصل CXCL12، CXCL8، وعامل نمو بطانة الاوعية في نطاق 150-300 غ / مل. وتجدر الإشارة، فإن هذه التركيزات لا توسط أي تأثير على الهجرة EPC في المختبر(الشكل 14). ولذلك فمن المتصور أن من بين هذه السيتوكينات أربعة، MIF يسلك أقوى تأثير نسبي على الهجرة EPC في الجسم الحي 1.

الرقم 7
الرقم 7: تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية من EPCS المعزولة في يوم 7. (أ) أظهرت هو امتصاص acLDL وCD31 التعبير سطح الخلية من EPCS معزولة بعد CD34 + اختيار والفترة الثقافة 7 أيام على الأطباق المغلفة فبرونيكتين. غادر العلوي: خلايا تظهر امتصاص acLDL، ولكن لا تعبر عن CD31. الحق العلوي: تظهر خلايا امتصاص acLDL وسرعة CD31. أسفل اليسار: تظهر خلايا أي امتصاص acLDL ولا تعبر عن CD31. أسفل اليمين: تظهر خلايا أي امتصاص acLDL، ولكن التعبير عن CD31. (ب) يظهر هو الرسم البياني للacLDL-PE مترافق بعد امتصاص EPCS معزولة. (ج) يظهر هو الرسم البياني للFITC-حرف عطفugated CD31 الأجسام المضادة بعد ملزم لCD31 سطح الخلية من EPCS معزولة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 8
الرقم 8: تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية من EPCS المعزولة في يوم 7. (أ) أظهرت هو امتصاص acLDL وKDR التعبير سطح الخلية من EPCS معزولة بعد CD34 + اختيار والفترة الثقافة 7 أيام على الأطباق المغلفة فبرونيكتين. غادر العلوي: خلايا تظهر امتصاص acLDL، ولكن لا تعبر عن KDR. الحق العلوي: تظهر خلايا امتصاص acLDL وسرعة KDR. أسفل اليسار: تظهر خلايا أي امتصاص acLDL ولا تعبر عن KDR. أسفل اليمين: تظهر خلايا أي امتصاص acLDL، ولكن تعبر عن KDR. (ب) يظهر هو الرسم البياني للacLDL-PE مترافق بعد امتصاص EPCS معزولة. (ج) يظهر هوالرسم البياني لمترافق FITC الأجسام المضادة KDR بعد ملزم لKDR سطح الخلية من EPCS معزولة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 9
الرقم 9: تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية من EPCS المعزولة في يوم 2. (أ) أظهرت هو امتصاص acLDL وCD31 التعبير سطح الخلية من EPCS معزولة بعد CD34 + اختيار والفترة الثقافة 2 يوم على الأطباق المغلفة فبرونيكتين. غادر العلوي: خلايا تظهر امتصاص acLDL، ولكن لا تعبر عن CD31. الحق العلوي: تظهر خلايا امتصاص acLDL وسرعة CD31. أسفل اليسار: تظهر خلايا أي امتصاص acLDL ولا تعبر عن CD31. أسفل اليمين: تظهر خلايا أي امتصاص acLDL، ولكن التعبير عن CD31. (ب) يظهر هو الرسم البياني للacLDL-PE مترافق بعد امتصاص EPCS معزولة. ( الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 10
الشكل 10: تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية من EPCS المعزولة في يوم 2. (أ) أظهرت هو امتصاص acLDL وKDR التعبير سطح الخلية من EPCS معزولة بعد CD34 + اختيار والفترة الثقافة 2 يوم على الأطباق المغلفة فبرونيكتين. غادر العلوي: خلايا تظهر امتصاص acLDL، ولكن لا تعبر عن KDR. الحق العلوي: تظهر خلايا امتصاص acLDL وسرعة KDR. أسفل اليسار: تظهر خلايا أي امتصاص acLDL ولا تعبر عن KDR. أسفل اليمين: تظهر خلايا أي امتصاص acLDL، ولكن تعبر عن KDR. (ب) يظهر هو الرسم البياني للacLDL-PE مترافق بعد امتصاصبواسطة EPCS معزولة. (ج) يظهر هو الرسم البياني للFITC مترافق الأجسام المضادة KDR بعد ملزم لKDR سطح الخلية من EPCS معزولة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 11
الشكل 11: تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية من EPCS المعزولة في يوم 7. (أ) أظهرت هو امتصاص acLDL وCD31 التعبير سطح الخلية من EPCS معزولة دون CD34 السابق + الاختيار، ولكن بما في ذلك الفترة الثقافة 7 أيام على الأطباق المغلفة فبرونيكتين. غادر العلوي: خلايا تظهر امتصاص acLDL، ولكن لا تعبر عن CD31. الحق العلوي: تظهر خلايا امتصاص acLDL وسرعة CD31. أسفل اليسار: تظهر خلايا أي امتصاص acLDL ولا تعبر عن CD31. أسفل اليمين: تظهر خلايا أي امتصاص acLDL، ولكن التعبير عن CD31. (ب) كما هو موضحهو الرسم البياني للacLDL-PE مترافق بعد امتصاص EPCS معزولة. (ج) يظهر هو الرسم البياني من الأجسام المضادة CD31 FITC مترافق بعد ملزم لCD31 سطح الخلية من EPCS معزولة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 12
الشكل رقم 12: مستويات مصل خلوى أثناء جراحة القلب. قياس تركيزات مصل CXCL8، VEGF، CXCL12، وMIF من المرضى الذين خضعوا لجراحة القلب باستخدام ELISA. أظهرت هي القيم يعني من قبل العمليات مقارنة تركيزات داخل المنطوق ± SEM (*: ص <0.05، مقابل ما قبل-OP)

الرقم 13
الرقم 13: أنان المختبر هجرة EPCS نحو مصل المريض. أظهرت هو الزيادة داخل المنطوق في الهجرة EPC من المتطوعين الأصحاء نحو عينات مصل الدم من المرضى، الذين خضعوا لجراحة القلب. تم إضافة 50،000 الخلايا لكل بئر في MV2 مصل المتوسطة المتعطشة إلى الغرفة العليا من نظام Transwell. وكانت مخففة عينات مصل في مجلس النواب 1: 5 مع نفس المتوسطة. الخلايا هاجرت لمدة 3 ساعات في 37 درجة مئوية و CO 2 5٪ خلال 5 ميكرون الغشاء. تمثل القضبان القيم يعني ± SEM (*: P <0.05)

الرقم 14
الشكل (14): في المختبر الهجرة من EPCS نحو المؤتلف السيتوكينات. أظهرت هو هجرة EPCS نحو تركيزات تمثيلية من CXCL8 المؤتلف، CXCL12، عامل نمو بطانة الاوعية، وMIF مقارنة سيرم جوعا (= الأساس). فقط كان MIF قادرةللتوسط زيادة الهجرة EPC بتركيزات من الناحية الفسيولوجية. وقد تضعف السيتوكينات المؤتلف في MV2 مصل المتوسطة جوعا. الخلايا هاجرت لمدة 3 ساعات عبر غشاء 5 ميكرون. تمثل القضبان القيم يعني ± SEM (**: ف <0.01 مقابل مصل تجويع المتوسطة)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وتضمن الجزء الأول من هذه الدراسة عزل EPCS الإنسان من الدم المحيطي من المتطوعين الأصحاء لتمكين من إجراء تقييم شامل من دم مرضى جراحة القلب. لذلك، تم إجراء الطرد المركزي التدرج الكثافة لفصل جزء PBMC من البلازما، والمحببة وكريات الدم الحمراء. لإزالة معظم الصفائح الدموية تلويث، تعرض هذا جزء الخلية إلى قصيرة وغسل بطيء الخطوات 29 و 30. بعد ذلك، تم عزل خلايا CD34 + من جزء المتبقي لفصل الخلايا الاصلية من الخلايا الليمفاوية المتبقية، وحيدات. وأخيرا، تم زرعها تعليق الخلية على الأطباق المغلفة فبرونيكتين في وسط نمو الخلايا البطانية المتاحة تجاريا لفصل الخلايا الاولية البطانية من (السلف) خلايا أخرى من سلالة الدم النخاعي 3. من المذكرة، ويناقش أن الصفائح الدموية قد تظهر CD34 سطح الخلية صريحةأيون، أيضا. على الرغم من أن الدراسات السابقة أظهرت ربط بعض أضداد CD34 إلى الصفائح الدموية، وهذا يمكن أن يكون الحرفية نظرا لتجمع الصفائح الدموية مع غيرها (-CD34 إيجابي) خلايا 31 و 32. ومع ذلك، فإن معظم الصفائح الدموية يمكن فصلها عن طريق تكرار الخطوات غسل بطيئة. بجانب الصفائح الدموية، سلائفها - السوية العرطلة - لا تعبر عن هذه المكونة للدم مستضد خلية سلفية وقد تكون موجودة في الدم المحيطي، على الرغم من أنها وجدت أساسا في نخاع العظم 33 و 34. وعلاوة على ذلك، يوصف أيضا أن يتم التعبير عن علامة CD34 سطح الخلية، وتستخدم في هذا البروتوكول في مستويات منخفضة جدا على الخلايا البطانية ناضجة 35. وبالتالي، فمن المهم النظر بحذر تلوث محتمل من جانب الصفائح الدموية / السوية العرطلة أو الخلايا البطانية ناضجة، عندما عزل EPCS. وبالتالي، خطوة 2.6 بأهمية خاصة خلال isolatioن من EPCS لإزالة الصفائح الدموية.

لتوضيح أهمية زراعة خلايا معزولة على أطباق المغلفة فبرونيكتين، سكان الخلية بعد يومين وسبعة أيام الثقافة على الفيبرونكتين قورنت مع كل اختيار-CD34 إيجابي السابقة. في اليوم الثاني، أظهر أقل من نصف خلايا معزولة على امتصاص acLDL والتعبير في وقت واحد CD31 على سطحها. وعلاوة على ذلك، يمكن أن ينظر إلى التعبير أقل كثافة من كلا علامات على رسوم بيانية حول. وتشير هذه البيانات إلى أن سبعة أيام الثقافة على فبرونيكتين في المتوسط ​​معينة من الخلايا البطانية ضرورية للحصول على EPCS تظهر أنماط التعبير البطانية مميزة. في هذه الخطوة، فإنه من الأهمية لاستخدام التركيز الصحيح / كمية من فبرونيكتين. Wijelath وزملاؤه أظهرت في وقت سابق ان الفيبرونكتين تشجع التعبير عن أنماط تشبه الخلايا البطانية، وعلى الأرجح في تركيبة مع عامل نمو بطانة الاوعية 36.

في الحادي والعشرين القادمةالجيش الشعبي البروتوكول، تم التحقيق على أهمية CD34 + -الاختيار لتعليق الخلية، مقارنة خلايا معزولة بعد 7 أيام من الثقافة على الأطباق المغلفة فبرونيكتين، مع وبدون CD34 السابق + -الاختيار. وكانت كمية الخلايا المفقودة على حد سواء علامات (acLDL امتصاص والتعبير CD31) أعلى من ذلك بكثير بعد عزل الخلية دون CD34 السابق + -الاختيار مقارنة العزلة بما في ذلك هذه الخطوة. أظهر CD34 ومن المثير للاهتمام، وبعد سبعة أيام من الثقافة على فبرونيكتين، والخلايا في عداد المفقودين + -الاختيار سكان الخلية أقل متجانسة، كما يدل على ذلك التعبير غير متجانس من CD31 بالمقارنة مع الخلايا المعزولة مع CD34 + -الاختيار. وتشير هذه البيانات إلى أن CD34 + -الاختيار الضروري لفرز EPCS من وحيدات / الضامة الأخرى. أثناء إنشاء هذا البروتوكول، وجدنا أن CD34 + -الاختيار في MV2 المتوسط عند 37 درجة مئوية يؤدي إلى زيادة عدد الخلايا على قيد الحياة، وذلك بالمقارنة مع أقل بكثير الشركة المصرية للاتصالاتmperatures، الذي يحتاج الى التحقيق بحذر في الدراسات المستقبلية. علينا أن نعترف أنه عند تطبيق هذا البروتوكول، وحضانة الأجسام المضادة في وسط يحتوي على الكالسيوم عند 37 درجة مئوية قد يؤدي إلى تفاعلات غير محددة وملزمة. في المستقبل، وأنظمة العازلة التي تفتقر إلى الكالسيوم في درجات حرارة منخفضة وينبغي اختبار، وأنشأ لتجنب هذا العامل التباس محتمل.

والجدير بالذكر، خلال تحليلنا الأولي من التجارب الهجرة الخلية مع عينات مصل، وتم إجراء القياسات لأول مرة باستخدام قارئ مضان صفيحة وcalcein تلطيخ الخلايا، كما هو موضح سابقا لمختلف أنواع الخلايا (على سبيل المثال السري الوريد الخلايا البطانية الإنسان، HUVEC) 37. وأشارت القيم الانقراض مختلفة بين المجلسين أن الأمر لا يقتصر على عينات المصل وحدها، ولكن أيضا وسيلة لديها بالفعل تأثيرا ملحوظا على مضان الذي تم قياسه، والتي تحتاج إلى النظر فيها بحذر. لذلك، ثتكييف البريد بروتوكول لدينا وتحولت إلى نظام قياس في الخلايا التي يمكن ملاحظتها عبر المجهر الضوئي وعدها من قبل البرمجيات الآلي نصف.

في حين تمثل EPCS لحوالي 0.1٪ من الخلايا في الدم المحيطي وأنه من الصعب عزل هذه الخلايا المحددة 38، أشار عدد هائل من الدراسات التي EPCS قد توفر الآثار المفيدة وتحسين الأوعية الدموية الأنسجة بعد أحداث الدماغية في أطرافه وفي عضلة القلب 39 (40 عاما). ومع ذلك فإنه لا يزال تحديا مستمرا لترجمة هذه النتائج في الممارسة السريرية والسريرية لتقييم مدى ملاءمة لها. قد تكون الأسباب يرجع ذلك إلى تأثير كبير في العديد من العوامل المحيطة بالجراحة على إفراز chemoattractants مختلفة، وهو ما ثبت سابقا 22، 41. لذلك، في الجزء الثاني من هذه الدراسة، ودور ج مختلفة/ تم تقييم ytokines على الهجرة من EPCS في تحديد أنا عضلة القلب R. لذلك، تم قياس تركيزات مصل السيتوكينات في مرضى جراحة القلب. أظهرت MIF، وكذلك CXCL12 وCXCL8 زيادة كبيرة داخل المنطوق. عند ترجمة هذه النتائج مرة أخرى إلى التجارب في المختبر، أظهرت النتائج الحالية أن هناك يست CXCL12- ولا تأثير بوساطة CXCL8 على الهجرة EPC في تركيزات الفسيولوجية قياس في المختبر. باستخدام نموذج وصف EPC العزلة وفحص الهجرة لاحق، تم تحديد MIF كوسيط السائد للEPC الهجرة 42. في هذا السياق، KANZLER وآخرون. تظاهر في نموذج الفأر التجريبية التي MIF وعامل نمو بطانة الاوعية توفير أقوى تأثير على الهجرة EPC تحت نقص الأكسجين 23. ومن المثير للاهتمام، وتبين قياسات VEGF أنه لا يوجد تغيير كبير داخل المنطوق في تركيزات الدم VEGF، التي قد تنجم عن ملزمة سو VEGF إلى تطبيق موحد أثناء العملية الهيبارين. لذلك، قد MIF تلعب دورا بارزا بين كيموكينات عائية في توظيف EPCS في مرضى جراحة القلب وأن يبدأ والمساهمة في عملية الشفاء بعد عضلة القلب I / R من خلال الاتجار EPCS إلى موقع الإصابة 43، 44 ومع ذلك، كما ارتفعت مستويات MIF على الفور بعد أن عضلة القلب / R، فإنه لا يزال المضاربة ما إذا كان تأثير بوساطة MIF على تجنيد EPCS قد تؤثر إعادة القلب والأوعية الدموية، والتي لها آثار كبيرة في الوقاية من قصور في القلب بعد عضلة القلب I / R 23. ومع ذلك، قبل التقدم إلى هذا التحليل، فإنه من المهم مواصلة تميز أنواع فرعية مختلفة من EPCS وتقييم دور وظيفي في البيولوجيا البشرية. وفي هذا الصدد، يوفر هذا البروتوكول طريقة موثوق بها حول كيفية عزل EPCS من الدم المحيطي البشري لتمكين طنهاية الخبر توصيف شامل آخر والدراسات المستقبلية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

الكتاب ليس لديهم الاعترافات.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fibronectin Biochrom AG L7117 Coating of T-75 flasks
Aqua ad iniectabilia Fresenius Kabi
Endothelial cell growth medium MV2 Promo Cell C-22221
Endothelial cell growth medium MV2 SupplementMix Promo Cell C-39226
Ficoll-Paque plus GE Healthcare 17-1440-03 Density centrifugation
EasySep human CD34 positive Selection Kit Stemcell Technologies 18056 Isolation of CD34+ cells
EasySep magnet Stemcell Technologies 18000
Accutase Sigma-Aldrich A6964-100ML Detachment of cells
Corning HTS transwell 96 well permeable supports Sigma-Aldrich CLS3387-8EA Migration system
Hoechst solution ThermoFisher 33342 Staining of migrated cells
ImageJ National institutes of health xxx Counting of migrated cells

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Emontzpohl, C., et al. Key role of MIF in the migration of endothelial progenitor cells in patients during cardiac surgery. Int J Cardiol. 181C, 284-287 (2014).
  2. Smadja, D. M., et al. Interleukin 8 is differently expressed and modulated by PAR-1 activation in early and late endothelial progenitor cells. J Cell Mol Med. 13 (8B), 2534-2546 (2009).
  3. Asahara, T., et al. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science. 275 (5302), 964-967 (1997).
  4. Simons, D., et al. Hypoxia-induced endothelial secretion of macrophage migration inhibitory factor and role in endothelial progenitor cell recruitment. J Cell Mol Med. 15 (3), 668-678 (2011).
  5. Dernbach, E., et al. Antioxidative stress-associated genes in circulating progenitor cells: evidence for enhanced resistance against oxidative stress. Blood. 104 (12), 3591-3597 (2004).
  6. Yang, Z., et al. Paracrine factors secreted by endothelial progenitor cells prevent oxidative stress-induced apoptosis of mature endothelial cells. Atherosclerosis. 211 (1), 103-109 (2010).
  7. Asahara, T., Kawamoto, A., Masuda, H. Concise review: Circulating endothelial progenitor cells for vascular medicine. Stem Cells. 29 (11), 1650-1655 (2011).
  8. Schmidt-Lucke, C., et al. Reduced number of circulating endothelial progenitor cells predicts future cardiovascular events: proof of concept for the clinical importance of endogenous vascular repair. Circulation. 111 (22), 2981-2987 (2005).
  9. Yoder, M. C. Human endothelial progenitor cells. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (7), a006692 (2012).
  10. Ito, H., et al. Endothelial progenitor cells as putative targets for angiostatin. Cancer Res. 59 (23), 5875-5877 (1999).
  11. Hill, J. M., et al. Circulating endothelial progenitor cells, vascular function, and cardiovascular risk. N Engl J Med. 348 (7), 593-600 (2003).
  12. Yoder, M. C., et al. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109 (5), 1801-1809 (2007).
  13. Rohde, E., et al. Blood monocytes mimic endothelial progenitor cells. Stem Cells. 24 (2), 357-367 (2006).
  14. Rohde, E., et al. Immune cells mimic the morphology of endothelial progenitor colonies in vitro. Stem Cells. 25 (7), 1746-1752 (2007).
  15. Prokopi, M., et al. Proteomic analysis reveals presence of platelet microparticles in endothelial progenitor cell cultures. Blood. 114 (3), 723-732 (2009).
  16. Voyta, J. C., Via, D. P., Butterfield, C. E., Zetter, B. R. Identification and isolation of endothelial cells based on their increased uptake of acetylated-low density lipoprotein. J Cell Biol. 99 (6), 2034-2040 (1984).
  17. Koch, S., Claesson-Welsh, L. Signal transduction by vascular endothelial growth factor receptors. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (7), a006502 (2012).
  18. Hirschi, K. K., Ingram, D. A., Yoder, M. C. Assessing identity, phenotype, and fate of endothelial progenitor cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28 (9), 1584-1595 (2008).
  19. Hur, J., et al. Characterization of two types of endothelial progenitor cells and their different contributions to neovasculogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24 (2), 288-293 (2004).
  20. Tagawa, S., et al. Determination of Early and Late Endothelial Progenitor Cells in Peripheral Circulation and Their Clinical Association with Coronary Artery Disease. Int J Vasc Med. , 2015 (2015).
  21. Bernhagen, J., et al. MIF is a noncognate ligand of CXC chemokine receptors in inflammatory and atherogenic cell recruitment. Nat Med. 13 (5), 587-596 (2007).
  22. Stoppe, C., et al. Interaction of MIF Family Proteins in Myocardial Ischemia/Reperfusion Damage and Their Influence on Clinical Outcome of Cardiac Surgery Patients. Antioxid Redox Signal. 23 (11), 865-879 (2015).
  23. Kanzler, I., et al. Differential roles of angiogenic chemokines in endothelial progenitor cell-induced angiogenesis. Basic Res Cardiol. 108 (1), 310 (2013).
  24. Walenta, K. L., Bettink, S., Bohm, M., Friedrich, E. B. Differential chemokine receptor expression regulates functional specialization of endothelial progenitor cell subpopulations. Basic Res Cardiol. 106 (2), 299-305 (2011).
  25. Rassaf, T., Weber, C., Bernhagen, J. Macrophage migration inhibitory factor in myocardial ischaemia/reperfusion injury. Cardiovasc Res. 102 (2), 321-328 (2014).
  26. Stoppe, C., et al. High postoperative blood levels of macrophage migration inhibitory factor are associated with less organ dysfunction in patients after cardiac surgery. Mol Med. 18, 843-850 (2012).
  27. Amin, M. A., et al. Migration inhibitory factor mediates angiogenesis via mitogen-activated protein kinase and phosphatidylinositol kinase. Circ Res. 93 (4), 321-329 (2003).
  28. Kupatt, C., et al. Embryonic endothelial progenitor cells expressing a broad range of proangiogenic and remodeling factors enhance vascularization and tissue recovery in acute and chronic ischemia. FASEB J. 19 (11), 1576-1578 (2005).
  29. Colotta, F., et al. Expression of a monocyte chemotactic cytokine by human mononuclear phagocytes. J Immunol. 148 (3), 760-765 (1992).
  30. Casale, T. B., Kaliner, M. A rapid method for isolation of human mononuclear cells free of significant platelet contamination. J Immunol Methods. 55 (3), 347-353 (1982).
  31. Lewandowska, K., Kaplan, D., Husel, W. CD34 expression on platelets. Platelets. 14 (2), 83-87 (2003).
  32. Stellos, K., et al. Platelet-derived stromal cell-derived factor-1 regulates adhesion and promotes differentiation of human CD34+ cells to endothelial progenitor cells. Circulation. 117 (2), 206-215 (2008).
  33. Thornton, M. A., Poncz, M. In vitro expansion of megakaryocytes from peripheral blood hematopoietic progenitors. Methods Mol Med. 31, 337-345 (1999).
  34. Ivetic, N., et al. Producing megakaryocytes from a human peripheral blood source. Transfusion. 56 (5), 1066-1074 (2016).
  35. Friedrich, E. B., Walenta, K., Scharlau, J., Nickenig, G., Werner, N. CD34-/CD133+/VEGFR-2+ endothelial progenitor cell subpopulation with potent vasoregenerative capacities. Circ Res. 98 (3), e20-e25 (2006).
  36. Wijelath, E. S., et al. Novel vascular endothelial growth factor binding domains of fibronectin enhance vascular endothelial growth factor biological activity. Circ Res. 91 (1), 25-31 (2002).
  37. Hulkower, K. I., Herber, R. L. Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery. Pharmaceutics. 3 (1), 107-124 (2011).
  38. Yao, E. H., et al. Effects of the antioxidative beta-blocker celiprolol on endothelial progenitor cells in hypertensive rats. Am J Hypertens. 21 (9), 1062-1068 (2008).
  39. Takahashi, T., et al. Ischemia- and cytokine-induced mobilization of bone marrow-derived endothelial progenitor cells for neovascularization. Nat Med. 5 (4), 434-438 (1999).
  40. Kawamoto, A., et al. Therapeutic potential of ex vivo expanded endothelial progenitor cells for myocardial ischemia. Circulation. 103 (5), 634-637 (2001).
  41. Kim, B. S., et al. Myocardial Ischemia Induces SDF-1alpha Release in Cardiac Surgery Patients. J Cardiovasc Transl Res. 9 (3), 230-238 (2016).
  42. Frangogiannis, N. G., Smith, C. W., Entman, M. L. The inflammatory response in myocardial infarction. Cardiovasc Res. 53 (1), 31-47 (2002).
  43. Zernecke, A., Bernhagen, J., Weber, C. Macrophage migration inhibitory factor in cardiovascular disease. Circulation. 117 (12), 1594-1602 (2008).
  44. White, D. A., et al. Pro-inflammatory action of MIF in acute myocardial infarction via activation of peripheral blood mononuclear cells. PLoS One. 8 (10), e76206 (2013).

Tags

الطب، العدد 120، الخلايا الاصلية البطانية، بروتوكول العزلة والهجرة بلعم عامل مثبط، وجراحة القلب، فحص الهجرة
عزل الخلايا البطانية السلف من المتطوعين الأصحاء وإمكاناتهم الكثيرة تأثر عينات المصل بعد جراحة القلب
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Emontzpohl, C., Simons, D., Kraemer, … More

Emontzpohl, C., Simons, D., Kraemer, S., Goetzenich, A., Marx, G., Bernhagen, J., Stoppe, C. Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Healthy Volunteers and Their Migratory Potential Influenced by Serum Samples After Cardiac Surgery. J. Vis. Exp. (120), e55192, doi:10.3791/55192 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter