Summary
内皮前駆細胞（EPC）が決定的に虚血組織の血管新生に関与しています。この方法は、末梢血由来のヒトEPCの単離、ならびに心臓手術患者の血清サンプルに対する彼らの渡り鳥の可能性の同定を記載します。
Abstract
内皮前駆細胞（EPC）は、低酸素症のような病理学的条件の下で骨髄から動員されると決定的に虚血組織の血管新生に関与しています。 EPCの起源、分類および特徴付けは複雑です。かかわらず、EPCの2顕著なサブタイプが確立されている：いわゆる「初期」のEPC（その後、早けれ-のEPCと呼ぶ）と後期成長のEPC（後期のEPCを）。これらは、生物学的特性によってだけでなく、in vitro培養中にそれらの外観によって分類することができます。 「初期」のEPCは、EC-特定のメディアにおける末梢血由来の単核細胞の培養後一週間も経たないうちに見えるが、後期成長EPCは2-3週間後に見つけることができます。 「初期」のEPCはENDOGENなど様々な血管新生因子を発現するのに対し、後期成長EPCは、主に成熟内皮細胞に分化する能力を介して、直接、血管新生に関与することが認められていますパラクリン方法で血管新生を促進するための組織単位（OU）貨物。心筋虚血/再灌流（I / R）の間に、様々な要因は、血管形成の領域へのEPCのホーミングを制御します。
マクロファージ遊走阻止因子（MIF）は、ケモカイン様炎症誘発性であり、普遍的にサイトカインを発現し、最近では生理的濃度1でのEPCの移行の重要な調節因子として機能するように説明しました。興味深いことに、MIFは、細胞内プールに格納され、急速に、いくつかの刺激（ 例えば 、心筋梗塞）後に血流中に放出することができます。
このプロトコルは、血清サンプルに対するインビトロ遊走アッセイで使用するためのフィブロネクチンでコーティングされたプレート上で内皮細胞増殖因子を含む培地中でその後の培養でCD34陽性選択に基づいて、成人ヒト末梢血からの早期-EPCの信頼性の単離および培養のための方法を説明し心臓手術患者の。また、他のよく知られた血管新生を刺激するサイトカインと比較して、EPCの走化性に対するMIFの回遊影響が実証されています。
Introduction
内皮前駆細胞（EPC）は、ヒト血液中を循環し、内皮細胞2に分化する能力を有しています。これらは、脈管形成に関与する様々な方法3,4における炎症および虚血/再灌流（I / R）傷害によって引き起こされる損傷を最小限にすることが可能です。例えば、EPCはカタラーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼまたはマンガンスーパーオキシドジスムターゼ（のMnSOD）5のような細胞内の抗酸化酵素のレベルの上昇を示しています。酸化ストレスに対する上昇した耐性はEPCのは、虚血性傷害6の後に上昇した活性酸素種（ROS）と微小環境で機能することを可能にします。以前の研究ではまた、EPCの数は、血管の修復に相関したEPCの循環数の減少は、心血管イベント7の発生を予測することをされるかもしれないことを示しましたクラス= "外部参照"> 8。しかし、EPCの明確な定義はまだ発見されていません。これまで、そこのEPCのための特異的な細胞表面マーカーまたは一貫性の表現型はなく、これらの細胞は、末梢血9において非常に稀です。人間のEPCが負傷内皮および新血管構造の再構築に貢献する能力を有する循環細胞として考慮されるべきです。
単離したEPCを特徴付ける一つの方法は、フィブロネクチンへの接着を介してです。これにより、これらの細胞の能力は、実施例3、10、11のために、1型コラーゲンと比較して被覆された皿をフィブロネクチンへの優れた接着性を示すために使用されます。しかし、他のものは以前のまたはさらなる精製工程なしで、フィブロネクチンでコーティングされた皿上で単核細胞をプレーティングする骨髄前駆細胞、単球、およびTリンパ球1を含むコロニーをもたらすことを見出しました2、13、14。また、この場合には、血小板は、単核細胞（MNC）画分を汚染する可能性があり、それにより、任意の接着細胞15に原形質膜タンパク質を移します。
インビトロ接着アッセイを介して特性決定に加えて、別の細胞表面マーカーの組み合わせは、EPCと考え細胞型を記述するために使用されます。この場合には、フィブロネクチン媒介接着後、細胞は、内皮細胞のような属性について分析されます。このプロセスでは、二つの内皮細胞関連マーカー、アセチル化低密度リポタンパク質（acLDL）および血管内皮増殖因子受容体2（VEGFR-2、KDR）が、役割を果たしています。内皮細胞およびマクロファージは、具体的には、「スカベンジャー細胞経路」16と呼ばれるプロセスでacLDLを取ることが示されています。別のマーカータンパク質は、内皮の主なVEGFレセプターのようなKDRでありますセル17。一般的に、EPCは、内皮成長因子およびウシ胎児血清を補充した培地で培養したようしかし、また、誤って単離されている可能性があるマクロファージ、内皮様マーカープロファイルを示すことが可能です。先に示したように内皮馴化培地で培養した場合、マクロファージは、「内皮特異的」タンパク質18を発現します 。
一般的には、血液中に見つけることができるか、 インビトロで培養する以上のサブタイプ、内EPCの2つのカテゴリがあります。後期成長のEPC（後期-EPCは）文化の2-3週間後に表示されます。これらの細胞は、より速く、ヒト臍帯静脈内皮細胞の単層に組み込まれており、毛細管19を形成することができます。また、いわゆる「早期-EPCは、「このような血管内皮増殖として、血管新生分子を送達を通じてより受動的な方法で、約1週間、行動のための血液中を循環します因子（VEGF）、又はCXCL8 19。冠動脈疾患（CAD）を有する患者は、CAD 20ない対照群と比較して、初期EPCの有意に低い量を示しました。興味深いことに、同じグループは、対照群と比較して、後期EPCのより高い量を示しました。別の研究では、早期のEPCは、パラクリン様式6に酸化条件下でアポトーシスから分化したEPCを保護することが示されました。したがって、初期のEPCは、末梢血中に自動またはパラクリン様式で他の細胞の遊走を通じ、関連する保護効果を提供するかもしれません。
このプロトコルは、最初のヒト末梢血からPBMC画分を単離し、その後、不要な細胞からこの細胞懸濁液をクリアするには、PBMC-画分からCD34 +細胞を単離することにより、早期のEPCを精製する方法を説明しています。 CD34は、ヒト造血幹細胞の単離のために使用されるマーカーであり、9 +細胞は、フィブロネクチンでコーティングした組織培養表面上で培養されます。三日後、培地を、それによって全ての非接着細胞を失って、変更されます。最後に、単離されたEPCは、acLDLの取り込みおよび蛍光活性化セルソーティング（FACS）を用いて、内皮細胞マーカーとしてのKDRの存在を確認するために染色されます。追加のマーカーとして、我々はまた、内皮細胞上で起こる血小板内皮細胞接着分子（PECAM-1、CD31）を、分析しました。
EPCの強化動員によって損傷または梗塞心筋組織の修復は、心血管疾患における集中的に調べた治療戦略に属します。しかし、臨床診療への実験結果の翻訳は、様々な病態生理学的状態の間に人間の体内で複雑な細胞相互作用を考えると、まだ困難です。さらに、心筋のI / R傷害は種々のサイトカイン、ホルモンおよび成長FACの過剰分泌を誘発します血管形成13の地域にEPCのホーミングを制御ター、。既に示したように、CXCL8、間質細胞由来因子1α（SDF-1α、CXCL12）は、VEGFおよびマクロファージ遊走阻止因子（MIF）は、有意に心筋のI / R損傷の1以下の血清サンプルにおいて増加しています。これらの要因のうち、MIFは、主に炎症誘発性特性を有する多面的なケモカイン様サイトカインです。その歴史的な名前とは対照的に、MIFは、種々の細胞タイプ1、21、22上の真のケモカインとして作用し、プロ渡り鳥の機能を有しています。 MIF媒介性の細胞動員プロセスは、MIFがに結合し、非同族の方法21で活性化するケモカイン受容体CXCR2及びCXCR4にリンクされています。注目すべきは、EPCはさらに、低酸素条件下で上方調節なるそれらの表面上のこれらの受容体の両方を発現しますお尻= "外部参照"> 23、24。また、蓄積した証拠は、MIFが心臓22、25、26のI / R傷害の間に全体的な心臓保護効果を有することを示唆しています。この文脈においては、さらに、MIFは、損傷した心筋27の制限された回復メカニズムを考慮すると、特に関連性がある低酸素ストレスの間に血管新生をサポートすることができることが示されています。前臨床マウスモデルにおいて前のin vitro試験と実験はEPCを動員4におけるMIFの役割についての最初の証拠を提供しました。注目すべきは、MIFはまた、虚血性サイト28内のEPCの動員中に放出される可能性がEPCの著名な貨物のタンパク質です。しかし、他の（血管新生）血清サイトカインと比較して特に臨床現場での研究は、とらえどころのないまま。
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Protocol
EPCの単離のための血液は、地元の倫理委員会に従ったインフォームドコンセントの後に健康なボランティアから得ました。遊走アッセイで使用される血清試料は、心肺バイパス（CPB）を用いて、従来の心臓手術を受けた患者から得ました。除外基準は、緊急操作、知られているか、または疑われる妊娠、patient`s年齢18歳未満、およびインフォームドコンセントを得るために失敗しました。血清サンプルを、（直ちに手術前と直ちに大動脈クロスクランプの心筋再灌流/開封後）は、臨床ルーチンの測定に加えて描画し、その後、最終的な分析まで-80℃で保存しました。施設内倫理委員会（倫理委員会、アーヘン工科大学）は、この研究を承認しました。患者は68.6年の平均年齢と81.7キロの平均重量を示しました。既存の疾患が含まれる：高血圧（65％）、慢性肺疾患（19％）、余分な心臓動脈疾患（16％）、脳機能障害（6％）、不安定狭心症（10％）、最近の心筋梗塞（90 D内の28％）、慢性腎疾患（14％）、肝疾患（2％）および糖尿病（34％）。
T75フラスコの1コーティング：
- 5 mLのフィブロネクチン溶液をT75フラスコあたり（15 mLの超純水で希釈した1mgのヒトフィブロネクチン）を準備します。
- T75フラスコにソリューションを追加し、水が蒸発するまで待ちます。蒸発による分離プロセスの間に不要な中断を避けるために、事前にこのプロセスを実行する（ 例えば、一晩）、室温で。このソリューションは、4.44μgのフィブロネクチン/ cm 2とを与えます。
- 製造業者によって提供成長因子サプリメントと基礎MV2培地を補充することによって、内皮細胞増殖培地MV2を準備します。
60 mLの血液から内皮前駆細胞（EPC）の2単離：
注：CD34陽性選択カクテルAとしてND磁気ビーズは、メーカーが提供するいかなる濃度が存在しない、複合選択キットで市販されています。しかし、抗体の約100μL、5×10 8細胞までの処理のために十分です。磁気ビーズは、水、デキストラン被覆および他の市販のビーズと比較して約5,000x小さい中で希釈されています。詳細については、manufacturer's説明書を参照してください。
- Ca 2+ -Mg 2+フリーPBSで1：（付きまたは抗凝固剤なしで）血1を混ぜます。
- 50mLのチューブあたり密度勾配溶液15mlを加えます。詳細については、manufacturer's説明書を参照してください。
- ゆっくり密度勾配溶液の上に希釈された血液層。
- 緩加速で30分間ブレーキなしで2500×gで遠心分離サンプル。
- 慎重に滅菌プラスチックピペットを用いて、すべてのチューブ（ 図1）のバフィーコート層を収集し、別のチューブに入れて。密度勾配液の収集を避けます。予想されるPBMCの収量は約3-4×10 6細胞/ mLの血液です。
図1：フィコールソリューションにBbuffyコートの密度勾配遠心。密度勾配溶液で30分間、2,500×gでの密度勾配遠心分離の結果が示されています。赤血球および顆粒球（赤色）、単核細胞分画（白層）、プラズマ（黄色）、および密度勾配溶液（白っぽい）が示されています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
- PBSの少なくとも3容量の末梢血単核細胞画分を希釈し、混合します。 200×gで15分間、室温で遠心分離します。
- 二回繰り返しステップ2.6。</李>
- 上清を吸引し、5mL MV2培地で細胞ペレットを再懸濁します。
- 使用軟膜あたり（5×10 8細胞までの処理のために十分な）ヒトCD34抗体の100μLを加え、5％CO 2で37℃で15分間回転させます。
- 使用軟膜あたりデキストラン被覆磁性ビーズの50μLを加え、5％CO 2で37℃で10分間回転させます。
- インキュベーション後、各チューブ内の3ミリリットルの最大でFACSチューブにサスペンションを移します。より多くの量は、磁石と、許容されません。
- 磁石（複数可）にFACSチューブ（複数可）を挿入し、5分間待ちます。
- 磁石のうち、FACSチューブを引っ張ることなく、上清を捨てます。
- 磁石の外側に3 mLのMV2媒体を各FACSチューブ中の細胞を再懸濁します。
- 繰り返し二回2.12から2.14までを繰り返します。
- 磁石のうち、FACSチューブを引き、3 mLのMV2培地で細胞を再懸濁します。
- プレコーティングされたT75 Fに細胞懸濁液を転送しますlasksとは、フラスコ当たり17 mLのMV2媒体を追加します。
注：培地を3日後に変更する必要があります。 1週間後、細胞は紡錘状の構造（ 図2）を表示し、使用する準備が整いました。分離の見落としについては、 図3を参照してください。
図2：単離されたEPCの顕微鏡画像。剥離する前にT75フラスコ中で単離された初期のEPCの代表画像が示されています。見かけはEPCの紡錘状の構造です。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：フローはEPC単離手順を示します。スキーム、ショーは描かれていますEPC単離プロトコールの単一ステップをる。より詳細なプロトコルのプロトコルセクションの第2章を参照してください。
3.移動アッセイ
- T75フラスコ中のEPCからメディアを削除します。
- 慎重にそれを揺することによって5mLのPBSで洗浄します。
- PBSを削除し、5 mLの市販の細胞の剥離液を追加します。細胞が分離されるまで待ちます（顕微鏡で確認してください）。慎重にフラスコの底をタップすることで剥離を加速します。
- 細胞が分離されると、すぐにMV2完全培地の5ミリリットルを追加し、別のチューブに細胞懸濁液を転送します。
- 5分間、2000×gで遠心分離します。
- 5分間2000×gで再び5〜10 mLのPBSと遠心で細胞を再懸濁します。
- 繰り返し手順3.6。
- （遊出ウェルあたり75μLで50,000個の細胞が必要とされる）MV2飢えた培地中で細胞ペレットを再懸濁します。
注：必要とされる移行システムは、細胞型およびアッセイに依存します。 diffはあります erentの細孔径とプレートサイズ（ウェルの数）。 EPCを96ウェル方式で5ミクロンの孔サイズが最適です。 - 下部チャンバー（ 図4）に：血清サンプルの235μLを（MV2飢えた培地で5血清が1に希釈）を添加することにより、移行プレートを準備します。
図4：変更されたボイデンチャンバー内遊走アッセイ。修正されたBoydenチャンバーの一般的な設計が示されています。細胞培養インサート（=上部チャンバー）が濃い青色で表示され、下部チャンバーに挿入されています。これらのインサートの底面（ただし、壁）の細孔を含むフィルタシステムを表します。 （a）の時点ゼロでセットアップを表示します。 （b）は選択された時点の後、細胞は、刺激に向かってフィルタを介して移行されます。fig4large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
- 細胞溶液を加える直前にインサートを追加します。
- 上室に細胞溶液を75μL（= 50,000個の細胞）を追加します。
- EPCは、（移動時間は、細胞の種類やシステムに依存）、37℃で3時間、5％CO 2のために移行しましょう。
- 血清自家蛍光アーチファクトを回避するために、半自動化ソフトウェア「ImageJの "を使用して、細胞を顕微鏡下で井戸の写真を撮ることによって遊走した細胞を定量化し、カウントされます。
- 上部チャンバーを取り外します（すべての非遊走細胞を含みます）。
- （：1,000 1に希釈）Hoechst色素を含む、70μLの3.6％パラホルムアルデヒド溶液を追加します。プレートを37℃、5％CO 2で一晩保存することができます。
- 1-2分間、2000×gで同じ焦点平面にすべてのセルを取得するためにすぐにプレートを遠心します。
- ワットあたり5写真を撮ります100X倍率エル（ 図5および6）。
図5：スキームは、撮影した画像の位置を表示しています。スキームは、十分に関連して、移動した細胞の決意に必要とされる5撮影した画像の位置を示します。画像は、細胞をカウントし、すべてのウェルの平均値を計算するために取られます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図6：細胞の定量化のための顕微鏡画像。細胞定量のために採取した代表画像が、示されています。細胞を染色し、USIを固定し、3.6％パラホルムアルデヒド中でngのヘキスト染料。ドットは、固定し染色した内皮前駆細胞を表します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
- 国立衛生研究所によって半自動化ソフトウェア「ImageJの "を使用して移動した細胞を数えます。
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Representative Results
単離された内皮前駆細胞のキャラクタリゼーション
まず、acLDLの取り込みが確認されただけでなく、単離された細胞集団の表面上のKDRの発現、およびCD31。 図7aが示すように 、分離されたEPCの85.1パーセントはacLDLの取り込みを示し、CD31を発現しました。両方のマーカーのための負の小さい人口、があるように思われるが、 図7b及び7cは 、さらに、両方のマーカーの均一な分布を示しています。第2のステップでは、KDRとの組み合わせでacLDLのFACS分析を行いました。 図8aは、単離された細胞の80％以上がacLDLの取り込みとその表面にKDRの発現を示したことを示しています。 図8b及び8cは 、これらのマーカーの均質性を示します。
importancを確認するには培養時間、フィブロネクチンコートディッシュ上での培養の7日後に単離されたEPCを持つフィブロネクチンでコーティングされた表面上での培養の2日後に単離された細胞間の3つのマーカーの比較（当社のプロトコルに記載されているように）中のフィブロネクチンコートディッシュの電子両方の前のCD34 + -selectionで、行いました。 図9aに示すように、2日培養した細胞のわずか46.4％が、フィブロネクチン上での培養の7日後に細胞の85％と比較して、acLDLの取り込みならびにそれらの表面上のCD31の発現を示しました。また、ヒストグラム（ 図9bと9cは）7日に比べて2日間の培養後に、両方のマーカーの少ない強度を示した（ 図7b及び7cが ）。同じことは、マーカーacLDLとKDRとの組み合わせについても同様です。フィブロネクチン上での培養の2日後、全ての細胞の唯一の68.0パーセントは、それらの表面上acLDLの取り込みだけでなく、KDRの発現を示した（ 図Sの10A-10C）。フィブロネクチン上で培養の7日後に、細胞を83.6％が、その表面（ 図8A〜8C）のKDRのacLDLの取り込みおよび発現を示しました。
次のステップでは、EPCの単離の間にCD34 + -selectionの重要性を評価しました。したがって、CD34 + -selectionを逃した密度勾配遠心分離およびフィブロネクチン上での培養の7日を含めて、本プロトコルに基づいて選択したセル、しかしを単離しました。 図10aに示すように、全ての単離された細胞の18％以上がどちらも特急CD31を行うも、CD31の発現とacLDLの取り込みを示すCD34 + -selection、後の8％未満に比べacLDLの取り込みを示す（ 図7a） 。また、関連に比べ、単離された細胞は、両方のマーカーに関して非常に不均一であることを11b及び11cのショーフィギュア
心臓手術中に血清サイトカインレベル
MIF、CXCL12、CXCL8およびVEGFの血清レベルの循環濃度に心筋のI / R後の心臓手術の影響を特定するために、血清サンプルを、市販のELISA（ 図12）によって、その後の分析のための前および術中に採取しました。 MIFの血清レベルは、（100.3 ngの/ mLの対 127.4 NG / mLで、P = 0.027）のベースライン値と比較して有意な術中の増加を示しました。同様に、CXCL12レベルは、手術中、血清の有意な増加（0.101 NG / mLの対 0.198 NG / mLで、P = 0.011）を示しました。 MIFおよびCXCL12と同様に、CXCL8が大幅に（0.15 ngの/ mLの対 0.3 ngの/ mLで、P = 0.022）手術中に増加しました。続きでRASTは、VEGF濃度は、観察期間中の任意の有意な変化を示さなかった（0.154 ngの/ mLの対 0.134 ngの/ mLで、P = 0.583）1。
内皮前駆細胞の遊走能
patients'血清試料の直接の影響を調査し、その中には、EPCの移行に、サイトカイン/ケモカイン/血管新生因子を含有するため、前及び手術中に採取した血清試料を用いてエクスビボ遊走アッセイを、実施しました。 EPCは、健康なボランティアから単離しました。 図13に示すように、EPCの移動速度が大幅に手術前に採取されたサンプルと比較して、手術中に採取されたサンプルに向かって増加した（ベースラインと比較して+ 35％、P = 0.047）。
以前の研究は、既にI / Rは、SEVの分泌をトリガーすることが実証されているので白血球走化性および移動を調節するERALサイトカイン、MIF、CXCL12、CXCL8、およびVEGFを含む、これらの潜在的な化学誘引物質を使用して、移動アッセイを行いました。 in vivoでの EPC動員に対するこれらのサイトカインの影響のより良い理解を得るためには、マイグレーション・デバイスの下部チャンバーに上記のサイトカインの生理的に測定された濃度を適用する追加のin vitroでの遊走実験は、あまりにも、行われました。
100と130 ngの間のMIFの血清濃度として/ mLの（ 図12）を測定していた、組換えMIFの100ng / mlの濃度は、媒体対照（と比較して、EPCの移行中> 6倍の増加につながった、使用されました図14）。 300 pg / mlで - これとは対照的に、CXCL12、CXCL8、およびVEGFの血清濃度は、150の範囲でした。注目すべきは、これらの濃度は、in vitroでのEPCの移行に影響を媒介しませんでした（ 図14）。これらの4つのサイトカインの中で、MIFがインビボ 1 で EPC遊走に対する相対的な最強の影響を示すことが考えられます。
図7：7日目に単離されたEPCのFACS分析 （a）に示すのは、CD34 +選択後、単離されたEPCのacLDLおよびCD31細胞表面発現およびフィブロネクチンでコーティングされた皿上で7日間の培養期間の取り込みです。左上：細胞はacLDLの取り込みを示したが、CD31を発現しません。右上：細胞をacLDLの取り込みを示し、CD31を発現します。左下：細胞をacLDLのない取り込みを示さず、CD31を発現しません。右下：細胞をacLDLのない取り込みを示していないが、CD31を発現します。 （b）に示すのは、単離されたEPCによる取り込み後にPE結合acLDLのヒストグラムです。 （c）に示さはFITC-CONJのヒストグラムであります分離されたEPCの細胞表面CD31に結合した後、CD31抗体をugated。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図8：7日目に単離されたEPCのFACS分析 （a）に示すのは、CD34 +選択後、単離されたEPCのacLDLとKDR細胞表面発現およびフィブロネクチンでコーティングされた皿上で7日間の培養期間の取り込みです。左上：細胞がacLDLの取り込みを示しているが、KDRを発現しません。右上：細胞をacLDLの取り込みを示し、KDRを発現します。左下：細胞をacLDLのない取り込みを示さず、KDRを発現しません。右下：細胞をacLDLのない取り込みを示していないが、KDRを発現します。 （b）に示すのは、単離されたEPCによる取り込み後にPE結合acLDLのヒストグラムです。 （c）に示さです分離されたEPCの細胞表面KDRに結合した後、FITC結合KDR抗体のヒストグラム。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図9：2日目に単離されたEPCのFACS分析 （a）に示すのは、CD34 +選択後、単離されたEPCのacLDLおよびCD31細胞表面発現およびフィブロネクチンコートディッシュ上で2日間の培養期間の取り込みです。左上：細胞がacLDLの取り込みを示したが、CD31を発現しません。右上：細胞をacLDLの取り込みを示し、CD31を発現します。左下：細胞をacLDLのない取り込みを示さず、CD31を発現しません。右下：細胞をacLDLのない取り込みを示していないが、CD31を発現します。 （b）に示すのは、単離されたEPCによる取り込み後にPE結合acLDLのヒストグラムです。 （
図10：2日目に単離されたEPCのFACS分析 （a）に示すのは、CD34 +選択後、単離されたEPCのacLDLとKDR細胞表面発現およびフィブロネクチンコートディッシュ上で2日間の培養期間の取り込みです。左上：細胞がacLDLの取り込みを示しているが、KDRを発現しません。右上：細胞をacLDLの取り込みを示し、KDRを発現します。左下：細胞をacLDLのない取り込みを示さず、KDRを発現しません。右下：細胞をacLDLのない取り込みを示していないが、KDRを発現します。 （b）に示すのは、摂取後にPE結合acLDLのヒストグラムであります孤立したEPCによります。示さ（c）は 、単離されたEPCの細胞表面のKDRへの結合後にFITC結合KDR抗体のヒストグラムです。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図11：単離されたEPCのFACS分析7日目 （a）に示すのは、前のCD34 +選択せずに孤立したEPCのacLDLおよびCD31細胞表面発現の取り込みですが、フィブロネクチンでコーティングされた皿上で7日間の培養期間を含みます。左上：細胞はacLDLの取り込みを示したが、CD31を発現しません。右上：細胞をacLDLの取り込みを示し、CD31を発現します。左下：細胞をacLDLのない取り込みを示さず、CD31を発現しません。右下：細胞をacLDLのない取り込みを示していないが、CD31を発現します。 （b）に示されPE結合acLDLのヒストグラムは、単離されたEPCによる取り込みの後です。示さ（c）は 、単離されたEPCの細胞表面CD31に結合した後、FITC結合CD31抗体のヒストグラムです。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図12：心臓手術中の血清サイトカインレベル。 CXCL8、VEGF、CXCL12、およびELISAを用いて心臓手術を受けた患者のMIFの血清濃度を測定します。 SEM±術中濃度と比較して、術前の平均値が示されている（*：P <0.05; 対プリOP）
図13：Inは患者の血清に向けてEPCのインビトロ移行。心臓手術を受けた患者の血清サンプルに向けて健康なボランティアのEPCの移行における術中の増加が示されています。 MV2血清飢餓状態に培地中にウェル当たり50,000個の細胞をトランスウェルシステムの上部チャンバーに添加しました。同じ培地で5：下部チャンバ内の血清サンプルを1に希釈しました。細胞は、5ミクロンの膜を通して、37℃、5％CO 2で3時間移動しました。バーは平均値±SEMを表す（*：P <0.05）
図14： 組換えサイトカインに向けてEPCの インビトロ の移行 で 。組換えCXCL8の代表的な濃度に向けたEPCの移行が示され、CXCL12、VEGF、およびMIFは、血清飢餓状態の媒体（=ベースライン）と比較します。唯一のMIFができました生理的に測定された濃度で増加EPCの移行を媒介します。組換えサイトカインはMV2血清飢餓培地で希釈しました。細胞は、5μmの膜を通して3時間移動しました。 （：血清飢餓状態の媒体対のp <0.01 **）バーは、平均値±SEMを表します
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Discussion
この研究の最初の部分は、心臓手術患者の血液の総合評価を可能にするために、健康なボランティアの末梢血からのヒトEPCの単離が含まれていました。したがって、密度勾配遠心分離は、血漿、顆粒球及び赤血球からPBMC画分を分離するために行きました。混入した血小板の大部分を除去するには、この細胞画分は短いと低速洗浄は29、30ステップに供しました。次に、CD34 +細胞は、残りのリンパ球、および単球から前駆細胞を分離するために、残りの画分から単離しました。最後に、細胞懸濁液を、骨髄系統3の他の（前駆）細胞から内皮前駆細胞を分離するために、市販の内皮細胞増殖培地中、フィブロネクチンでコーティングした皿上で培養しました。注目すべきは、血小板は、CD34細胞表面急行を示すことが議論されていますイオン、あまりにも。以前の研究では、血小板にはいくつかの抗CD34抗体の結合を実証したが、これは、他の（CD34陽性）細胞の31、32と血小板の凝集にアーチファクトであり得ます。しかし、ほとんどの血小板を繰り返す遅い洗浄工程により分離することができます。血小板のほかに、それらの前駆体-巨核球が-この造血前駆細胞抗原を発現しない、彼らは主に骨髄33、34で発見されているが、末梢血中に存在している可能性があります。さらに、このプロトコルで使用される細胞表面マーカーCD34は、成熟した内皮細胞35に非常に低いレベルで発現されることが記載されています。 EPCを単離する場合したがって、慎重に血小板/巨核球または成熟内皮細胞による汚染の可能性を考慮することが重要です。したがって、ステップ2.6はisolatio中に特定の関連性があります血小板を除去するためのEPCのn個。
2日およびフィブロネクチン上での培養の7日後にフィブロネクチン被覆皿、細胞集団上で単離された細胞を培養することの重要性を明確にするために、以前のCD34陽性の選択との両方を比較しました。 2日目に、単離された細胞の半分以下はその表面にCD31のacLDLの取り込みと同時発現を示しました。また、に関するヒストグラム上の両方のマーカーのより弱い発現が見られました。これらのデータは、内皮細胞特異的培地中でフィブロネクチン上での培養の7日間の特性内皮発現パターンを示すのEPCを取得するために必要であることを示しています。この工程では、フィブロネクチンの右側の濃度/量を使用することが重要です。 Wijelathらは以前に、フィブロネクチンは、VEGF 36との組み合わせで、内皮細胞状パターンの発現を促進する可能性が最も高いことが示されました。
次のSTにプロトコルのepが、細胞懸濁液のCD34 + -selectionの重要性は、とし、前のCD34 + -selectionことなく、フィブロネクチンでコーティングされた皿上で培養7日後に単離した細胞を比較、検討しました。両方のマーカー（acLDL取り込みおよびCD31発現の）行方不明の細胞の量は、前のCD34 +この工程を含む分離に比べ-selectionせずに細胞の単離後にはるかに高かったです。 CD34 + -selectionで単離された細胞と比較して、CD31の不均一な発現によって示されるように興味深いことに、フィブロネクチン上での培養の7日後に、細胞が不足しているCD34 + -selectionは、少ない均質な細胞集団を示しました。これらのデータは、CD34 + -selectionは、他の単球/マクロファージからのEPCを整理することが必要であることを示しています。このプロトコルの確立中に、我々は、37℃でMV2培地中でのCD34 + -selectionがはるかに低いTEと比較して、生存細胞数の増加をもたらすことを見出しました慎重に今後の研究で調査する必要があるmperatures、。私たちは、このプロトコルを適用する場合、37℃でのカルシウム含有培地中の抗体のインキュベーションは、非特異的相互作用につながると結合することができることを認識する必要があります。将来的には、より低い温度でカルシウムを欠く緩衝系はテスト済みであり、この潜在的な交絡因子を回避するために確立されるべきです。
以前に別の細胞型（ 例えば、ヒト臍静脈内皮細胞、HUVEC）37について記載したように特に、血清試料との細胞遊走実験の我々の予備的な分析の間に、測定が最初に、蛍光マイクロプレートリーダー、細胞のカルセイン染色を用いて行きました。チャンバ間で異なる吸光値は、単独の血清サンプルだけでなく、媒体のみならず、既に慎重に考慮する必要が測定された蛍光、に著しい影響を与えることを示しました。したがって、ワットEは、我々のプロトコルを適応した細胞は、光学顕微鏡を介して観察し、半自動化されたソフトウェアによってカウントすることが可能な測定システムに切り替えます。
EPCは、末梢血中の細胞の約0.1％を占め、これらの特定の細胞38を分離することは困難であるが、研究の印象的な数は、EPCのが有益な効果を提供し、手足の心筋39における虚血事象後の組織の血管新生を改善し得ることが示され、40。しかし、まだ、臨床実践にこれらの調査結果を翻訳すると、その臨床的関連性を評価するために、継続的な課題です。理由は以前に22、41が示されている別の化学誘引物質の分泌、上の多くの周術期因子の有意な影響によるものであろう。したがって、この研究の第二部、異なるCの役割心筋の設定におけるEPCの移行に関するytokinesは、I / Rを評価しました。したがって、心臓手術患者におけるサイトカインの血清濃度を測定しました。 MIFは、ならびにCXCL12およびCXCL8は著しい術中増加を示しました。バックin vitro実験にこれらの調査結果を翻訳すると、本研究の結果はCXCL12-も、in vitroで測定された生理学的濃度で、EPCの移行上のCXCL8媒介効果もないがあることを実証しました。記載EPC分離モデルとそれに続く遊走アッセイを使用して、MIFは、EPCの移行42の主要なメディエーターとして同定されました。この文脈において、カンツラーら。 MIFおよびVEGFは低酸素23の下EPCの移行に最も強い影響を与える実験的マウスモデルで実証されました。興味深いことに、VEGFの測定は、結合、Oから生じ得るVEGFの血中濃度に有意な術中変化がないことを示しますヘパリンの術中標準化されたアプリケーションにF VEGF。したがって、MIFは心臓手術患者におけるEPCの動員において血管新生ケモカインの中で支配的な役割を果たしている可能性があるし、それでも負傷43、44のサイトにEPCの人身売買を通じて心筋I / R後に開始し、治癒過程に寄与することができる、などMIFレベルは、心筋のI / Rが、それはEPCの動員にMIF媒介性の効果は心筋I / R 23後の心不全の予防に重要な意味を持っている心臓リモデリングと血管新生を、影響を与える可能性があるかどうか投機ままの直後に増加しました。しかしながら、このような分析に進む前に、さらに、EPCの異なるサブタイプを特徴付けるために、およびヒトの生物学におけるその機能的役割を評価することが重要です。この接続では、本プロトコルは、私を有効にするために、ヒト末梢血からのEPCを分離する方法についての信頼性の高い方法を提供し、さらに総合的な特性評価と今後の研究をtsで。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
著者は何の確認応答がありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibronectin | Biochrom AG | L7117 | Coating of T-75 flasks |
| Aqua ad iniectabilia | Fresenius Kabi | ||
| Endothelial cell growth medium MV2 | Promo Cell | C-22221 | |
| Endothelial cell growth medium MV2 SupplementMix | Promo Cell | C-39226 | |
| Ficoll-Paque plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | Density centrifugation |
| EasySep human CD34 positive Selection Kit | Stemcell Technologies | 18056 | Isolation of CD34+ cells |
| EasySep magnet | Stemcell Technologies | 18000 | |
| Accutase | Sigma-Aldrich | A6964-100ML | Detachment of cells |
| Corning HTS transwell 96 well permeable supports | Sigma-Aldrich | CLS3387-8EA | Migration system |
| Hoechst solution | ThermoFisher | 33342 | Staining of migrated cells |
| ImageJ | National institutes of health | xxx | Counting of migrated cells |
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