Isolering av endothelial stamceller fra friske frivillige og deres trekkende Potential påvirket av serumprøver etter hjerteoperasjon

Summary

Endoteliale progenitorceller (PP-) er avgjørende involvert i neovaskularisering av ischemiske vev. Denne fremgangsmåten beskriver isoleringen av humane EPCs fra perifert blod, i tillegg til identifikasjon av deres vandrings potensial mot serumprøver av hjerte kirurgiske pasienter.

Abstract

Endoteliale progenitorceller (EPCs) er rekruttert fra benmargen henhold patologiske tilstander som hypoksi og er avgjørende involvert i neovascularization av iskemiske vev. Opprinnelse, klassifisering og karakterisering av EPCs er komplekse; til tross, er det etablert to fremtredende under typer EPCs: såkalt "tidlig" EPCs (heretter benevnt tidlig-EPCs) og sen-utvekst EPCs (sen-EPCs). De kan klassifiseres ved biologiske egenskaper, så vel som ved sin opptreden under in vitro kultur. Mens "tidlig" EPCs vises på mindre enn en uke etter kultur av perifert blod-avledet mononukleære celler i EF-spesifikke media, kan sen-utvekst EPCs bli funnet etter 2-3 uker. Late-utvekst EPCs har vært kjent for å være direkte involvert i neovascularization, hovedsakelig gjennom sin evne til å differensiere til modne endotelceller, mens "tidlig" EPCs uttrykke ulike angiogene faktorer som EndogenOUS last for å fremme angiogenese i en parakrint måte. Under myokardiskemi / reperfusjon (I / R), ulike faktorer kontrollere homing av EPCs til regioner av blodkardannelse.

Makrofag migrasjon hemmende faktor (MIF) er en chemokin-lignende pro-inflammatorisk og allestedsnærværende uttrykt cytokin og ble nylig beskrevet å fungere som sentrale regulator av EPCs migrasjon ved fysiologiske konsentrasjoner ^1. Interessant er MIF lagret i intracellulære bassenger og kan raskt bli sluppet ut i blodet etter flere stimuli (f.eks hjerteinfarkt).
Denne protokollen beskriver en fremgangsmåte for pålitelig isolasjon og kultur av tidlig-EPCs fra voksent humant perifert blod basert på CD34-positiv utvelgelse med påfølgende kultur i medium inneholdende endoteliale vekstfaktorer for fibronektin-belagte plater for anvendelse i in vitro-migrasjons analyser mot serumprøver av hjerte kirurgiske pasienter. Viderevandrende innflytelse av MIF på kjemotaksen av EPCs sammenlignet med andre kjente angiogenese-stimulerende cytokiner er demonstrert.

Introduction

Endoteliale progenitorceller (PP-) er sirkulerer i menneskeblod, og har evnen til å differensiere til endotelceller ^2. De deltar i vaskulogenese og er i stand til å minimere skader forårsaket av betennelse og iskemi / reperfusjon (I / R) skader på ulike måter ^{3, 4.} For eksempel, EPCs viser forhøyede nivåer av intracellulære antioksidant enzymer som katalase, glutationperoksidase eller mangan superoksyddannende dismutaser (MnSOD) ^5. Den forhøyede motstand mot oksidativt stress kan EPCs å fungere i microenvironments med forhøyede reaktive oksygenforbindelser (ROS) etter iskemisk skade ^seks. Tidligere undersøkelser viste også at antallet EPCs kan bli korrelert til vaskulær reparere, og at et redusert antall sirkulerende EPCs spår forekomst av kardiovaskulære hendelser ^7,class = "xref"> 8. Imidlertid har en klar definisjon av en EPC ikke funnet ennå. Opp til nå, er det ingen spesifikk celleoverflaten markør eller konsekvent fenotype for EPCs og disse cellene er svært sjeldne i perifert blod ^9. Et menneske EPC bør betraktes som en sirkulerende celle med evnen til å bidra til gjenoppbyggingen av de skadde endotel og nye vaskulære strukturer.

En måte å isolere og karakterisere EPCs er gjennom adhesjon til fibronektin. Derved blir kapasiteten av disse cellene brukes for å vise en overlegen adhesjon til fibronektin belagte etter i forhold til type 1 kollagen, for eksempel ^{3, 10, 11.} Men andre funnet at plette mononukleære celler på fibronektin belagt retter uten foregående eller ytterligere rensetrinn fører til kolonier inkludert myeloide stamceller, monocytter og T-lymfocytter ^{12, 13, 14.} Videre, i dette tilfellet, kan blodplatene forurense den mononukleære celler (MNC) fraksjon, og derved overføre plasmamembranproteiner til enhver adherente celler ^15.

I tillegg til karakteriseringen ved in vitro assays adhesjonsegenskaper, er en kombinasjon av forskjellige celleoverflatemarkører som brukes til å beskrive en celletype betraktes som en EPC. I dette tilfellet, etter fibronektin-mediert adhesjon, blir cellene analyseres vedrørende deres endotel-lignende egenskaper. I denne prosessen, de to endotelcelle-assosierte markører, acetylert-low density lipoprotein (acLDL) og vaskulær endotelial vekstfaktor reseptor 2 (VEGFR-2, KDR), spille en rolle. Endoteliale celler og makrofager er blitt vist å spesifikt ta opp acLDL i en prosess som kalles "scavenger celle bane" ^16. En annen markørprotein er KDR som hoved VEGF-reseptor på endotelcellerceller ^17. Men som EPCs generelt dyrkes i medier supplert med endoteliale vekstfaktorer og føtalt kalveserum, er det mulig at makrofager, som også kan ha blitt feilaktig isolert, oppviser en endotelial-lignende markør profil. Som tidligere vist, hvis dyrket i en endothelial kondisjonerte medium, makrofager express "endotelceller spesifikke" proteiner ^18.

Generelt er det to kategorier av EPCs i flere undergrupper, som kan finnes i blodet eller dyrkes in vitro. Late-utvekst EPCs (sen-EPCs) vises etter 2-3 uker med kultur. Disse cellene er integrert fortere inn i et monolag av humane umbilikalvene endotelceller og kan danne kapillarrør ^19. Dessuten, såkalte "tidlig-EPCs" sirkulere i blodet i omtrent en uke og handle på en mer passiv måte gjennom å levere angiogene molekyler, slik som vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF), eller CXCL8 ^19. Pasienter med koronarsykdom (CAD) viste signifikant lavere mengder av tidlig EPCs sammenlignet med en kontrollgruppe uten CAD ^20. Interessant nok viste det samme gruppe høyere mengder av sen-EPCs sammenlignet med en kontrollgruppe. En annen studie viste at tidlig EPCs beskytte differensierte EPCs fra apoptose etter oksidative betingelser i en parakrint måte ^6. Derfor kan tidlige EPCs gi relevante beskyttende effekt gjennom migrasjon av andre celler i en auto- eller parakrint måte innenfor perifert blod.

Denne protokollen beskriver en metode for å rense tidlig-EPCs ved først å isolere PBMC-fraksjonen fra humant perifert blod og etterfølgende isolering av CD34 ⁺ celler fra PBMC-fraksjonen for å fjerne denne cellesuspensjon fra uønskede celler. CD34 er en markør, som brukes for isolering av humane hematopoietiske stamceller ⁹ </sup>. Etterpå, CD34 ⁺ -celler dyrkes på fibronektin-belagte vevskultur overflater. Etter tre dager blir mediet endret, og dermed miste alle ikke-adherente celler. Endelig er isolerte EPCs farget for å kontrollere opptaket av acLDL og tilstedeværelsen av KDR som endotelial celle-markør ved hjelp av fluorescens-aktivert cellesortering (FACS). Som en ekstra markør, analyserte vi blodplate endotelial celleadhesjonsmolekyl (PECAM-1, CD31), som også forekommer på endotelceller.

Restaurering av skadet eller infarkt hjerteinfarkt vev av økt rekruttering av EPCs tilhører intensivt undersøkte behandlingsstrategier i hjerte- og karsykdommer. Imidlertid er oversettelsen av eksperimentelle resultater til klinisk praksis fortsatt krevende, gitt det komplekse cellulære samspillet i menneskekroppen under forskjellige patofysiologiske tilstander. Videre er det myokardiale I / R-skade utløse en overdreven utskilling av forskjellige cytokiner, hormoner og vekst fac torer, som styrer homing av EPCs til regioner av blodkardannelse ^13. Som allerede vist, CXCL8, stromal celle-avledet faktor 1α (SDF-1α, CXCL12), VEGF og makrofag migrasjon hemmende faktor (MIF) er betydelig økt i serumprøver etter hjerteinfarkt I / R skade ^en. Blant disse faktorene, er en pleiotropisk MIF kjemokin-lignende cytokin med overveiende pro-inflammatoriske egenskaper. I motsetning til sin historiske navn, har MIF pro-trekkende funksjoner, fungerer som en sann chemokin på ulike celletyper ^{1, 21, 22.} MIF-mediert celle rekrutteringsprosesser har vært knyttet til kjemokinreseptorer CXCR2 og CXCR4, som MIF binder seg til og aktiverer i et ikke-beslektet måte ^21. Av notatet, EPCs uttrykker begge disse reseptorene på overflaten, som i tillegg blir oppregulert etter hypoksiske betingelserass = "xref"> ^{23, 24.} Dessuten foreslår akkumulerende bevis for at MIF har en samlet kardio-beskyttende effekt under I / R-skade av hjertet ^{22, 25, 26.} I denne sammenheng har det blitt ytterligere vist at MIF kan støtte neovascularization under hypoksisk stress som er spesielt relevant, da vurderer begrenset mekanismer for gjenoppretting av den skadde hjertemuskelen ^27. Tidligere in vitro-studier og eksperimenter i pre-kliniske musemodeller gitt første bevis om rollen til MIF i EPCs rekruttering ^fire. Av notatet, MIF også er en fremtredende last protein av EPCs som kan bli lansert i løpet av EPCs rekruttering innen iskemiske områder ^28. Men studier i kliniske settinger spesielt i sammenligning med andre (angiogene) serumcytokinene forblir unnvikende.

Protocol

Blood for isolering av EPCs ble hentet fra friske frivillige etter informert samtykke i samsvar med lokale etikkomité. Serumprøver som brukes i migrasjons analysene ble oppnådd fra pasienter som gjennomgikk konvensjonell hjertekirurgi med bruk av kardiopulmonal bypass (CPB). Eksklusjonskriterier var nødoperasjoner, kjent eller mistenkt graviditet, patient`s alder mindre enn 18 år, og unnlatelse av å innhente informert samtykke. Serumprøver ble tatt i tillegg til kliniske rutinemålinger (umiddelbart før operasjo…

Representative Results

Karakterisering av isolerte endotel stamceller Først ble opptaket av acLDL verifisert, så vel som ekspresjon av KDR, og CD31 på overflaten av den isolerte cellepopulasjon. Som figur 7a viser, 85,1% av de isolerte EPCs viste opptak av acLDL og uttrykt CD31. Figurene 7b og 7c viser videre en homogen fordeling av hvert merke, selv om det synes å være en mindre populasjon, negat…

Discussion

Den første delen av denne studien inkluderte isolering av menneskelige EPCs fra perifert blod fra friske frivillige for å muliggjøre en omfattende evaluering av blodet av hjertekirurgi. Derfor ble en tetthetsgradient sentrifugering utført for å separere PBMC fraksjonen fra plasma, granulocytter og erytrocytter. For å fjerne det meste av de forurensende blodplater, ble denne cellefraksjon utsettes for kort og langsom vasketrinn ^{29, 30.} Deretter ble CD34 <su…

Materials

Fibronectin	Biochrom AG	L7117	Coating of T-75 flasks
Aqua ad iniectabilia	Fresenius Kabi
Endothelial cell growth medium MV2	Promo Cell	C-22221
Endothelial cell growth medium MV2 SupplementMix	Promo Cell	C-39226
Ficoll-Paque plus	GE Healthcare	17-1440-03	Density centrifugation
EasySep human CD34 positive Selection Kit	Stemcell Technologies	18056	Isolation of CD34+ cells
EasySep magnet	Stemcell Technologies	18000
Accutase	Sigma-Aldrich	A6964-100ML	Detachment of cells
Corning HTS transwell 96 well permeable supports	Sigma-Aldrich	CLS3387-8EA	Migration system
Hoechst solution	ThermoFisher	33342	Staining of migrated cells
ImageJ	National institutes of health	xxx	Counting of migrated cells