Endothelial पूर्वज कोशिकाओं (निर्यात संवर्धन परिषदों) महत्वपूर्ण इस्कीमिक ऊतकों की neovascularization में शामिल रहे हैं। इस विधि परिधीय रक्त से मानव निर्यात संवर्धन परिषदों के अलगाव, साथ ही हृदय शल्य चिकित्सा के रोगियों के सीरम नमूनों के खिलाफ उनके प्रवासी क्षमता की पहचान का वर्णन है।
Endothelial पूर्वज कोशिकाओं (निर्यात संवर्धन परिषदों) हाइपोक्सिया जैसे रोग की स्थिति के तहत अस्थि मज्जा से भर्ती कर रहे हैं और महत्वपूर्ण इस्कीमिक ऊतकों की neovascularization में शामिल रहे हैं। मूल, वर्गीकरण और निर्यात संवर्धन परिषदों के लक्षण वर्णन जटिल कर रहे हैं; होते हुए भी, निर्यात संवर्धन परिषदों के दो प्रमुख उप-प्रकार स्थापित किया गया है: तथाकथित "जल्दी" निर्यात संवर्धन परिषदों और देर परिणाम निर्यात संवर्धन परिषदों (देर-निर्यात संवर्धन परिषदों) (बाद में के रूप में जल्दी-निर्यात संवर्धन परिषदों के लिए कहा गया है)। वे जैविक गुणों के साथ-साथ इन विट्रो संस्कृति के दौरान उनकी उपस्थिति से वर्गीकृत किया जा सकता है। "जल्दी" निर्यात संवर्धन परिषदों चुनाव आयोग विशिष्ट मीडिया में परिधीय रक्त प्राप्त mononuclear कोशिकाओं की संस्कृति के बाद कम से कम एक सप्ताह में दिखाई देते हैं, देर-परिणाम निर्यात संवर्धन परिषदों 2-3 सप्ताह के बाद पाया जा सकता है। देर परिणाम निर्यात संवर्धन परिषदों सीधे, neovascularization में शामिल होना मुख्य रूप से परिपक्व endothelial कोशिकाओं में अंतर करने की क्षमता के माध्यम से मान्यता दी गई है, जबकि "जल्दी" निर्यात संवर्धन परिषदों endogen के रूप में विभिन्न कारकों को व्यक्त एन्जियोजेनिकous माल एक पैराक्राइन ढंग से angiogenesis को बढ़ावा देने के लिए। myocardial ischemia / reperfusion (मैं / आर) के दौरान विभिन्न कारकों रक्त वाहिनियों के गठन के क्षेत्रों के लिए निर्यात संवर्धन परिषदों के घर वापस आना नियंत्रित करते हैं।
Macrophage प्रवास निरोधात्मक कारक (MIF) एक केमोकाइन की तरह समर्थक भड़काऊ और सर्वत्र व्यक्त साइटोकाइन है और हाल ही में शारीरिक सांद्रता 1 पर निर्यात संवर्धन परिषदों प्रवास के रूप में महत्वपूर्ण नियामक समारोह को वर्णित किया गया था। दिलचस्प बात यह है MIF intracellular पूल में जमा हो जाता है और तेजी से कई उत्तेजनाओं के बाद रक्त प्रवाह में जारी किया जा सकता है (उदाहरण के रोधगलन)।
इस प्रोटोकॉल वयस्क मानव परिधीय रक्त से विश्वसनीय अलगाव और जल्दी-निर्यात संवर्धन परिषदों की संस्कृति सीरम नमूनों के खिलाफ इन विट्रो प्रवास assays में उपयोग के लिए fibronectin लेपित प्लेटों पर endothelial वृद्धि कारकों युक्त मध्यम में बाद में संस्कृति के साथ CD34 पॉजिटिव चयन के आधार पर करने के लिए एक विधि का वर्णन हृदय शल्य चिकित्सा रोगियों की। इसके अलावा,अन्य प्रसिद्ध angiogenesis उत्तेजक साइटोकिन्स की तुलना में निर्यात संवर्धन परिषदों के chemotaxis पर MIF के प्रवासी प्रभाव प्रदर्शन किया है।
Endothelial पूर्वज कोशिकाओं (निर्यात संवर्धन परिषदों) मानव रक्त में घूम और endothelial कोशिकाओं 2 में अंतर करने की क्षमता होती है। वे vasculogenesis में भाग लेने और विभिन्न तरीकों से 3, 4 में सूजन और ischemia / reperfusion (मैं / आर) चोटों की वजह से नुकसान को कम करने में सक्षम हैं। उदाहरण के लिए, निर्यात संवर्धन परिषदों Catalase, glutathione peroxidase या मैंगनीज सुपरऑक्साइड dismutases (MnSOD) 5 की तरह intracellular एंटीऑक्सीडेंट एंजाइमों का ऊंचा स्तर दिखा। ऑक्सीडेटिव तनाव के खिलाफ बुलंद प्रतिरोध निर्यात संवर्धन परिषदों ऊंचा प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) इस्कीमिक चोट 6 के बाद से microenvironments में कार्य करने के लिए अनुमति देता है। पिछले अध्ययनों से यह भी संकेत दिया है कि निर्यात संवर्धन परिषदों की संख्या नाड़ी की मरम्मत करने के लिए और निर्यात संवर्धन परिषदों घूम की संख्या कम हृदय की घटनाओं 7 की घटना भविष्यवाणी की है कि सहसंबद्ध किया जा सकता है,वर्ग = "xref"> 8। हालांकि, एक ईपीसी की स्पष्ट परिभाषा अभी तक नहीं पाया गया है। अब तक, वहाँ कोई विशेष कोशिका की सतह मार्कर या निर्यात संवर्धन परिषदों के लिए लगातार phenotype है और इन कोशिकाओं परिधीय रक्त 9 में बहुत दुर्लभ हैं। एक मानव ईपीसी क्षमता घायल endothelium और नए संवहनी संरचनाओं के पुनर्निर्माण में योगदान करने के साथ एक घूम सेल के रूप में माना जाना चाहिए।
अलग-थलग करने और निर्यात संवर्धन परिषदों निस्र्पक का एक तरीका यह फ़ाइब्रोनेक्टिन के लिए आसंजन के माध्यम से है। इस प्रकार, इन कोशिकाओं की क्षमता, 1 कोलेजन टाइप करने के लिए उदाहरण के लिए 3, 10, 11 के लिए की तुलना में लेपित व्यंजन fibronectin करने के लिए एक बेहतर आसंजन को दिखाने के लिए प्रयोग किया जाता है। हालांकि, अन्य लोगों ने पाया है कि किसी भी पिछले या आगे की शुद्धि के बिना कदम fibronectin लेपित व्यंजन पर mononuclear कोशिकाओं चढ़ाना माइलॉयड पूर्वज कोशिकाओं, monocytes, और टी lymphocytes 1 सहित कालोनियों की ओर जाता है2, 13, 14। इसके अलावा, इस मामले में, प्लेटलेट्स mononuclear (एमएनसी) सेल अंश को दूषित कर सकता है और इस तरह की किसी भी पक्षपाती कोशिकाओं से 15 प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन हस्तांतरण।
इन विट्रो आसंजन assays के माध्यम से लक्षण वर्णन इसके अलावा, विभिन्न कोशिका की सतह मार्कर का एक संयोजन एक सेल प्रकार एक ईपीसी के रूप में माना वर्णन करने के लिए प्रयोग किया जाता है। इस मामले में, फ़ाइब्रोनेक्टिन की मध्यस्थता के बाद आसंजन, कोशिकाओं को अपनी endothelial-तरह विशेषताओं के विषय में विश्लेषण किया। इस प्रक्रिया में, दो endothelial सेल जुड़े मार्कर, acetylated-कम घनत्व वाले लिपोप्रोटीन (acLDL) और संवहनी endothelial वृद्धि कारक रिसेप्टर 2 (VEGFR -2, KDR), एक भूमिका निभाते हैं। Endothelial कोशिकाओं और मैक्रोफेज विशेष रूप से एक प्रक्रिया "मेहतर सेल मार्ग" 16 बुलाया में acLDL को लेने के लिए दिखाया गया है। एक और मार्कर प्रोटीन endothelial पर मुख्य वीईजीएफ़ रिसेप्टर के रूप में KDR हैकोशिकाओं को 17। हालांकि, के रूप में सामान्य रूप में निर्यात संवर्धन परिषदों endothelial वृद्धि कारक है और भ्रूण बछड़ा सीरम के साथ पूरक मीडिया में सुसंस्कृत हैं, यह संभव है कि मैक्रोफेज, गलती से भी अलग-थलग हो सकता है जो कुछ हुआ है, प्रदर्शनी एक endothelial-तरह मार्कर प्रोफ़ाइल। पहले से दिखाया गया है, यदि एक endothelial वातानुकूलित माध्यम में सुसंस्कृत, मैक्रोफेज एक्सप्रेस "endothelial-विशिष्ट" प्रोटीन 18।
सामान्य में, वहाँ रक्त में पाया जा सकता है या इन विट्रो में संवर्धित किया जा अधिक उपप्रकार के भीतर निर्यात संवर्धन परिषदों की दो श्रेणियां हैं। देर परिणाम निर्यात संवर्धन परिषदों (देर-निर्यात संवर्धन परिषदों) संस्कृति के 2-3 सप्ताह के बाद दिखाई देते हैं। इन कोशिकाओं को मानव नाल नस endothelial कोशिकाओं की एक monolayer में तेजी से एकीकृत कर रहे हैं और केशिका ट्यूब 19 फार्म कर सकते हैं। इसके अलावा, तथाकथित "जल्दी-निर्यात संवर्धन परिषदों" इस तरह के संवहनी endothelial वृद्धि के रूप में एन्जियोजेनिक अणुओं पहुंचाने के माध्यम से के बारे में एक सप्ताह के लिए और एक अधिक निष्क्रिय तरीके से कार्रवाई के लिए रक्त में प्रसारितकारक (VEGF), या CXCL8 19। कोरोनरी धमनी रोग (सीएडी) के साथ मरीजों को सीएडी 20 बिना एक नियंत्रण समूह की तुलना में जल्दी-निर्यात संवर्धन परिषदों की काफी कम मात्रा में पता चला है। दिलचस्प है, एक ही समूह के एक नियंत्रण समूह की तुलना में देर-निर्यात संवर्धन परिषदों की अधिक मात्रा से पता चला है। एक अन्य अध्ययन से पता चला है कि जल्दी-निर्यात संवर्धन परिषदों एक पैराक्राइन ढंग 6 में ऑक्सीडेटिव की शर्तों के तहत apoptosis से विभेदित निर्यात संवर्धन परिषदों की रक्षा करना। इसलिए, जल्दी निर्यात संवर्धन परिषदों परिधीय रक्त के भीतर एक ऑटो या पैराक्राइन तरीके से अन्य कोशिकाओं के प्रवास के माध्यम से प्रासंगिक सुरक्षात्मक प्रभाव प्रदान हो सकता है।
इस प्रोटोकॉल पहले मानव परिधीय रक्त से PBMC-अंश को अलग-थलग करने और बाद में अवांछित कोशिकाओं से इस सेल निलंबन स्पष्ट करने के PBMC-अंश से CD34 + कोशिकाओं को अलग-थलग करके जल्दी-निर्यात संवर्धन परिषदों को शुद्ध करने के लिए एक विधि का वर्णन है। CD34 एक मार्कर है, जो मानव hematopoietic स्टेम कोशिकाओं 9 के अलगाव के लिए इस्तेमाल किया जाता है </sup>। बाद में, CD34 + कोशिकाओं पर fibronectin लेपित टिशू कल्चर सतहों सुसंस्कृत हैं। तीन दिनों के बाद, मध्यम बदल जाता है, जिससे सभी गैर पक्षपाती कोशिकाओं को खोने। अंत में, अलग-थलग निर्यात संवर्धन परिषदों acLDL के तेज और प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS) का उपयोग करके endothelial सेल मार्कर के रूप में KDR की उपस्थिति सत्यापित करने के लिए दाग रहे हैं। एक अतिरिक्त मार्कर के रूप में, हम प्लेटलेट endothelial सेल आसंजन अणु (PECAM-1, CD31) है, जो भी endothelial कोशिकाओं पर होता है का विश्लेषण किया।
निर्यात संवर्धन परिषदों का बढ़ाया भर्ती से क्षतिग्रस्त या infarcted दौरे ऊतक की बहाली हृदय रोगों में अधिकता की जांच की उपचार रणनीतियों के अंतर्गत आता है। हालांकि, नैदानिक व्यवहार में प्रयोगात्मक परिणामों का अनुवाद अभी भी विभिन्न pathophysiological शर्तों के दौरान मानव शरीर में जटिल सेलुलर परस्पर क्रिया दी चुनौती दे रहा है। इसके अलावा, मैं दौरे / आर चोटों विभिन्न साइटोकिन्स, हार्मोन और विकास कारकों का एक अत्यधिक स्राव ट्रिगर tors, जो रक्त वाहिनियों के गठन के 13 क्षेत्रों के लिए निर्यात संवर्धन परिषदों के घर वापस आना नियंत्रित करते हैं। पहले से ही दिखाया गया है, CXCL8, stromal सेल व्युत्पन्न कारक 1α (एसडीएफ 1α, CXCL12), वीईजीएफ़ और बृहतभक्षककोशिका प्रवास निरोधात्मक कारक (MIF) काफी सीरम नमूनों में दौरे मैं / आर चोट 1 निम्नलिखित बढ़ रहे हैं। इन कारकों के अलावा, MIF मुख्य रूप से समर्थक भड़काऊ विशेषताओं के साथ एक pleiotropic केमोकाइन की तरह साइटोकाइन है। अपनी ऐतिहासिक नाम के विपरीत, MIF विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं 1, 21, 22 पर एक सच्चे केमोकाइन के रूप में अभिनय, समर्थक प्रवासी कार्य किया है। MIF की मध्यस्थता सेल भर्ती प्रक्रियाओं केमोकाइन रिसेप्टर्स CXCR2 और CXCR4, जो MIF को बांधता है और एक गैर आत्मीय तरीके से 21 में सक्रिय करने के लिए जोड़ा गया है। ध्यान से, निर्यात संवर्धन परिषदों उनकी सतह, पर इन रिसेप्टर्स जो इसके अतिरिक्त hypoxic शर्तों के तहत विनियमित बनने के दोनों का इजहारगधा = "xref"> 23, 24। इसके अलावा, जमते सबूत से पता चलता MIF दिल 22, 25, 26 के लिए मैं / आर चोट के दौरान एक समग्र कार्डियो-सुरक्षात्मक प्रभाव पड़ता है। इस संदर्भ में, यह आगे कहा कि MIF hypoxic तनाव विशेष रूप से प्रासंगिक है कि, जब घायल मायोकार्डियम 27 के सीमित वसूली तंत्र पर विचार के दौरान neovascularization समर्थन कर सकते हैं दिखाया गया है। पिछला इन विट्रो अध्ययन और पूर्व नैदानिक माउस मॉडल में प्रयोगों निर्यात संवर्धन परिषदों भर्ती 4 में MIF की भूमिका के बारे में पहले सबूत मुहैया कराए। ध्यान से, MIF भी निर्यात संवर्धन परिषदों के एक प्रमुख माल प्रोटीन है कि इस्कीमिक साइटों 28 के भीतर निर्यात संवर्धन परिषदों भर्ती के दौरान जारी किया जा सकता है। हालांकि, अन्य (एन्जियोजेनिक) सीरम साइटोकिन्स के साथ तुलना में विशेष रूप से नैदानिक सेटिंग में पढ़ाई के मायावी रहते हैं।
इस अध्ययन के पहले भाग के कार्डियक सर्जरी के रोगियों के खून की एक व्यापक मूल्यांकन सक्षम करने के लिए स्वस्थ स्वयंसेवकों के परिधीय रक्त से मानव निर्यात संवर्धन परिषदों के अलगाव शामिल थे। इसलिए, एक घनत्?…
The authors have nothing to disclose.
लेखकों कोई स्वीकृतियां है।
Fibronectin | Biochrom AG | L7117 | Coating of T-75 flasks |
Aqua ad iniectabilia | Fresenius Kabi | ||
Endothelial cell growth medium MV2 | Promo Cell | C-22221 | |
Endothelial cell growth medium MV2 SupplementMix | Promo Cell | C-39226 | |
Ficoll-Paque plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | Density centrifugation |
EasySep human CD34 positive Selection Kit | Stemcell Technologies | 18056 | Isolation of CD34+ cells |
EasySep magnet | Stemcell Technologies | 18000 | |
Accutase | Sigma-Aldrich | A6964-100ML | Detachment of cells |
Corning HTS transwell 96 well permeable supports | Sigma-Aldrich | CLS3387-8EA | Migration system |
Hoechst solution | ThermoFisher | 33342 | Staining of migrated cells |
ImageJ | National institutes of health | xxx | Counting of migrated cells |