Summary
Endoteliale progenitorceller (PP-) er avgjørende involvert i neovaskularisering av ischemiske vev. Denne fremgangsmåten beskriver isoleringen av humane EPCs fra perifert blod, i tillegg til identifikasjon av deres vandrings potensial mot serumprøver av hjerte kirurgiske pasienter.
Abstract
Endoteliale progenitorceller (EPCs) er rekruttert fra benmargen henhold patologiske tilstander som hypoksi og er avgjørende involvert i neovascularization av iskemiske vev. Opprinnelse, klassifisering og karakterisering av EPCs er komplekse; til tross, er det etablert to fremtredende under typer EPCs: såkalt "tidlig" EPCs (heretter benevnt tidlig-EPCs) og sen-utvekst EPCs (sen-EPCs). De kan klassifiseres ved biologiske egenskaper, så vel som ved sin opptreden under in vitro kultur. Mens "tidlig" EPCs vises på mindre enn en uke etter kultur av perifert blod-avledet mononukleære celler i EF-spesifikke media, kan sen-utvekst EPCs bli funnet etter 2-3 uker. Late-utvekst EPCs har vært kjent for å være direkte involvert i neovascularization, hovedsakelig gjennom sin evne til å differensiere til modne endotelceller, mens "tidlig" EPCs uttrykke ulike angiogene faktorer som EndogenOUS last for å fremme angiogenese i en parakrint måte. Under myokardiskemi / reperfusjon (I / R), ulike faktorer kontrollere homing av EPCs til regioner av blodkardannelse.
Makrofag migrasjon hemmende faktor (MIF) er en chemokin-lignende pro-inflammatorisk og allestedsnærværende uttrykt cytokin og ble nylig beskrevet å fungere som sentrale regulator av EPCs migrasjon ved fysiologiske konsentrasjoner 1. Interessant er MIF lagret i intracellulære bassenger og kan raskt bli sluppet ut i blodet etter flere stimuli (f.eks hjerteinfarkt).
Denne protokollen beskriver en fremgangsmåte for pålitelig isolasjon og kultur av tidlig-EPCs fra voksent humant perifert blod basert på CD34-positiv utvelgelse med påfølgende kultur i medium inneholdende endoteliale vekstfaktorer for fibronektin-belagte plater for anvendelse i in vitro-migrasjons analyser mot serumprøver av hjerte kirurgiske pasienter. Viderevandrende innflytelse av MIF på kjemotaksen av EPCs sammenlignet med andre kjente angiogenese-stimulerende cytokiner er demonstrert.
Introduction
Endoteliale progenitorceller (PP-) er sirkulerer i menneskeblod, og har evnen til å differensiere til endotelceller 2. De deltar i vaskulogenese og er i stand til å minimere skader forårsaket av betennelse og iskemi / reperfusjon (I / R) skader på ulike måter 3, 4. For eksempel, EPCs viser forhøyede nivåer av intracellulære antioksidant enzymer som katalase, glutationperoksidase eller mangan superoksyddannende dismutaser (MnSOD) 5. Den forhøyede motstand mot oksidativt stress kan EPCs å fungere i microenvironments med forhøyede reaktive oksygenforbindelser (ROS) etter iskemisk skade seks. Tidligere undersøkelser viste også at antallet EPCs kan bli korrelert til vaskulær reparere, og at et redusert antall sirkulerende EPCs spår forekomst av kardiovaskulære hendelser 7,class = "xref"> 8. Imidlertid har en klar definisjon av en EPC ikke funnet ennå. Opp til nå, er det ingen spesifikk celleoverflaten markør eller konsekvent fenotype for EPCs og disse cellene er svært sjeldne i perifert blod 9. Et menneske EPC bør betraktes som en sirkulerende celle med evnen til å bidra til gjenoppbyggingen av de skadde endotel og nye vaskulære strukturer.
En måte å isolere og karakterisere EPCs er gjennom adhesjon til fibronektin. Derved blir kapasiteten av disse cellene brukes for å vise en overlegen adhesjon til fibronektin belagte etter i forhold til type 1 kollagen, for eksempel 3, 10, 11. Men andre funnet at plette mononukleære celler på fibronektin belagt retter uten foregående eller ytterligere rensetrinn fører til kolonier inkludert myeloide stamceller, monocytter og T-lymfocytter 12, 13, 14. Videre, i dette tilfellet, kan blodplatene forurense den mononukleære celler (MNC) fraksjon, og derved overføre plasmamembranproteiner til enhver adherente celler 15.
I tillegg til karakteriseringen ved in vitro assays adhesjonsegenskaper, er en kombinasjon av forskjellige celleoverflatemarkører som brukes til å beskrive en celletype betraktes som en EPC. I dette tilfellet, etter fibronektin-mediert adhesjon, blir cellene analyseres vedrørende deres endotel-lignende egenskaper. I denne prosessen, de to endotelcelle-assosierte markører, acetylert-low density lipoprotein (acLDL) og vaskulær endotelial vekstfaktor reseptor 2 (VEGFR-2, KDR), spille en rolle. Endoteliale celler og makrofager er blitt vist å spesifikt ta opp acLDL i en prosess som kalles "scavenger celle bane" 16. En annen markørprotein er KDR som hoved VEGF-reseptor på endotelcellerceller 17. Men som EPCs generelt dyrkes i medier supplert med endoteliale vekstfaktorer og føtalt kalveserum, er det mulig at makrofager, som også kan ha blitt feilaktig isolert, oppviser en endotelial-lignende markør profil. Som tidligere vist, hvis dyrket i en endothelial kondisjonerte medium, makrofager express "endotelceller spesifikke" proteiner 18.
Generelt er det to kategorier av EPCs i flere undergrupper, som kan finnes i blodet eller dyrkes in vitro. Late-utvekst EPCs (sen-EPCs) vises etter 2-3 uker med kultur. Disse cellene er integrert fortere inn i et monolag av humane umbilikalvene endotelceller og kan danne kapillarrør 19. Dessuten, såkalte "tidlig-EPCs" sirkulere i blodet i omtrent en uke og handle på en mer passiv måte gjennom å levere angiogene molekyler, slik som vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF), eller CXCL8 19. Pasienter med koronarsykdom (CAD) viste signifikant lavere mengder av tidlig EPCs sammenlignet med en kontrollgruppe uten CAD 20. Interessant nok viste det samme gruppe høyere mengder av sen-EPCs sammenlignet med en kontrollgruppe. En annen studie viste at tidlig EPCs beskytte differensierte EPCs fra apoptose etter oksidative betingelser i en parakrint måte 6. Derfor kan tidlige EPCs gi relevante beskyttende effekt gjennom migrasjon av andre celler i en auto- eller parakrint måte innenfor perifert blod.
Denne protokollen beskriver en metode for å rense tidlig-EPCs ved først å isolere PBMC-fraksjonen fra humant perifert blod og etterfølgende isolering av CD34 + celler fra PBMC-fraksjonen for å fjerne denne cellesuspensjon fra uønskede celler. CD34 er en markør, som brukes for isolering av humane hematopoietiske stamceller 9 + -celler dyrkes på fibronektin-belagte vevskultur overflater. Etter tre dager blir mediet endret, og dermed miste alle ikke-adherente celler. Endelig er isolerte EPCs farget for å kontrollere opptaket av acLDL og tilstedeværelsen av KDR som endotelial celle-markør ved hjelp av fluorescens-aktivert cellesortering (FACS). Som en ekstra markør, analyserte vi blodplate endotelial celleadhesjonsmolekyl (PECAM-1, CD31), som også forekommer på endotelceller.
Restaurering av skadet eller infarkt hjerteinfarkt vev av økt rekruttering av EPCs tilhører intensivt undersøkte behandlingsstrategier i hjerte- og karsykdommer. Imidlertid er oversettelsen av eksperimentelle resultater til klinisk praksis fortsatt krevende, gitt det komplekse cellulære samspillet i menneskekroppen under forskjellige patofysiologiske tilstander. Videre er det myokardiale I / R-skade utløse en overdreven utskilling av forskjellige cytokiner, hormoner og vekst fac torer, som styrer homing av EPCs til regioner av blodkardannelse 13. Som allerede vist, CXCL8, stromal celle-avledet faktor 1α (SDF-1α, CXCL12), VEGF og makrofag migrasjon hemmende faktor (MIF) er betydelig økt i serumprøver etter hjerteinfarkt I / R skade en. Blant disse faktorene, er en pleiotropisk MIF kjemokin-lignende cytokin med overveiende pro-inflammatoriske egenskaper. I motsetning til sin historiske navn, har MIF pro-trekkende funksjoner, fungerer som en sann chemokin på ulike celletyper 1, 21, 22. MIF-mediert celle rekrutteringsprosesser har vært knyttet til kjemokinreseptorer CXCR2 og CXCR4, som MIF binder seg til og aktiverer i et ikke-beslektet måte 21. Av notatet, EPCs uttrykker begge disse reseptorene på overflaten, som i tillegg blir oppregulert etter hypoksiske betingelserass = "xref"> 23, 24. Dessuten foreslår akkumulerende bevis for at MIF har en samlet kardio-beskyttende effekt under I / R-skade av hjertet 22, 25, 26. I denne sammenheng har det blitt ytterligere vist at MIF kan støtte neovascularization under hypoksisk stress som er spesielt relevant, da vurderer begrenset mekanismer for gjenoppretting av den skadde hjertemuskelen 27. Tidligere in vitro-studier og eksperimenter i pre-kliniske musemodeller gitt første bevis om rollen til MIF i EPCs rekruttering fire. Av notatet, MIF også er en fremtredende last protein av EPCs som kan bli lansert i løpet av EPCs rekruttering innen iskemiske områder 28. Men studier i kliniske settinger spesielt i sammenligning med andre (angiogene) serumcytokinene forblir unnvikende.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Blood for isolering av EPCs ble hentet fra friske frivillige etter informert samtykke i samsvar med lokale etikkomité. Serumprøver som brukes i migrasjons analysene ble oppnådd fra pasienter som gjennomgikk konvensjonell hjertekirurgi med bruk av kardiopulmonal bypass (CPB). Eksklusjonskriterier var nødoperasjoner, kjent eller mistenkt graviditet, patient`s alder mindre enn 18 år, og unnlatelse av å innhente informert samtykke. Serumprøver ble tatt i tillegg til kliniske rutinemålinger (umiddelbart før operasjonen og umiddelbart etter myokardial reperfusjon / åpning av aorta-kryssklemme) og deretter lagret ved -80 ° C inntil endelige analysen. The Institutional Review Board (etiske komité, RWTH Aachen) godkjent denne studien. Pasientene viste en gjennomsnittsalder på 68,6 år og en gjennomsnittsvekt på 81,7 kg. Pre-eksisterende sykdommer som følger med: hypertensjon (65%), kronisk lungesykdom (19%), ekstra hjerte arteriopathy (16%), cerebral dysfunksjon (6%), ustabil angina (3%), nylig hjerteinfarkt (28% innen 90 d), kronisk nyresykdom (14%), leversykdom (2%) og diabetes (34%).
1. Belegg av T75 Flask:
- Forbered 5 ml fibronektin-løsning (1 mg human fibronektin fortynnet i 15 ml ultrarent vann) pr T75-kolbe.
- Tilsett oppløsningen til en T75-kolbe og vente til vannet er fordampet. For å unngå unødvendige avbrudd under isoleringsprosessen på grunn av fordampning, utføre denne prosess på forhånd (for eksempel over natten) og ved romtemperatur. Denne løsningen gir 4,44 ug fibronektin / cm2.
- Klargjør endotelial cellevekstmedium MV2 ved å supplere den basale MV2 medium med vekstfaktor kosttilskudd levert av produsenten.
2. Isolering av endotel progenitorceller (EPCs) fra 60 ml blod:
MERK: Som CD34-positiv utvelgelse cocktail ennd magnetiske kuler er kommersielt tilgjengelige i et utvalg kombinert kit, er det ingen konsentrasjoner levert av produsenten. Imidlertid, omtrent 100 ul av antistoffet er tilstrekkelige for behandling av opptil 5 x 10 8 celler. De magnetiske perler er fortynnet i vann, dekstran-belagt og om 5,000x mindre sammenlignet med andre kommersielt tilgjengelige kuler. For ytterligere informasjon, se produsentens anvisninger instrukser.
- Bland blod (med eller uten antikoagulantia) 1: 1 med Ca 2+ Mg 2+ -fri PBS.
- Tilsett 15 ml av tetthetsgradient oppløsning pr 50 ml tube. For ytterligere informasjon, se produsentens anvisninger instrukser.
- Sakte lag det fortynnede blod på toppen av densitetsgradienten løsning.
- Sentrifuger prøvene ved 2500 xg i 30 min med treg akselerasjon og uten bremsing.
- Samle forsiktig Buffy Coat lag av hver tube (figur 1) ved hjelp av en steril plast pipette og sette det inn i et annet rør.Unngå oppsamling av densitetsgradienten løsning. Den forventede PBMC utbyttet er ca 3-4 x 10 6 celler / ml blod.
Figur 1: Densitetsgradientsentrifugering av Bbuffy Coat på Ficoll Solution. Vist er et resultat av den densitetsgradient sentrifugering ved 2500 xg i 30 minutter på densitetsgradient løsning. Avbildet er erytrocytter og granulocytter (rød), den mononukleære cellefraksjon (white layer), plasma (gul), og den densitetsgradient-løsning (hvitaktig). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Fortynn det perifere blod mononukleære cellefraksjon med minst 3 volumer PBS og bland. Sentrifuger ved romtemperatur i 15 min ved 200 x g.
- Gjenta trinn 2,6 to ganger. </ Li>
- Aspirer supernatanten og resuspender cellepelleten i 5 ml MV2 medium.
- Tilsett 100 ul av humant CD34-antistoff (tilstrekkelig for å behandle opptil 5 x 10 8 celler) pr anvendt buffy coat og rotere i 15 minutter ved 37 ° C med 5% CO2.
- Tilsett 50 mL av dekstran-belagte magnetiske kuler pr anvendes buffy coat og rotere i 10 minutter ved 37 ° C med 5% CO2.
- Etter inkubering, overføres suspensjonen til FACS-rør med et maksimum på 3 ml i hvert rør. Større mengder vil ikke være tillatt med magneten.
- Sett FACS rør (e) inn magneten (e) og vente på 5 min.
- Kast supernatanten uten å trekke FACS rørene ut av magneten.
- Resuspender cellene i hvert FACS rør med 3 ml MV2 medium utenfor magneten.
- Gjenta trinn 02.12 til 02.14 to ganger.
- Trekk FACS rørene ut av magnetene og resuspender cellene i 3 ml MV2 medium.
- Overfør cellesuspensjonen inn i pre-belagte T75 flasks og legge til 17 mL MV2 medium per flaske.
MERK: Mediet bør skiftes etter 3 dager. Etter en uke, cellene vise spindel-lignende strukturer (figur 2), og er klar til bruk. For en overse isolasjon se figur 3.
Figur 2: Mikroskopisk Bilde av isolerte EPCs. Vist er et representativt bilde av isolert tidlig EPCs i en T75 kolbe før avløsning. Tilsynelatende er spindellignende struktur av EPCs. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Flytskjema Viser EPC isoleringsprosedyren. Avbildet er en ordning, visering de enkelte trinnene av EPC isolasjonsprotokoll. For en mer detaljert protokoll se del 2 i protokollen delen.
3. Migration analyse
- Fjern mediet fra EPCs i T75-kolbe.
- Vask med 5 ml PBS ved å riste den forsiktig.
- Fjern PBS og tilsett 5 ml kommersiell celle avløsning løsning. Vent inntil cellene er frittliggende (se under et mikroskop). Akselerere avløsning ved forsiktig å trykke på bunnen av flasken.
- Når cellene er frittliggende, raskt tilsett 5 ml fullstendig medium MV2 og overføre cellesuspensjonen inn i et annet rør.
- Sentrifuger ved 2000 xg i 5 min.
- Resuspender cellene i 5-10 ml PBS og sentrifuger på nytt ved 2000 xg i 5 min.
- Gjenta trinn 3.6.
- Resuspender cellepelleten i MV2 sultet medium (50.000 celler i 75 ul pr transmigrasjon vel er nødvendig).
MERK: Hvilken migrering system er nødvendig er avhengig av celletype og assay. Det er diff pore diameter erent og plate størrelser (antall brønner). For EPCs en porestørrelse på 5 um i 96 brønnsystemet er optimal. - Fremstille overføringsplaten ved å tilsette 235 pl av serumprøven (serum fortynnet 1: 5 i MV2 sultet medium) inn i det nedre kammer (figur 4).
Figur 4: Migrasjon analysen i en modifisert Boyden kammer. Vist er den generelle konstruksjon av et modifisert Boyden kammer. Cellekulturinnsatser (= øvre kammer) er angitt i mørkeblå og er satt inn i det nedre kammer. Bunnen (men ikke veggene) av disse innsatsene utgjør filtersystemet, inkludert i porene. (A) viser oppsettet på tidspunkt null. (B) Etter en valgt tidspunkt, blir cellene overført gjennom filteret i retning av en stimulus.fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Legg innsatsen kort tid før du legger cellen løsningen.
- Legg 75 mL av celleløsning (= 50.000 celler) inn i det øvre kammer.
- La EPCs migrere i 3 timer ved 37 ° C og 5% CO2 (migrering Tiden avhenger av celletype og system).
- For å unngå serum auto-fluorescens gjenstander, kvantifisere migrerte celler ved å ta bilder av brønnen under et mikroskop og telle cellene ved hjelp av semi-automatisert programvare "ImageJ".
- Fjern det øvre kammer (inneholdende alle ikke-migrerte celler).
- Legg 70 mL 3,6% paraformaldehyde løsning, inkludert Hoechst fargestoff (fortynnet 1: 1000). Platen kan oppbevares ved 37 ° C og 5% CO2 over natten.
- Sentrifuger plate kort tid for å få alle celler i det samme fokalplan ved 2000 x g i 1-2 min.
- Ta 5 bilder per well (figurene 5 og 6) med en 100x forstørrelse.
Figur 5: Skjema som viser plasseringen av den tatt bilder. Ordningen viser posisjonen av de fem tatt bilder, som er nødvendig for bestemmelse av migrerte celler, i forhold til brønnen. Bildene blir tatt for å telle cellene og beregne en middelverdi for hver brønnen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: Mikroskopisk bilde for Cell Kvantifisering. Vist er et representativt bilde, som ble tatt for celle kvantifisering. Cellene ble farget og fikset USIng Hoechst fargestoff i 3,6% paraformaldehyde. Prikkene representerer fiksert og farget endoteliale progenitorceller. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Tell de migrerte celler ved hjelp av semi-automatisert programvare "ImageJ" av National Institute of Health.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Karakterisering av isolerte endotel stamceller
Først ble opptaket av acLDL verifisert, så vel som ekspresjon av KDR, og CD31 på overflaten av den isolerte cellepopulasjon. Som figur 7a viser, 85,1% av de isolerte EPCs viste opptak av acLDL og uttrykt CD31. Figurene 7b og 7c viser videre en homogen fordeling av hvert merke, selv om det synes å være en mindre populasjon, negativ for begge markører. I et andre trinn ble FACS-analyse av acLDL i kombinasjon med KDR utført. Figur 8a viser at over 80% av de isolerte celler viste en opptak av acLDL og ekspresjon av KDR på deres overflate. Tall 8b og 8c viser homogenitet av disse markørene.
For å verifisere importance av fibronektin-belagt retter under kultur tid, en sammenligning av de tre merkene mellom isolerte celler etter to dager med kultur på en fibronektin-belagt overflate med isolerte EPCs etter syv dager med kultur på fibronektin-belagt retter (som nevnt i vår protokoll) ble utført, både med forrige CD34 + -selection. Som vist på figur 9a, bare 46,4% av to-dagers-dyrkede celler viste en opptak av acLDL, så vel som et uttrykk for CD31 på deres overflate, sammenlignet med 85% av cellene etter syv dagers dyrking på fibronektin. Dessuten er histogrammer (figur 9b og 9c) viser mindre intensitet av hvert merke etter to dagers dyrking i forhold til syv dager (figur 7b og 7c). Det samme gjelder for en kombinasjon av markørene acLDL og DDF. Etter to dagers dyrking på fibronektin, bare 68,0% av alle celler viste en opptak av acLDL, så vel som et uttrykk for KDR på deres overflate (figurs 10a-10c). Etter syv dagers dyrking på fibronektin, 83,6% av cellene viste en opptak av acLDL og ekspresjon av KDR på deres overflate (figurene 8a-8c).
I et neste trinn ble betydningen av CD34 + -selection under isolering av EPCs evaluert. Derfor celler som er valgt i henhold til denne protokoll, inkludert densitetsgradientsentrifugering og sju dager med kultur på fibronektin, men som savnet CD34 + -selection ble isolert. Som vist i figur 10a, over 18% av alle isolerte celler gjør hverken uttrykte CD31 og heller ikke viser en opptak av acLDL, sammenlignet med mindre enn 8% etter CD34 + -selection, som viser et CD31 ekspresjon og et opptak av acLDL (figur 7a) . I tillegg Figurene 11b og 11c viser at de isolerte celler er meget inhomogene angående begge markørene sammenlignet med den som gjelder
Serum cytokinnivåer Under Cardiac Surgery
For å identifisere påvirkning av kardial kirurgi etter myokardialt I / R på konsentrasjoner av sirkulerende serumnivåer av MIF, CXCL12, CXCL8 og VEGF, ble serumprøver trukket pre- og intraoperativt for den etterfølgende analyse av kommersielt tilgjengelig ELISA (figur 12) . Serumnivåer av MIF viste en signifikant intraoperativ økning i forhold til utgangsverdien (100,3 ng / ml vs. 127,4 ng / ml, p = 0,027). Likeledes, CXCL12 nivåer viste en signifikant økning i serum under operasjonen (0,101 ng / ml sammenlignet med 0,198 ng / ml, p = 0,011). På samme måte som MIF og CXCL12, CXCL8 økt betydelig i løpet av kirurgi (0,15 ng / ml sammenlignet med 0,3 ng / ml, p = 0,022). i fortsRast, hadde VEGF-konsentrasjoner ikke viser noen signifikante endringer i løpet av observasjonsperioden (0,154 ng / ml vs. 0,134 ng / ml, p = 0,583) 1.
Migrasjon Kapasitet på endotel stamceller
For å undersøke den direkte effekten av pasienters serumprøver og deri inneholdt cytokiner / chemokiner / angiogene faktorer på EPC migrasjon, en ex vivo migrasjon analysen bruker serumprøver, som ble trukket før og under operasjonen, ble utført. EPCs ble isolert fra friske frivillige. Som vist i figur 13, EPC migrasjonsrate betydelig økt mot intraoperativt tatt prøver i forhold til pre-operativt tatt prøver (+ 35% sammenlignet med utgangspunktet, p = 0,047).
Siden tidligere studier allerede vist at jeg / R utløser en utskillelse av sevtater cytokiner som modulerer leukocytter chemotaxis og migrasjon, migrasjon analyser ved hjelp av disse potensielle chemoattractants, inkludert MIF, CXCL12, CXCL8, og VEGF ble utført. For å få en bedre forståelse av påvirkning av disse cytokinene på EPC rekruttering in vivo, men ytterligere in vitro-migreringsforsøk ved å bruke de fysiologisk målte konsentrasjoner av de ovennevnte cytokiner til det nedre kammer av migrasjon enheter ble utført, også.
Som MIF-serumkonsentrasjoner mellom 100 og 130 ng / ml var blitt målt (figur 12), en konsentrasjon på 100 ng / ml av rekombinant MIF ble anvendt, noe som førte til en> 6-gangers økning i EPC migrasjon sammenlignet med mediumkontroll ( figur 14). I motsetning til dette, serumkonsentrasjonen av CXCL12, CXCL8, og VEGF var i området av 150 - 300 pg / ml. Av notatet, gjorde disse konsentrasjonene ikke megle noen effekt på EPC migrasjon in vitro(Figur 14). Det kan derfor tenkes at det blant disse fire cytokiner, MIF viser den relative sterkest innflytelse på EPC migrasjon in vivo en.
Figur 7: FACS Analyse av Isolerte EPCs på dag 7. (a) Vist er opptaket av acLDL og CD31 celleoverflaten uttrykk for isolerte EPCs etter CD34 + utvalg og 7 dagers kulturperiode på fibronektin-belagt retter. Øvre venstre: Celler viser opptak av acLDL, men ikke uttrykke CD31. Øvre høyre: Celler viser opptak av acLDL og uttrykker CD31. Nederst til venstre: Celler viser ingen opptak av acLDL og uttrykker ikke CD31. Nederst til høyre: Celler viser ingen opptak av acLDL, men uttrykker CD31. (B) Vist er histogrammet av PE-konjugert acLDL etter opptak av isolerte EPCs. (C) Vist er histogrammet av FITC-conjugated CD31 antistoff etter binding til celleoverflaten CD31 av isolerte EPCs. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8: FACS Analyse av Isolerte EPCs på dag 7. (a) Vist er opptaket av acLDL og KDR celleoverflaten uttrykk for isolerte EPCs etter CD34 + utvalg og 7 dagers kulturperiode på fibronektin-belagt retter. Øvre venstre: cellene vise opptak av acLDL, men uttrykker ikke KDR. Øvre høyre: Celler viser opptak av acLDL og uttrykke KDR. Nederst til venstre: Celler viser ingen opptak av acLDL og uttrykker ikke KDR. Nederst til høyre: Celler viser ingen opptak av acLDL, men uttrykker KDR. (B) Vist er histogrammet av PE-konjugert acLDL etter opptak av isolerte EPCs. (C) Det er vist athistogram av FITC-konjugert KDR antistoff etter binding til celleoverflaten KDR av isolerte EPCs. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 9: FACS Analyse av Isolerte EPCs på dag 2. (a) Vist er opptaket av acLDL og CD31 celleoverflaten uttrykk for isolerte EPCs etter CD34 + utvalg og 2 dagers kulturperiode på fibronektin-belagt retter. Øvre venstre: cellene vise opptak av acLDL, men ikke uttrykke CD31. Øvre høyre: Celler viser opptak av acLDL og uttrykker CD31. Nederst til venstre: Celler viser ingen opptak av acLDL og uttrykker ikke CD31. Nederst til høyre: Celler viser ingen opptak av acLDL, men uttrykker CD31. (B) Vist er histogrammet av PE-konjugert acLDL etter opptak av isolerte EPCs. (
Figur 10: FACS Analyse av Isolerte EPCs på dag 2. (a) Vist er opptaket av acLDL og KDR celleoverflaten uttrykk for isolerte EPCs etter CD34 + utvalg og 2 dagers kulturperiode på fibronektin-belagt retter. Øvre venstre: cellene vise opptak av acLDL, men uttrykker ikke KDR. Øvre høyre: Celler viser opptak av acLDL og uttrykke KDR. Nederst til venstre: Celler viser ingen opptak av acLDL og uttrykker ikke KDR. Nederst til høyre: Celler viser ingen opptak av acLDL, men uttrykker KDR. (B) Vist er histogrammet av PE-konjugert acLDL etter opptakav isolerte EPCs. (C) Det er vist histogrammet av FITC-konjugert KDR antistoff etter binding til celleoverflate KDR av isolerte EPCs. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 11: FACS Analyse av Isolerte EPCs på dag 7. (a) Vist er opptaket av acLDL og CD31 celleoverflaten uttrykk for isolerte EPCs uten tidligere CD34 + utvalg, men inkludert 7 dagers kulturperiode på fibronektin-belagt retter. Øvre venstre: Celler viser opptak av acLDL, men ikke uttrykke CD31. Øvre høyre: Celler viser opptak av acLDL og uttrykker CD31. Nederst til venstre: Celler viser ingen opptak av acLDL og uttrykker ikke CD31. Nederst til høyre: Celler viser ingen opptak av acLDL, men uttrykker CD31. (B) Vister histogrammet av PE-konjugert acLDL etter opptak av isolerte EPCs. (C) Det er vist histogrammet av FITC-konjugert CD31-antistoff etter binding til celleoverflate CD31 av isolerte EPCs. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 12: Serum cytokinnivåer Under Cardiac Surgery. Måling av serumkonsentrasjonen av CXCL8, VEGF, CXCL12, og MIF av pasienter som gjennomgikk hjertekirurgi ved hjelp av ELISA. Vist er gjennomsnittsverdier for pre-operative forhold til intra-operative konsentrasjoner ± SEM (*: p <0,05, kontra pre-OP)
Figur 13: In Vitro Migrering av EPCs nærmere pasienten Serum. Vist er den intraoperativ økning i EPC migrasjon av friske frivillige mot serumprøver av pasienter som gjennomgikk hjertekirurgi. 50.000 celler per brønn i MV2 serumsultede medium ble tilsatt til det øvre kammer i et Transwell system. Serumprøvene i det nedre kammer ble fortynnet 1: 5 med det samme mediet. Cellene overføres i 3 timer ved 37 ° C og 5% CO2 gjennom en 5 um membran. Stolpene representerer gjennomsnittsverdier ± SEM (*: p <0,05)
Figur 14: In Vitro Migrering av EPCs Mot rekombinant cytokiner. Vist er migrering av EPCs mot representative konsentrasjoner av rekombinant CXCL8, CXCL12, VEGF, og MIF sammenlignet med serum-sultet medium (= grunnlinje). Bare MIF var i standå formidle en økt EPC migrasjon ved fysiologisk målt konsentrasjoner. De rekombinante cytokiner ble fortynnet i MV2 serumsultede medium. Cellene overføres til 3 timer gjennom en 5 um membran. Stolpene representerer gjennomsnittsverdier ± SEM (**: p <0,01 vs. serumsultede medium)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den første delen av denne studien inkluderte isolering av menneskelige EPCs fra perifert blod fra friske frivillige for å muliggjøre en omfattende evaluering av blodet av hjertekirurgi. Derfor ble en tetthetsgradient sentrifugering utført for å separere PBMC fraksjonen fra plasma, granulocytter og erytrocytter. For å fjerne det meste av de forurensende blodplater, ble denne cellefraksjon utsettes for kort og langsom vasketrinn 29, 30. Deretter ble CD34 + -celler isolert fra den resterende del for å skille stamceller fra de gjenværende lymfocytter og monocytter. Til slutt, ble cellesuspensjonen dyrket på fibronektin-belagte retter i en kommersielt tilgjengelig endotelial cellevekstmedium for å separere endoteliale progenitorceller fra andre (forløper) celler i den myeloide cellelinjen 3. Av notatet, er det diskutert at blodplater kan vise en CD34 celleoverflaten expression, også. Selv om det tidligere studier demonstrert binding av noen anti-CD34-antistoffer mot blodplater, kan dette være en gjenstand på grunn av aggregering av blodplater med andre (CD34-positive) celler 31, 32. Imidlertid kan de fleste blodplater separeres ved gjentatte langsomme vasketrinn. Foruten blodplater, deres forløpere - megakaryocytter - uttrykker dette blodkreft stamcelle antigen og kan være til stede i perifert blod, selv om de er i hovedsak funnet i benmargen 33, 34. Videre er det også beskrevet at celleoverflatemarkør CD34, anvendt i denne protokollen er uttrykt i meget lave nivåer i modne endotelceller 35. Derfor er det viktig å forsiktig vurdere en mulig forurensning av blodplater / megakaryocytter eller modne endotelceller, når isolere EPCs. Derfor steg 2,6 er av særlig relevans i isolation av EPCs å fjerne blodplater.
For å klargjøre viktigheten av å dyrke de isolerte cellene på fibronektin-belagt retter, cellepopulasjoner etter to dager og sju dager med kultur på fibronektin ble sammenlignet både med tidligere CD34-positive valg. På dag to, mindre enn halvparten av de isolerte cellene viste en opptak av acLDL og samtidig ekspresjon av CD31 på deres overflate. Videre kan en mindre intens uttrykk for begge merkene på om histogrammer bli sett. Disse data viser at syv dagers dyrking på fibronektin i den endotelcelle-spesifikt medium er nødvendig for å få EPCs som viser karakteristiske endoteliale uttrykk mønstre. I dette trinnet, er det av betydning å bruke riktig konsentrasjon / mengde av fibronektin. Wijelath og medarbeidere tidligere vist at fibronektin fremmer ekspresjonen av endotelcelle-lignende mønster, mest sannsynlig i kombinasjon med VEGF-36.
I neste step av protokollen, ble betydningen av CD34 + -selection av cellesuspensjonen undersøkt, sammenligner-celler isolert etter 7 dagers dyrking på fibronektin-belagt retter, med og uten foregående CD34 + -selection. Mengden av celler som mangler begge merkene (acLDL opptak og CD31 uttrykk) var mye høyere etter celle isolasjon uten foregående CD34 + -selection forhold til isolasjon inkludert dette trinnet. Interessant, etter syv dagers dyrking på fibronektin, celler som mangler CD34 + -selection viste en mindre homogen cellepopulasjon, som indikert av den inhomogene ekspresjon av CD31 sammenlignet med celler, isolert med CD34 + -selection. Disse data viser at CD34 + -selection er nødvendig for å sortere ut EPCs fra andre monocytter / makrofager. Under etableringen av denne protokollen, har vi funnet at CD34 + -selection i MV2 medium ved 37 ° C fører til et økt antall overlevende celler, sammenlignet med mye lavere temperatures, som må nøye undersøkt i fremtidige studier. Vi må erkjenne at ved anvendelse av denne protokollen, antistoffet inkubering i kalsium-inneholdende medium ved 37 ° C kan føre til ikke-spesifikke interaksjoner og binding. I fremtiden bør buffersystemer mangler kalsium ved lavere temperaturer testes og etablert for å unngå dette potensielle problemfaktor.
Spesielt, under foreløpig analyse av cellemigreringsforsøk med serumprøver, målingene ble først utført ved bruk av en fluorescens mikroplateavleser og calcein-farging av cellene, som tidligere beskrevet for forskjellige celletyper (f.eks humane umbilikalvene endotelceller, HUVEC) 37. De forskjellige ekstinksjonsverdier mellom kamrene indikerte at ikke bare de serumprøvene alene, men også det medium som allerede har en bemerkelsesverdig innflytelse på den målte fluorescens, som må vurderes nøye. Derfor we innrettet til vår protokoll og byttet til et målesystem i hvilket cellene kan observeres via lysmikroskopi og telt ved hjelp av en semi-automatisert programvare.
Mens EPCs utgjør ca 0,1% av celler i perifert blod, og det er vanskelig å isolere disse spesifikke celler 38, en imponerende rekke studier har indikert at EPCs kan gi positive effekter og forbedre vev vaskularisering etter iskemiske hendelser i lemmer og i hjertemuskelen 39 , 40. Likevel er det fortsatt en pågående utfordring å oversette disse funnene i klinisk praksis og å evaluere klinisk relevans. Årsakene kan være på grunn av den betydelig innflytelse av mange faktorer perioperative på utskillelsen av forskjellige kjemoattraktanter, som er blitt vist tidligere 22, 41. Derfor, i den andre delen av denne studien, rollen av forskjellig cytokines på migrasjon av EPCs i innstillingen av hjerteinfarkt I / R ble evaluert. Derfor ble serumkonsentrasjonen av cytokiner i hjertekirurgi målt. MIF, samt CXCL12 og CXCL8 viste en betydelig intraoperativ økning. Ved omregning av disse funnene tilbake inn i in vitro forsøk foreliggende resultater viser at det er hverken en CXCL12- eller CXCL8-mediert effekt på EPC migrasjon ved de målte fysiologiske konsentrasjoner in vitro. Ved hjelp av den beskrevne EPC isolasjon modell og den påfølgende migrasjon analysen ble MIF identifisert som en dominerende formidler av EPC migrasjon 42. I denne sammenheng Kanzler et al. demonstreres i en eksperimentell musemodell som MIF og VEGF gi den sterkeste virkning på EPC migrasjon i henhold til hypoksi 23. Interessant nok målinger av VEGF viser at det ikke er noen signifikant intraoperativ endring i VEGF blodkonsentrasjoner, noe som kan resultere fra binding of VEGF til intraoperativ standardisert anvendelse av heparin. Derfor kan MIF spille en dominerende rolle blant de angiogene kjemokiner i rekrutteringen av EPCs i hjertekirurgi og kan iverksette og bidra til helbredelsesprosessen etter hjerteinfarkt I / R gjennom handel med EPCs til stedet av skader 43, 44 Likevel, som MIF-nivåene økte umiddelbart etter myokard-i / R, det forblir spekulativ hvorvidt den MIF-mediert effekt på rekrutteringen av EPCs kan påvirke hjerte- remodellering og angiogenese, som har betydelige konsekvenser i forebygging av hjertesvikt etter myokardialt i / R 23. Imidlertid, før det fortsettes slik analyse, er det viktig å ytterligere karakterisere de forskjellige subtyper av EPCs og for å evaluere dens funksjonelle rolle i human biologi. I den forbindelse gir protokoll en pålitelig metode på hvordan å isolere EPCs fra humant perifert blod for å mulig jegts ytterligere omfattende karakterisering og fremtidige studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne har ingen bekreftelser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibronectin | Biochrom AG | L7117 | Coating of T-75 flasks |
| Aqua ad iniectabilia | Fresenius Kabi | ||
| Endothelial cell growth medium MV2 | Promo Cell | C-22221 | |
| Endothelial cell growth medium MV2 SupplementMix | Promo Cell | C-39226 | |
| Ficoll-Paque plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | Density centrifugation |
| EasySep human CD34 positive Selection Kit | Stemcell Technologies | 18056 | Isolation of CD34+ cells |
| EasySep magnet | Stemcell Technologies | 18000 | |
| Accutase | Sigma-Aldrich | A6964-100ML | Detachment of cells |
| Corning HTS transwell 96 well permeable supports | Sigma-Aldrich | CLS3387-8EA | Migration system |
| Hoechst solution | ThermoFisher | 33342 | Staining of migrated cells |
| ImageJ | National institutes of health | xxx | Counting of migrated cells |
References
- Emontzpohl, C., et al. Key role of MIF in the migration of endothelial progenitor cells in patients during cardiac surgery. Int J Cardiol. 181C, 284-287 (2014).
- Smadja, D. M., et al. Interleukin 8 is differently expressed and modulated by PAR-1 activation in early and late endothelial progenitor cells. J Cell Mol Med. 13 (8B), 2534-2546 (2009).
- Asahara, T., et al. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science. 275 (5302), 964-967 (1997).
- Simons, D., et al. Hypoxia-induced endothelial secretion of macrophage migration inhibitory factor and role in endothelial progenitor cell recruitment. J Cell Mol Med. 15 (3), 668-678 (2011).
- Dernbach, E., et al. Antioxidative stress-associated genes in circulating progenitor cells: evidence for enhanced resistance against oxidative stress. Blood. 104 (12), 3591-3597 (2004).
- Yang, Z., et al. Paracrine factors secreted by endothelial progenitor cells prevent oxidative stress-induced apoptosis of mature endothelial cells. Atherosclerosis. 211 (1), 103-109 (2010).
- Asahara, T., Kawamoto, A., Masuda, H. Concise review: Circulating endothelial progenitor cells for vascular medicine. Stem Cells. 29 (11), 1650-1655 (2011).
- Schmidt-Lucke, C., et al. Reduced number of circulating endothelial progenitor cells predicts future cardiovascular events: proof of concept for the clinical importance of endogenous vascular repair. Circulation. 111 (22), 2981-2987 (2005).
- Yoder, M. C.
- Ito, H., et al. Endothelial progenitor cells as putative targets for angiostatin. Cancer Res. 59 (23), 5875-5877 (1999).
- Hill, J. M., et al. Circulating endothelial progenitor cells, vascular function, and cardiovascular risk. N Engl J Med. 348 (7), 593-600 (2003).
- Yoder, M. C., et al. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109 (5), 1801-1809 (2007).
- Rohde, E., et al. Blood monocytes mimic endothelial progenitor cells. Stem Cells. 24 (2), 357-367 (2006).
- Rohde, E., et al. Immune cells mimic the morphology of endothelial progenitor colonies in vitro. Stem Cells. 25 (7), 1746-1752 (2007).
- Prokopi, M., et al. Proteomic analysis reveals presence of platelet microparticles in endothelial progenitor cell cultures. Blood. 114 (3), 723-732 (2009).
- Voyta, J. C., Via, D. P., Butterfield, C. E., Zetter, B. R. Identification and isolation of endothelial cells based on their increased uptake of acetylated-low density lipoprotein. J Cell Biol. 99 (6), 2034-2040 (1984).
- Koch, S., Claesson-Welsh, L. Signal transduction by vascular endothelial growth factor receptors. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (7), a006502 (2012).
- Hirschi, K. K., Ingram, D. A., Yoder, M. C. Assessing identity, phenotype, and fate of endothelial progenitor cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28 (9), 1584-1595 (2008).
- Hur, J., et al. Characterization of two types of endothelial progenitor cells and their different contributions to neovasculogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24 (2), 288-293 (2004).
- Tagawa, S., et al. Determination of Early and Late Endothelial Progenitor Cells in Peripheral Circulation and Their Clinical Association with Coronary Artery Disease. Int J Vasc Med. , 2015 (2015).
- Bernhagen, J., et al. MIF is a noncognate ligand of CXC chemokine receptors in inflammatory and atherogenic cell recruitment. Nat Med. 13 (5), 587-596 (2007).
- Stoppe, C., et al. Interaction of MIF Family Proteins in Myocardial Ischemia/Reperfusion Damage and Their Influence on Clinical Outcome of Cardiac Surgery Patients. Antioxid Redox Signal. 23 (11), 865-879 (2015).
- Kanzler, I., et al. Differential roles of angiogenic chemokines in endothelial progenitor cell-induced angiogenesis. Basic Res Cardiol. 108 (1), 310 (2013).
- Walenta, K. L., Bettink, S., Bohm, M., Friedrich, E. B. Differential chemokine receptor expression regulates functional specialization of endothelial progenitor cell subpopulations. Basic Res Cardiol. 106 (2), 299-305 (2011).
- Rassaf, T., Weber, C., Bernhagen, J. Macrophage migration inhibitory factor in myocardial ischaemia/reperfusion injury. Cardiovasc Res. 102 (2), 321-328 (2014).
- Stoppe, C., et al. High postoperative blood levels of macrophage migration inhibitory factor are associated with less organ dysfunction in patients after cardiac surgery. Mol Med. 18, 843-850 (2012).
- Amin, M. A., et al. Migration inhibitory factor mediates angiogenesis via mitogen-activated protein kinase and phosphatidylinositol kinase. Circ Res. 93 (4), 321-329 (2003).
- Kupatt, C., et al. Embryonic endothelial progenitor cells expressing a broad range of proangiogenic and remodeling factors enhance vascularization and tissue recovery in acute and chronic ischemia. FASEB J. 19 (11), 1576-1578 (2005).
- Colotta, F., et al. Expression of a monocyte chemotactic cytokine by human mononuclear phagocytes. J Immunol. 148 (3), 760-765 (1992).
- Casale, T. B., Kaliner, M. A rapid method for isolation of human mononuclear cells free of significant platelet contamination. J Immunol Methods. 55 (3), 347-353 (1982).
- Lewandowska, K., Kaplan, D., Husel, W. CD34 expression on platelets. Platelets. 14 (2), 83-87 (2003).
- Stellos, K., et al. Platelet-derived stromal cell-derived factor-1 regulates adhesion and promotes differentiation of human CD34+ cells to endothelial progenitor cells. Circulation. 117 (2), 206-215 (2008).
- Thornton, M. A., Poncz, M. In vitro expansion of megakaryocytes from peripheral blood hematopoietic progenitors. Methods Mol Med. 31, 337-345 (1999).
- Ivetic, N., et al. Producing megakaryocytes from a human peripheral blood source. Transfusion. 56 (5), 1066-1074 (2016).
- Friedrich, E. B., Walenta, K., Scharlau, J., Nickenig, G., Werner, N. CD34-/CD133+/VEGFR-2+ endothelial progenitor cell subpopulation with potent vasoregenerative capacities. Circ Res. 98 (3), e20-e25 (2006).
- Wijelath, E. S., et al. Novel vascular endothelial growth factor binding domains of fibronectin enhance vascular endothelial growth factor biological activity. Circ Res. 91 (1), 25-31 (2002).
- Hulkower, K. I., Herber, R. L. Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery. Pharmaceutics. 3 (1), 107-124 (2011).
- Yao, E. H., et al. Effects of the antioxidative beta-blocker celiprolol on endothelial progenitor cells in hypertensive rats. Am J Hypertens. 21 (9), 1062-1068 (2008).
- Takahashi, T., et al. Ischemia- and cytokine-induced mobilization of bone marrow-derived endothelial progenitor cells for neovascularization. Nat Med. 5 (4), 434-438 (1999).
- Kawamoto, A., et al. Therapeutic potential of ex vivo expanded endothelial progenitor cells for myocardial ischemia. Circulation. 103 (5), 634-637 (2001).
- Kim, B. S., et al. Myocardial Ischemia Induces SDF-1alpha Release in Cardiac Surgery Patients. J Cardiovasc Transl Res. 9 (3), 230-238 (2016).
- Frangogiannis, N. G., Smith, C. W., Entman, M. L. The inflammatory response in myocardial infarction. Cardiovasc Res. 53 (1), 31-47 (2002).
- Zernecke, A., Bernhagen, J., Weber, C. Macrophage migration inhibitory factor in cardiovascular disease. Circulation. 117 (12), 1594-1602 (2008).
- White, D. A., et al. Pro-inflammatory action of MIF in acute myocardial infarction via activation of peripheral blood mononuclear cells. PLoS One. 8 (10), e76206 (2013).
