Murine महाधमनी क्रश चोट: एक कुशल Published: June 11, 2017 doi: 10.3791/55201

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Dan Yu^1,4, George Makkar², Rajabrata Sarkar^2,3,4, Dudley K. Strickland^2,3,4, Thomas S. Monahan^1,2,4

¹Department of Surgery, Baltimore Veterans Affairs Medical Center, ²Department of Surgery, University of Maryland School of Medicine, ³Department of Physiology, University of Maryland School of Medicine, ⁴Center for Vascular and Inflammatory Diseases, University of Maryland School of Medicine

Summary

हृदय प्रक्रियाओं (बाईपास सर्जरी, एंजियोप्लास्टी, या स्टेंटिंग) के बाद रेस्तोनोसिस इन प्रक्रियाओं के स्थायित्व को कम करने में एक महत्वपूर्ण समस्या है। एंडोथेलियम के पुनर्जन्म को बढ़ावा देने के दौरान एक आदर्श चिकित्सा चिकनी पेशी कोशिका (वीएसएमसी) प्रसार को रोकती है। हम विवो में वीएसएमसी प्रसार और एंडोथेलियल फ़ंक्शन के एक साथ मूल्यांकन के लिए एक मॉडल का वर्णन करते हैं।

Abstract

धमनी पुनर्निर्माण, चाहे एंजियोप्लास्टी या बाईपास सर्जरी, में इट्रोजेनिक ट्रॉमा शामिल होती है जिसके कारण एंडोथेलियल व्यवधान और वाहिका चिकनी पेशी सेल (वीएसएमसी) प्रसार होता है। आम murine मॉडल छोटे वाहिकाओं का अध्ययन जैसे कैरोटिड और फिर्थल धमनियों इस प्रकार हम एक vivo प्रणाली का वर्णन करते हैं जिसमें वीएसएमसी प्रसार और एंडोथेलियल बाधा फ़ंक्शंस का एक साथ एक बड़े पोत में मूल्यांकन किया जा सकता है। हमने सी 57 बीएल / 6 चूहों में चोट के लिए इन्फ्राएनल महाकाव्य प्रतिक्रिया का अध्ययन किया। महाधमनी बाएं गुर्दे की शिरा से महाद्वीपीय विभाजन के लिए 5-सेकंड की अवधि के 30 ट्रांसमीटर वाले कुचल से कपास के छिद्रयुक्त आवेदक के साथ घायल हो गया था। रूपांतरिक परिवर्तनों को पारंपरिक ऊतक विज्ञान के साथ मूल्यांकन किया गया महाधमनी की दीवार की मोटाई ल्यूम्यल की सतह से एपेंसिटिया में मापा गया। डीएपीआई और अल्फा-एक्टिन के साथ ईडीयू एकीकरण और काउंटर स्टीनिंग का इस्तेमाल वीएसएमसी प्रसार को प्रदर्शित करने के लिए किया गया था। ईआरके 1/2 की सक्रियता, इन्टिमल हाइपरप्लासिया गठन का एक ज्ञात मध्यस्थ, रोकी गई थीपश्चिमी ब्लॉट विश्लेषण द्वारा खनन। सूजन का प्रभाव बी कोशिकाओं, टी-कोशिकाओं और मैक्रोफेज के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री द्वारा निर्धारित किया गया था । एन्डोथिलियम के चेहरे वाले वर्गों को स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसईएम) के साथ देखा गया। एंडोथेलियल बाधा समारोह इवांस ब्लू धुंधला के साथ निर्धारित किया गया था। संक्रमण संबंधी चोट के परिणामस्वरूप महाधमनी दीवार की मोटाई हुई। यह चोट प्रेरित वीएसएमसी प्रसार, चोट के 3 दिनों के बाद, और ईआरके 1/2 के शुरुआती सक्रियण और p27 ^kip1 अभिव्यक्ति में ^कमी आई थी। चोट ने बी-कोशिकाओं, टी-कोशिकाओं या मैक्रोफेज को घुसपैठ की वजह से पोत की दीवार में नहीं निकाला। चोट ने आंशिक एंडोथिलियल सेल का निषेचन और सेल-सेल संपर्क की हानि का कारण बना दिया। चोट के कारण एन्डोथेलियल बाधा समारोह का एक महत्वपूर्ण नुकसान हुआ, जो सात दिनों के बाद बेसलाइन पर वापस आ गया। Murine transmural कुंद महाधमनी चोट मॉडल एक साथ एक बड़े जहाज में दोनों वीएसएमसी प्रसार और endothelial बाधा समारोह का अध्ययन करने के लिए एक कुशल प्रणाली प्रदान करता है।

Introduction

restenosis हृदय प्रक्रियाओं (बाईपास सर्जरी, एंजियोप्लास्टी, या स्टेंटिंग) के बाद इन प्रक्रियाओं की स्थायित्व को कम करने में एक महत्वपूर्ण समस्या है सभी पुनर्वासीकरण प्रक्रियाएं ताकत से पीड़ित हैं थस्टोनोसिस (ड्रग-अल्यूटिंग स्टेंट्स और ड्रग-लेपित बॉलन) को रोकने के लिए मौजूदा रणनीतियों, दोनों संवहनी चिकनी पेशी कोशिका (वीएसएमसी) और एंडोथेलियल सेल प्रसार (ईसी) को रोकती हैं। नतीजतन, इन हस्तक्षेपों में वीएसएमसी मध्यस्थता से ट्रिटेनोसिस को रोकता है, लेकिन एन्डोथेलियम के पुनर्जन्म को भी रोकता है। एक बरकरार एन्डोथेलियम के बिना रोगियों को खून बह रहा जटिलताओं के खतरे में सीट घूंट के जोखिम को कम करने के लिए शक्तिशाली एंटीप्लेटलेट एजेंटों पर होना आवश्यक है। एंडोथेलियम के पुनर्जन्म को बढ़ावा देने के दौरान एक आदर्श उपचार वीएसएमसी प्रसार को रोकता है। इस प्रकार, साथ ही साथ वीएसएमसी प्रसार और एंडोथेलियल बायर फंक्शन आई एन वीवो का अध्ययन करने की आवश्यकता है।

वर्तमान में, वहाँ अलग कर रहे हैंअलगाव के अल माउस मॉडल ¹ इन मॉडलों में कैरोटिड लैग्ज और फर्मल धमनी तार की चोट ² शामिल हैं महाधमनी मॉडल स्टेंट प्लेसमेंट ³ , गुब्बारा की चोट ⁴ , और महाधमनी allograft ^{5 शामिल हैं} । वर्तमान मॉडल के सभी सीमित हैं कैरोटिड लैगीज एक प्रवाह-मध्यस्थता से अपरिवर्तनीय घाव उत्पन्न करता है और इसमें एंडोथेलियल की चोट नहीं होती है। इसके अतिरिक्त, दोनों मन्यार और अनुष्ठान संबंधी धमनियों में मानवीय जहाजों की तुलना में बहुत अधिक कम सेल परतें होती हैं, जो उनके अनुवादित मूल्य को सीमित करती हैं। माउस महाधमनी जो लगभग 1.3 मिमी व्यास है, एकमात्र पोत है जो नैदानिक ​​रूप से प्रासंगिक (कोरोनरी) मानव धमनी (3) के अनुमानित है।

मुरिन महामारी के मॉडल की अनुवाद क्षमता के बावजूद, मौजूदा मॉडलों में सीमाएं हैं। इन मॉडलों को उन्नत माइक्रोस्कोरिकल कौशल और विशेष उपकरण जैसे एंजियोप्लास्टी गुब्बारे और स्टेंट की आवश्यकता होती है। इसके साथ, हम वर्तमान में मौजूद हैंएक उपन्यास, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तकनीक, साथ ही साथ वीएसएमसी प्रसार को बढ़ावा देती है और एंडोथेलियल बाधा समारोह को बाधित करती है।

Protocol

नैतिकता विवरण: पशु हैंडलिंग के प्रोटोकॉल को मैरीलैंड विश्वविद्यालय (प्रोटोकॉल संख्या 0416009) की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा अनुमोदित किया गया और एएएलएसी-अंतर्राष्ट्रीय मानकों के अनुसार आयोजित किया गया।

1. सर्जिकल प्रक्रिया

1. एनेस्थेटिक तकनीक
   1. 121 मिनट में 30 मिनट के लिए वाष्प नसबंदी के साथ अस्तित्व सर्जरी में इस्तेमाल किए गए सभी उपकरणों को जीवाणुरहित करें
   2. 100% ओ ₂ और 2.5% आईसोफ्लूरन के साथ एक प्रेरण टैंक के माध्यम से एनेस्थेसियास को सटीक वाष्पीकरण के माध्यम से वितरित किया गया। पोस्ट-इंडेक्शन, आईसोफ्लुरेन को बंद करें और ओ _{2 के} साथ चैंबर फ्लश करें साँस लेना द्वारा फेस मास्क के माध्यम से 1.5-2% आइसफ्ल्यूरैन और 1 एल / मिन ओ _{2 के} साथ संज्ञाहरण बनाए रखें।
   3. कर्मियों को सुरक्षित रखने के लिए अपशिष्ट गैस सोखना के लिए एक लकड़ी का कोयला स्कैवेनर को दोनों प्रेरण कक्ष और चेहरे का मुखौटा संलग्न करें। प्रदर्शन द्वारा पर्याप्त संवेदनाहारी विमान सुनिश्चित करेंयह देखते हुए कि हानिकारक उत्तेजनाओं (पैर की अंगुली चुटकी) के लिए कोई प्रतिक्रिया नहीं है।
   4. सर्जरी के दौरान थर्मल समर्थन प्रदान करने के लिए एसिओथमल पैड के साथ एक सर्जिकल ट्रे युक्त एक ऑपरेटिव फील्ड बनाएं। एक अतिरिक्त इयासौर्मल पैड जानवरों को उनकी वसूली पिंजरे में थर्मल समर्थन प्रदान करेगा।
2. पशु तैयारी
   1. 10-12 सप्ताह की पुरूष C57BL / 6 चूहों पर निम्नलिखित जांच करें।
   2. उरोस्थि से जानवर के ऊतक उदर की सतह पर बालों को एक वंशानुगत एजेंट या एक संख्या 40 ब्लेड के साथ विद्युत क्लिपर के साथ इनग्रेनल क्षेत्र में निकाल दें।
      1. विषाक्त एजेंट के मामले में, इस परिसर को 2-3 मिनट के लिए सर्जिकल क्षेत्र में लागू करें और फिर इसे कपास से हटा दें। हम कैल्शियम हाइड्रॉक्साइड और सोडियम हाइड्रोक्साइड के व्यावसायिक रूप से उपलब्ध परिसर का उपयोग करते हैं।
   3. 70% शराब के साथ कंधे पर क्षेत्र तैयार करें और 25 गेज या छोटे बोअर सुई के साथ कारप्रोफेन (5 मिलीग्राम / किग्रा) को इंजेक्षन करें। इसउपचार पशु के लिए पश्चात एनाल्जेसिया प्रदान करेगा।
   4. सर्जिकल फ़ील्ड और पृष्ठीय ढहने में स्थिति में पशु को स्थानांतरित करें।
   5. एक साफ कपास applicator या कपास धुंध के साथ 8-12% प्रोवाइड-आयोडीन को स्क्रब करके सर्जिकल साइट तैयार करें। फिर दो बार त्वचा को 70% शराब से कुल्ला।
   6. कॉर्नियल डिसेकेशन की घटनाओं को कम करने के लिए दोनों आँखों में ओक्यूलर स्नेहक रखें। एक बाँझ कपड़ा के साथ सर्जिकल साइट को कवर।
3. ऑपरेटिव तकनीक
   1. एक औसत पित्त लैपरोटॉमी चीरा को लगभग 2-2.5 सेंटीमीटर लंबाई में स्केलपेल के साथ शुरू करें, तुरंत पलंग की प्रक्रिया कोदोअल और श्रोणि की तरफ बढ़ रहा है।
   2. छोटी आंत और ग्रहणी को जुटाने के लिए और बाद में दाईं ओर प्रतिबिंबित करें। बाँझ कपास की एक पट्टी रोल और इंजेक्शन के लिए बाँझ खारा के साथ भिगोने के लिए viscera के पैकिंग के प्रदर्शन में सुधार करने की अनुमति।
   3. छोटी आंत के दायीं तरफ जुड़ा हुआ हैपेट, रेट्रोपीरिटोनियम का पर्दाफाश करें और बाएं गुर्दे की शिरा से महाकाव्य विभाजन ( चित्रा 1 ) तक पेट की महाधमनी का पर्दाफाश करें।
   4. एक बाँझ कपास के इत्तला दे दी ऐप्टेटर के साथ, 30 लगातार कुचल देता है, प्रत्येक पांच सेकेंड की अवधि में।
   5. पैकिंग निकालें और आंत को अपने मूल स्थान पर वापस जाने की अनुमति दें।
   6. एक 4-0 शोषक मोनोफ़िलामेंट सिवनी (पॉलीइडऑक्सानोन) के साथ बंद प्रावरणी बंद करें चलने वाली 6-0 गैर-अवशोषित monofilament सिवनी (नायलॉन) के साथ त्वचा बंद है।
4. रिकवरी और पोस्ट-प्रोसिजरी केयर
   1. प्रक्रिया के बाद, जानवर को एक थर्मल समर्थन जारी रखने के लिए एक इज़ोटेरियल पैड पर साफ बिस्तर के साथ एक रिकवरी पिंजरे में रखें जब तक कि जानवर सामान्य रूप से अस्पष्ट नहीं कर सकता। जब तक यह सघन ठंडे बनाए रखने की क्षमता को प्रदर्शित नहीं करता तब तक जानवरों को न छोड़ें।
   2. सर्जरी के बाद पहले 4 घंटे के लिए हर घंटे पशु की निगरानी करें एक बार जानवर आम तौर पर वापस लौट रहा है सौंपे गए पपड़ी के कमरे में टी पशु किसी दूसरे जानवर की कंपनी में नहीं रखा जाएगा जब तक कि वह पूरी तरह ठीक नहीं हो जाता।
   3. सर्जरी के बाद पहली बार 72 घंटे और उसके बाद सप्ताह में कम से कम 3 बार पशुओं को दो बार मॉनिटर करें निगरानी में जानवरों को सप्ताह में तीन बार वजन करना शामिल होता है
   4. शल्य चिकित्सा के बाद पहले 72 घंटे के लिए रोजाना दो बार कार्बोफाइन (5 मिलीग्राम / किग्रा) का प्रशासन करना।

2. ऊतक की खरीद

1. इच्छामृत्यु की विधि
   1. पूर्व निर्धारित समय बिंदुओं पर जानवरों को कुलीन करें।
   2. 100% ओ ₂ और 2.5% आईसोफ्लूरन के साथ एक प्रेरण टैंक के माध्यम से एनेस्थेसियास को सटीक vaporizer के माध्यम से वितरित करें।
      1. एन्डोथिलियम की अखंडता का अध्ययन करने के लिए, जानवरों के लिए इवांस ब्लू डाई को प्रशासन करना।
         नोट: इवांस ब्लू एल्ब्यूमिन के लिए एक उच्च बाध्यकारी आत्मीयता के साथ एक नकारात्मक चार्ज किया एज़ो डाई है और केवल एक बरकरार एन्डोथेलियम के अभाव में रक्त वाहिकाओं को दाग सकता हैS = "xref"> 6
      2. ऐन्थोटलियल अखंडता अध्ययन के लिए, इच्छामृत्यू के समय जानवरों को 5 एमएल के 0.3 मिलीयन इवांस ब्लू डाई के साथ 5 मिनट के लिए शारीरिक दबाव में 5 एमएल पीबीएस के बाद छिड़कना। जानवर को छिड़काव प्रक्रिया के दौरान एनेस्थेसिया के सर्जिकल प्लेसमेंट में रखा जाता है।
   3. एक गहरी संवेदनाहारी विमान प्राप्त करने के बाद, छाती को स्टेरनेटोमी के साथ खोलें। जानवरों से खून के जल निकासी की अनुमति देने के लिए दाएं एरी्रिम में स्तनपान करें और बाएं वेंट्रिकल तक पहुंचें 21 जी सुई के साथ पहुँचा जाता है और दाएं एट्रियम से प्रवाह तक स्पष्ट नहीं होने तक फॉस्फेट बफ़ेड खारा (पीबीएस) इंजेक्षन करता है।
   4. पीबीएस के साथ छिड़काव के बाद, पेट में एक मिडलाइन चीरा के माध्यम से प्रवेश करें
   5. एक बार फिर, पेट की दाहिनी ओर छोटी इन्टेस्टिन को इन्फ्राएनल महाधमनी को उजागर करते हुए, आसन्न ऊतकों से महाधमनी का टुकड़े टुकड़े करना और बाएं गुर्दे की नस से महाकाव्य विभाजन करने के लिए आबकारी करना।
   6. 4% पैरामाडाल्ड में एक्साइज्ड एरोटा को स्टोर करेंऊतक प्रसंस्करण होता है जब तक ehyde समाधान।
      1. एंडोथिलियल अखंडता के अध्ययन के लिए, महाधमनी लंबे समय तक खुलते हैं और एक मोम पत्रक को पूरी तरह से लुमिनी सतह ⁶ को उजागर करते हैं। इवांस ब्लू डाई ^{6 के} साथ धुंधला होने की डिग्री द्वारा एंडोथेलियल अखंडता का गुणात्मक आकलन करना
      2. अन्य हिस्टोलिक एलेक्स के लिए, अनुभाग में एओरटा ट्रांसस्लेस और इष्टतम काटने के तापमान (ओसीटी) यौगिकों में एम्बेड किया जाता है जैसा कि हिस्टोलॉजिकल विधि द्वारा इस्तेमाल किया जाता है ⁷ ।

Representative Results

आंतरिक और बाह्य लोचदार लैमिना ^{7 की} पहचान करने के लिए ओरेक्ट में छिपाए गए अनुप्रस्थ खंड महासागरों को वर्गीकृत किया गया था, और हेमटॉक्साइलिन और ईओसिन के साथ दाग किया गया था, फिर वर्हॉफ-वान जीसन (वीवीजी) के साथ दाग का काउंटर। क्रश से चोट लगने वाली महाधमनी दीवार की मोटाई की तुलना में एक धोखा प्रक्रिया (अकेले लापरोटमी और छोटे आंत्र जुटाने) के साथ पशुओं के महाधमनी की तुलना में। दीवार की मोटाई, जिसकी आकस्मिकता से ल्यूमन तक दूरी के रूप में मूल्यांकन किया गया था, चोट लगने के बाद तीन दिन (42.2 ± 1.7 माइक्रोन बनाम 22.1 ± 1.1 माइक्रोन के लिए अकेले लैपरोटमी) ( चित्रा 2 ए-बी ) था। चोटों के परिणामस्वरूप कोशिकाओं में अधिक गोल उपस्थिति और एक अनियमित समोच्च ल्यूम्यल सतह ( चित्रा 2 सी ) है।

घायल महाधमनी की बढ़ती हुई दीवार की मोटाई कम से कम भाग में औसत दर्जे के संवहनी चिकनी मुर्गे की वृद्धि से मध्यस्थता हैकोशिकाओं को हटाना यह साबित करने के लिए कि दीवार की मोटाई सेल के अतिवृद्धि के विरोध में बढ़ी हुई वृद्धि के कारण है, हमने एक एडीयू प्रसार परख का इस्तेमाल किया। इस परख में, thymidine analogue 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (edu) माउस के लिए नसों का संचालन किया जाता है, euthanasia से पहले 24 घंटे। संश्लेषण के दौरान डीडीए में एडीयू शामिल है एडीयू को एक क्लिक प्रतिक्रिया (हरा-फ्लोरोसेंट डाई का उपयोग करते हुए तांबा-उत्प्रेरित अजाइड-अल्केने साइक्लोडिडीशन) ^{8 से पता चला है} । शाम चूहों को केवल लापरोटामी के सामने उजागर किया गया, महाधमनी की किसी भी परत में कोई प्रतिदीप्ति नहीं देखा गया था। संश्लेली, महाधमनी चोट के अधीन चूहों ने दोनों मीडिया और महाधमनी ( चित्रा 3 ) की अंतर्ज्ञान में प्रतिदीप्ति का प्रदर्शन किया।

कुचला चोट के बाद महाधमनी दीवार के मोटे तौर पर मस्तिष्क में विश्राम करने के लिए सेल सिग्नलिंग पथ सक्रिय होते हैं। एमटोजेन सक्रिय प्रोटीन किनेज (एमएपी किनासेज) ईआरके 1/2 इन्सटाल हाइपरप्लासिया गठन के सिद्धांत मध्यस्थों में से एक हैएमिटोजेन से उत्तेजना के जवाब में, ईआरके 1/2 फास्फोरियम है और सक्रिय ^{9 , 10} । हमारी प्रयोगशाला के आंकड़ों ने यह भी दर्शाया है कि पोत की दीवार ¹² में mitogenic उत्तेजनाओं के जवाब में cyclin- निर्भर kinase अवरोधक p27 ^{kip1 कम} है। महाधमनी क्रश की चोट के बाद 1, 3, 7 दिन और 1 महीने में चूहे को ख़त्म किया गया था। इन्फ्राएनल महाधमनी पृथक और ईआरके 1/2, फॉस्फो-ईआरके 1/2 (एआरके 1/2 का सक्रिय रूप) की प्रोटीन अभिव्यक्ति और पश्चिमी ब्लोट विश्लेषण ( चित्रा 4 ए ) द्वारा साइक्लीन आश्रित ^{किनेज} अवरोधक p27 ^{kip1 निर्धारित किया} गया था। समय के साथ कुल ERK1 / 2 प्रोटीन अभिव्यक्ति में कोई परिवर्तन नहीं देखा गया था। हालांकि, चोट के तीन दिन बाद, फॉस्फो-ईआरके 1/2 (पी-ईआरके 1/2) अभिव्यक्ति बेसलाइन पिई-ईआरके 1/2 एक्सप्रेशन से 200% अधिक थी। ^P27 kip1 अभिव्यक्ति शुरुआती समय में कमी आई और लगभग 20% बेसलाइन सात दिनों के एफ़ के नादिर तक पहुंच गईभयंकर चोट चोट ( चित्रा 4 बी ) के एक महीने बाद दोनों पीआई-ईआरके 1/2 और पी 27 ^{किप 1} अभिव्यक्ति अनुमानित आधारभूत स्तर। इस प्रकार महाप्राणिक प्रसार की बढ़ोत्तरी के कारण कम से कम भाग में वृद्धि हुई है।

महाधमनी चोट मॉडल दोनों औसत दर्जे का चिकनी पेशी प्रसार और एंडोथेलियल बाधा समारोह के एक साथ मूल्यांकन की अनुमति देता है। स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसईएम) का उपयोग एन्डोथिलियम के आकारिकी पर क्रश की चोट के प्रभाव को चिह्नित करने के लिए किया गया था। महाधमनी के ल्यूमिनल सतह को एक मिला हुआ, एंडोथाहेल द्वारा खड़ा किया जाता है जो रक्त में जन्मे कोशिकाओं और अणुओं ( चित्रा 5 ए , स्केल बार = 100 माइक्रोन) के आसंजन को रोकता है। इसके विपरीत, एंडोथेलियल कोशिकाओं के विघटन और एन्डोथिलियम ( चित्रा 5 बी, स्केल बार = 100 माइक्रोन) के आंशिक प्रत्यावर्तन में चोट के परिणाम को कुचलने के लिए। जैसा कि उच्च वृहदीकरण पर देखा गया है, ऐन्डोथिलियम के परिणाम एडशेसी में होने के बावजूदप्लेटलेट्स के साथ आकार और आकृति में कणों के अनुरूप। इन कणों के आसंजन चोट के पूरे क्षेत्र में होता है, और कम बढ़ाई ( चित्रा 5C , स्केल बार = 50 माइक्रोन) पर मनाया गया सकल छिद्रण के क्षेत्रों तक सीमित नहीं है। उच्च आवर्धन पर पक्षपाती कण का आकृति विज्ञान सबसे अच्छा मनाया जाता है। ये कण प्लेटलेट्स और फाइब्रिन ( चित्रा 5 डी , स्केल बार = 10 माइक्रोन) के अनुरूप हैं।

एंडोथेलियल आकृति विज्ञान के अतिरिक्त, एंडोथेलियम के अवरोध समारोह को संवहनी चोट के इस मॉडल के साथ मूल्यांकन किया जा सकता है। एजो डाई इवांस ब्लू मूरीन महासागर के सामान्य, बरकरार एन्डोथेलियम में प्रवेश नहीं कर सकता। एंडोथेलियम के अवरोध समारोह में क्षति इवांस ब्लू के साथ तहखाने झिल्ली के धुंधला हो जाने की अनुमति देता है। अकेले लैपरोटमी के साथ चूहों का इलाज (शाम) ने एन्डोथिलियम के बाधा समारोह को बनाए रखा और ये महाधमनी सफेद थे। क्रश चोट के परिणामस्वरूप एकएंडोथेलियल बाधा समारोह के फैलाना नुकसान और इन एर्टस में गहरे नीले रंग का रंगा हुआ। इवांस ब्लू के साथ धुंधला होने की तीव्रता क्रश की चोट के तीन दिन बाद कम हो गई, और चोट के बाद सप्ताह में पूरी बाधा समारोह को पुन: बहाल किया गया ( चित्रा 6 ए )। एंडोथेलियल बाधा समारोह में नमूने के वजन और 50% त्रिच्चिरायोटिक एसिड समाधान के 10 गुना मात्रा में homogenizing द्वारा आगे मात्रात्मक हो सकता है। 4-ईंधन इथेनॉल में सतह पर तैरनेवाला को ढंकना, एओकी एट अल द्वारा वर्णित अनुसार प्रतिदीप्ति तीव्रता (उत्तेजना 620 एनएम और उत्सर्जन 680 एनएम) के निर्धारण के लिए अनुमति देता है। ¹¹ इन्फ्राएनल महाधमनी से इवान्स ब्लू नामित राशि की मात्रा लालचंदता (घायल - दिन 0) के अधीन आर्ट्स की तुलना में चोट के तुरंत बाद महाधमनी में तीन गुना अधिक थी। चोट के समय से एक से तीन दिनों में, ईरान ब्लॉ पर महाधमनी का दाग जारी रहा, लेकिन चोट के समय की तुलना में कम तीव्रता से, एंडोथेलियल बाधा समारोह की क्रमिक वसूली का सुझाव दिया। एक सप्ताह पीछेईर की घायल घायल महाधमनी अकेले लापरोटामी के साथ इलाज किया गया महाधमनी ( चित्रा 6 बी ) के बराबर धुंधला हो गया था।

चित्रा 1 चित्रा 1: चोट बुरी तरह से कुंडली से महाधमनी कुचलने के लिए वामपंथी शिरा से महाधमनी विभाजन करने के लिए बनाया गया है। यू एट अल ।, प्लस वन 2015 ^{12 की} अनुमति से अनुकूलित चित्रा इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 2: क्रश चोट से महाधमनी दीवार की मोटाई लाती है। ( ए ) महाधमनी में क्रश चोट से प्रेरित रूपात्मक परिवर्तन प्रतिनिधि 5 माइक्रोन के पार वर्ग 0 में वीवीजी के साथ दाग रहे थे,चोट के 1, 3 और 7 दिनों के बाद स्केल सलाखों = 100 माइक्रोन ( बी ) दीवार की मोटाई सबसे बड़ी चोट के बाद 3 दिन थी, 42.2 ± 1.7 माइक्रोन, और अकेले laparotomy के सामने उभयलिंगी जानवरों के महाधमनी से काफी अधिक था, 22.1 ± 1.1 माइक्रोन। छात्र की दो पूंछ टी-परीक्षा से सांख्यिकीय महत्व निर्धारित किया गया था। * Denotes p <0.05, n = 3. ( सी ) क्रश की चोट ने औसत दर्जे का वीएसएमसी का एक गोल उपस्थिति प्रेरित किया (α-चिकनी मांसपेशी एक्टिन के लिए हरे रंग में सना हुआ) और सेल ओरिएंटेशन बदल रहा है। नाभिक डीएपीआई (ब्लू) के साथ counterstained थे स्केल सलाखों = 10 माइक्रोन डेटा को अर्थ और मानक विचलन के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 3: क्रश चोट इंसेंट सेल प्रोलीफ़ाइजमहाधमनी दीवार में राशन चूहों को या तो लापरोटमी अकेला (शिम) या महाधमनी क्रश चोट के साथ laparotomy के संपर्क में थे। थिमिडीन एनालॉग 5-एथिलीन -2 '-डीओक्यूरिडिन (एडीयू) को इच्छामृत्यु से 24 घंटे पहले का प्रबंध किया गया था। संश्लेषण के दौरान डीडीए में एडीयू शामिल है एडीयू को एक क्लिक प्रतिक्रिया (हरा-फ्लोरोसेंट डाई का उपयोग करके तांबा-उत्प्रेरित अजाइड-अल्केने साइक्लोडिडिशन) से पता चला है। शाम जानवरों की महाधमनी दीवार में एडीयू (हरा) का कोई पता नहीं था। क्रश चोट के अधीन जानवरों में, एडीयू महाद्वीप के मीडिया में प्रमुखता से और आंतरिक रूप से कुछ हद तक कम डिग्री के लिए दाग लगाई। संवहनी चिकनी पेशी कोशिकाओं की पहचान α- चिकनी मांसपेशी एक्टिन एंटीबॉडी (लाल) के साथ धुंधला द्वारा की गई थी। यह पता चलता है कि चित्रा 2 में देखा गया मनाया दीवार घनत्व सेल पेशाब में वृद्धि के कारण है। स्केल सलाखों = 10 माइक्रोन कृपया इस figur का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करेंई।

चित्रा 4: क्रुद्ध चोट के जवाब में माइत्जन-सक्रिय प्रोटीन किनेस (एमएपी किनास) मार्ग सक्रिय है। ( ए ) एमएपी किनेस ईआरके 1/2 फास्फोरिलेटेड है जब सक्रिय होता है और इन्टिमल हाइपरप्लासिया और रेथोनोसिस से जुड़ा होता है। महाधमनी क्रश की चोट के बाद 1, 3, 7 दिन और 1 महीने में चूहे को ख़त्म किया गया था। वेस्टर्न ब्लॉट विश्लेषण का उपयोग कुल ERK1 / 2, फॉस्फो-ईआरके 1/2 की प्रोटीन अभिव्यक्ति का मूल्यांकन करने के लिए किया गया था, और साइक्लीन आश्रित किनेज अवरोधक p27 ^kip1 । प्रोटीन की अभिव्यक्ति अकेली लैपरोटमी के साथ इलाज किए गए एक शाम जानवर के लिए सामान्यीकृत थी ( बी ) समय के साथ कुल ERK1 / 2 प्रोटीन अभिव्यक्ति में कोई परिवर्तन नहीं देखा गया था। हालांकि, चोट के तीन दिन बाद, फॉस्फो-ईआरके 1/2 (पी-ईआरके 1/2) अभिव्यक्ति बेसलाइन पिई-ईआरके 1/2 एक्सप्रेशन से 200% अधिक थी। ^P27 kip1 अभिव्यक्ति शुरुआती समय में कमी आईघ की चोट के बाद सात दिनों तक बेसलाइन के लगभग 20% चोट के एक महीने बाद दोनों पीआई-एआरके 1/2 और पी 27 ^{किप 1} अभिव्यक्ति अनुमानित आधारभूत स्तर इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 5. क्रश चोट से ऑर्टिक एंडोथिलियल सेल को बाधित। ( ए ) स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसईएम) का उपयोग एन्डोथिलियम के आकारिकी पर क्रश की चोट के प्रभाव को चिह्नित करने के लिए किया गया था। सामान्य महाधमनी की ल्यूमिनल सतह एक संगम, एन्डोथेलियम द्वारा खड़ी होती है जो रक्त के जन्मजात कोशिकाओं और अणुओं के आसंजन को रोकती है। ( बी ) एंडोथेलियल कोशिकाओं के विघटन और एन्डोथिलियम के आंशिक प्रत्यावर्तन में क्रश चोट के परिणाम। ( सी ) के रूप में उच्च magnifica में देखाखंड, प्लेटलेट्स के आकार और आकृति में संगत कणों के आसंजन में एन्डोथिलियम के परिणाम के विघटन। इन कणों के आसंजन चोट के पूरे क्षेत्र में होते हैं, और निचला बढ़ाई पर देखा गया सकल छिद्रण के क्षेत्रों तक सीमित नहीं है। ( डी ) उच्च विस्तार पर, ये कण प्लेटलेट्स और फाइब्रिन के अनुरूप हैं। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 6: ब्लंट महाधमनी चोट एंडोथेलियल बैरियर समारोह के मात्राकरण की अनुमति देता है। ( ए ) एन्डोथेलियम के बाधा समारोह में क्षति इवांस ब्लू डाई के साथ तहखाने झिल्ली की धुंधला हो जाने की अनुमति देता है। एक लापरोटामी अकेले (छिपाना) के साथ इलाज किया गया चूहों ने एन्डोथिलियम और वें के बाधा समारोह को बनाए रखाEse महाधमनी सफेद थे क्रश की चोट के परिणामस्वरूप अंतःस्रावी बाधा समारोह का एक अलग नुकसान हुआ और ये महाधमनी दाग ​​गहरा नीला। इवांस ब्लू के साथ धुंधलेपन की तीव्रता क्रश की चोट के तीन दिन बाद कम हो गई, और चोट के बाद सप्ताह में पूर्ण बाधा समारोह को बहाल किया गया। ( बी ) इवांस ब्लू की अवरक्त महाधमनी के लिए बाध्यकारी इवांस ब्लू को प्रतिदीप्ति तीव्रता द्वारा नमूना और मात्रा का ठहराव से उत्खनन के द्वारा मात्रात्मक किया गया था। डेटा को अर्थ और मानक विचलन के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। सबसे इवांस ब्लू को क्रश चोट के तुरंत बाद महाधमनी से नामित किया गया था। चोट के समय, महाधमनी से तीन गुना अधिक एवरा की तुलना में इवांस ब्लू अकेले लैपरोटमी के अधीन होता है। चूंकि महाधमनी को ठीक करने की इजाजत थी, चोट के बाद एक और तीन दिनों में कम बाध्यकारी थी। चोट के एक हफ्ते बाद, महाद्वीप में एवरेस के रूप में इवांस ब्लू की एक ही राशि बनी हुई है जो अकेले लापरोटामी के अधीन है। छात्र की दो पूंछ टी-परीक्षा से सांख्यिकीय महत्व निर्धारित किया गया था। * डेनोट्स पी <0.05, n = 3, एन एस महत्वपूर्ण नहीं है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

Discussion

हमने एक मूरिन महामारी चोट के मॉडल के प्रभावों की विशेषता की है जो कि मध्यस्थ हाइपरप्लासिया और एंडोथेलियल बाधा न होने में परिणाम है। महाकाय अंतर के साथ आंशिक ईसी टुकड़ी सेल सेल सम्पर्क और सेल प्रोट्रूशियंस की वृद्धि के नुकसान के साथ। इसी प्रकार, एन्डोथेलियल बाधा फ़ंक्शंस काफी कमजोर था, जो कि एमटोजेन-संवेदनशील संकेत मार्गों को प्रेरित करता था, जिससे वीएसएमसी के प्रसार और पोत की दीवार के मोटाई बढ़ने लगती थी। इस मॉडल की ताकत यह है कि यह अन्य महाद्वीपीय मॉडल की तुलना में सीखना और निष्पादित करना आसान है और चोट और एंडोथेलियल फ़ंक्शन के प्रजननशील प्रतिक्रिया दोनों के एक साथ मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है। इस प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम वास्तविक क्रश चोट है। क्रश की चोट की सीमा में परिवर्तनशीलता के परिणामस्वरूप चोट की डिग्री हो सकती है और इस प्रकार चर मात्रा में चिकनी मांसपेशी कोशिका प्रसार हो सकता है। एक कदम जो हमारी प्रयोगशाला में इस परिवर्तनशीलता को कम करता है, वह एक हैगंभीर, इलाज या प्रयोगात्मक स्थिति में अंधी, क्रश चोटों के सभी प्रदर्शन करते हैं।

इस मॉडल की सीमाएं नैदानिक ​​रूप से प्रासंगिक मानव रोग प्रक्रियाओं के लिए सामान्यता है। इस मॉडल में वीएसएमसी के शुरुआती मजबूत प्रजननशील प्रतिक्रिया के बावजूद, यह रेथोनोसिस की देर से होने वाली घटनाओं का मॉडल नहीं है, यानी कोई नेयोनिमा विकसित नहीं है साइटोकिन्स जैसे सूजन मध्यस्थों की कमी इस प्रक्रिया को नियंत्रित कर सकती है। यह खोज आंशिक चोट से एन्डोथिलियम की तीव्र वसूली के कारण हो सकती है। खरगोशों में पहले रिपोर्ट किए गए संवहनी क्रश चोट मॉडल के समान, प्रतिरक्षा कोशिकाओं की घुसपैठ छोटी थी। वर्तमान जांच में हम भ्रामक साइटोकिन्स के प्रोफ़ाइल का मूल्यांकन किया है जिसमें शम जानवरों और महाधमनी चोट वाले जानवरों को प्रोफरर सरणी के साथ मिला है। हालांकि, साइटोकिन प्रोफाइल में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था, जो कि शाम और घायल जानवरों के बीच प्रजनन संबंधी प्रतिक्रिया में अंतर समझाएगा (डेटानहीं दिखाया)। वर्तमान रिपोर्ट में वर्णित चोट अस्थायी रूप से सीमित है। जबकि महाकाव्य की चोट के अन्य मॉडलों और महाकाव्य एंजियोप्लास्टी मॉडल जैसे इंटेनिम हाइप्प्लाशिया पूरी तरह से एंडोटेल्लैम का खंडन करते हैं, वर्तमान मॉडल केवल आंशिक रूप से महाधमनी का खंडन करते हैं एन्डोथेलियम की पूरी तरह से निंदना को ठीक करने के लिए काफी लंबा समय लगता है और इन जानवरों को लंबे समय तक चोट के प्रभाव का अनुभव होता है।

यह मॉडल एक सप्ताह में आकृति विज्ञान और जैव रासायनिक परिवर्तनों की मात्रा का ठहराव करने के कारण वीएसएमसीएस और ईसीएस की तीव्र प्रतिक्रिया का उत्पादन करता है। यह हस्तक्षेप के प्रभाव से पहले 14-28 दिन पहले लगने वाले अन्य मॉडलों की तुलना में अधिक कुशल है। यह मॉडल म्यूरीन महाधमनी का प्रयोग करता है जो एकमात्र म्यूरीन पोत है जो नैदानिक ​​रूप से संबंधित मानव पोत का अनुमान लगाता है। अन्य महाधमनी मॉडल की तुलना में इस तकनीक का महत्वपूर्ण लाभ यह है कि यह मॉडल सीखना अपेक्षाकृत आसान है, और इसे प्राप्त करने के लिए महंगी या मुश्किल की आवश्यकता नहीं हैउतार ^{2 , 3 , 4 , 5} निष्कर्ष में, मुरुइन महाधमनी क्रश चोट मॉडल VSMCs और ईसीएस की संवहनी चोट के लिए एक साथ मूल्यांकन करने के लिए विवो मंच में एक तकनीकी रूप से सरल, सस्ती, कुशल प्रदान करता है।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ocular lubricant	Dechra	17033-211-38	Pharmaceutical agents
Isoflurane	VetOne	502017	Pharmaceutical agents
Carprofen	Zoetis	26357	Pharmaceutical agents
Precision vaporizer	Summit Medical	10675	Surgical supplies
Charcoal scavenger	Bickford Inc.	80120	Surgical supplies
Isothermal pad	Harvard Apparatus	50-7053-R	Surgical supplies
Sterile cotton-tipped applicator	Fisher Scientific	23-400-124	Surgical supplies
4-0 absorbable monofilament suture	Ethicon, Inc	J310	Surgical supplies
5-0 non-absorbable monofilament suture	Ethicon,Inc	1666	Surgical supplies
21-gauge x 1 inch needle	BD Biosciences	305165	Surgical supplies
25-gauge x 1 inch  needle	BD Biosciences	305125	Surgical supplies
Dry sterilizer	Cellpoint	7770	Surgical supplies
Fine scissors	Fine Science Tools	14058-09	Surgical instruments
Adson forceps	Fine Science Tools	11006-12	Surgical instruments
Dumont #5 fine forceps	Fine Science Tools	11254-20	Surgical instruments
Vannas Spring Scissors 3 mm cutting edge	Fine Science Tools	15000-00	Surgical instruments
Needle driver	Fine Science Tools	91201-13	Surgical instruments
Scalpel handle #4	Fine Science Tools	10004-13	Surgical instruments
Scalpel blades #10	Fine Science Tools	10010-00	Surgical instruments
PBS	Lonza	17-516F	Reagents for tissue processing
Evans Blue	Sigma-Aldrich	E2129	Reagents for tissue processing
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	Reagents for tissue processing
Modeling wax	Bego	40001	Reagents for tissue processing
OCT compound	Tissue-Tek Sakura	4583	Reagents for tissue processing
Mayer's hematoxylin solution	Sigma-Aldrich	MHS16	Reagents for immunohistological analysis
Eosin Y solution alcoholic	Sigma-Aldrich	HT110316	Reagents for immunohistological analysis
Elastin stain kit	Sigma-Aldrich	HT25A	Reagents for immunohistological analysis
Click-it Edu Alexa-488 Imaging Kit	Invitrogen	C10337	Reagents for immunohistological analysis
Anti-Erk1/2 antibody	Cell Signaling Technology	4695	Reagents for immunohistological analysis
Anti-phospho-Erk1/2 antibody	Cell Signaling Technology	4370	Reagents for immunohistological analysis
Anti-p27kip1 antibody	Cell Signaling Technology	3698	Reagents for immunohistological analysis
Trichloroacetic acid	Sigma-Aldrich	T9159	Reagents for immunohistological analysis