Summary
Рестеноз после сердечно-сосудистых процедур (шунтирование, ангиопластика или стентирование) является значительной проблемой, снижающей долговечность этих процедур. Идеальная терапия ингибирует пролиферацию гладких мышечных клеток (VSMC), способствуя регенерации эндотелия. Мы описываем модель одновременной оценки пролиферации VSMC и эндотелиальной функции in vivo.
Abstract
Артериальная реконструкция, будь то ангиопластика или шунтирование, связана с ятрогенной травмой, вызывающей нарушение эндотелия и пролиферацию гладких мышц сосудов (VSMC). Обычные мышиные модели исследуют небольшие сосуды, такие как сонные и бедренные артерии. Здесь мы описываем систему in vivo , в которой как VSMC-пролиферацию, так и функцию эндотелиального барьера можно одновременно оценить в большом сосуде. Мы изучили реакцию инфарренальной аорты на повреждение у мышей C57BL / 6. Аорта была повреждена от левой почечной вены до бифуркации аорты на 30 трансмуральных давлений продолжительностью 5 секунд с помощью аппликатора с хлопковым наконечником. Морфологические изменения оценивали с помощью обычной гистологии. Толщина стенки аорты измерялась от поверхности просвета до адвентиции. Для демонстрации VSMC-пролиферации использовали интеграцию ЭДУ и противодействующее окрашивание с помощью DAPI и альфа-актина. Активация ERK1 / 2, известного замедлителя формирования гиперплазии интимы, сдерживаласьПроведенный Вестерн-блот-анализом. Эффект воспаления определяли иммуногистохимией для В-клеток, Т-клеток и макрофагов . На участках эндотелия были выделены сканирующая электронная микроскопия (СЭМ). Эндотелиальную барьерную функцию определяли окрашиванием Evans Blue. Трансмуральная травма привела к утолщению стенки аорты. Эта рана индуцировала пролиферацию VSMC, наиболее заметно через 3 дня после травмы и раннюю активацию ERK1 / 2 и снижение экспрессии p27 kip1. Травма не приводила к увеличению В-клеток, Т-клеток или инфильтрации макрофагов в стенке сосуда. Травма вызвала частичную денудацию эндотелиальных клеток и потерю контакта клеток. Травма привела к значительной потере функции эндотелиального барьера, которая вернулась к исходному состоянию через семь дней. Модель трансмуральной тупой аортальной модели мыши обеспечивает эффективную систему для одновременного изучения как пролиферации VSMC, так и функции эндотелия в большом сосуде.
Introduction
рестеноз Следующие сердечно-сосудистые процедуры (обходная хирургия, ангиопластика или стентирование) являются значительной проблемой, снижающей долговечность этих процедур. Все процедуры реваскуляризации страдают рестенозом. Существующие стратегии профилактики рестеноза (стенты с лекарственным покрытием и покрытые лекарством шары) ингибируют как сосудистую гладкомышечную клетку (VSMC), так и пролиферацию эндотелиальных клеток (EC). Следовательно, эти вмешательства предотвращают опосредуемый VSMC рестеноз, но также предотвращают регенерацию эндотелия. Без интактного эндотелия пациенты должны находиться на мощных антиагрегантных средствах, чтобы снизить риск тромбоза in situ при риске осложнений кровотечения. Идеальная терапия будет ингибировать пролиферацию VSMC, способствуя регенерации эндотелия. Таким образом, необходимо одновременно изучать пролиферацию VSMC и функцию эндотелиального барьера i n vivo .
В настоящее время естьМышиные модели рестеноза 1 . Эти модели включают каротидную лигирование и повреждение проволоки бедренной артерии 2 . Модели аорты включают размещение стента 3 , повреждение 4 баллонов и аллотрансплантат аорты 5 . Все существующие модели ограничены. Перевязка сонной артерии генерирует опосредованное потоком неоинтимальное поражение и не имеет эндотелиального повреждения. Кроме того, обе сонные и бедренные артерии имеют в несколько раз меньше клеточных слоев, чем сосуды для человека, что ограничивает их поступательное значение. Аорта мыши диаметром около 1,3 мм является единственным сосудом, который аппроксимирует клинически значимую (коронарную) человеческую артерию (3).
Несмотря на поступательный потенциал мышиных аортальных моделей болезни, существующие модели имеют ограничения. Эти модели требуют передовых микрохирургических навыков и специализированного оборудования, такого как аэропланы и стенты ангиопластики. Здесь мы представляемНовый, воспроизводимый метод, чтобы одновременно индуцировать пролиферацию VSMC и нарушать функцию эндотелиального барьера.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Заявление об этике: Протоколы обработки животных были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных (IACUC) Университета штата Мэриленд (протокол № 0416009) и проводились в соответствии со стандартами AAALAC-International.
1. Хирургическая процедура
- Анестезирующая техника
- Стерилизовать все инструменты, используемые в хирургии выживания, с паровой стерилизацией при 121 ° C в течение 30 мин.
- Индуцировать анестезию через индукционный резервуар со 100% O 2 и 2,5% изофлураном, поставляемым через прецизионный испаритель. После индукции прекратите изофлуран и промойте камеру с помощью O 2 . Поддерживайте анестезию с использованием 1,5-2% изофлурана через лицевую маску и 1 л / мин O 2 при вдыхании.
- Прикрепите как индукционную камеру, так и лицевую маску к поглотителю углей для адсорбции отработанного газа для защиты персонала. Обеспечить адекватную анестезирующую плоскость демонстрациейЧто нет ответа на ядовитые стимулы (пальцы).
- Создайте оперативное поле, состоящее из хирургического лотка с изотермической подушечкой для обеспечения тепловой поддержки во время операции. Дополнительная изотермическая подушка обеспечит тепловую поддержку животным в их клетке для извлечения.
- Подготовка животных
- Проведите следующее исследование на мышах C57BL / 6 у мужчин 10-12 недель.
- Удалите волосы на брюшной брюшной поверхности животного от грудины до паховой области с помощью депиляционного агента или электрического клипера с лезвием номер 40.
- В случае депиляционного агента нанесите это соединение на хирургическую зону в течение 2-3 минут, а затем удалите его хлопком. Мы используем коммерчески доступное соединение гидроксида кальция и гидроксида натрия.
- Подготовьте область над плечом 70% спиртом и подкожно вводите карпрофен (5 мг / кг) с помощью иглы диаметром 25 или меньше. ЭтаЛечение обеспечит послеоперационную аналгезию для животного.
- Перенесите животное в хирургическое поле и положение в дорзальном положении.
- Подготовьте хирургический участок, очистив 8-12% провидон-йода чистым аппликатором для хлопка или хлопковой сеткой. Затем промыть кожу дважды 70% -ным спиртом.
- Поместите глазную смазку в оба глаза, чтобы уменьшить частоту высушивания роговицы. Накройте хирургический участок стерильной драпировкой.
- Оперативная техника
- Сделайте средний разрез лапаротомии брюшной полости приблизительно 2-2,5 см в длину, с скальпелем, начинающим сразу же хвостовой отростк и продвигаясь к тазу.
- Мобилизовать тонкую кишку и двенадцатиперстную кишку и отразить в поперечном направлении вправо. Сверните полосу стерильного хлопка, просеянного и пропитанного стерильным физиологическим раствором для инъекций, чтобы можно было убрать внутреннюю оболочку для улучшения воздействия.
- При тонком кишечнике, мобилизованном в правую сторонуЖивот, выставить забрюшинную полость и выставить брюшную аорту из левой почечной вены в бифуркацию аорты ( рис. 1 ).
- С помощью стерильного аппликатора с хлопковым наконечником дайте 30 последовательных давлений, каждые пять секунд.
- Снимите упаковку и позвольте внутренности вернуть в исходное положение.
- Закройте фасцию бегущим волокнистым монофиламентом 4-0 (полидиоксанон). Кожа закрыта беговым нитевидным монофиламентом 6-0 (нейлон).
- Восстановление и послеоперационное лечение
- После процедуры поместите животное в клетку для восстановления с чистыми постельными принадлежностями на изотермической подушечке, чтобы продолжить термальную поддержку до тех пор, пока животное не сможет нормально передвигаться. Не оставляйте животное без присмотра, пока оно не продемонстрирует способность поддерживать грудь.
- Наблюдайте за животными каждый час в течение первых 4 часов после операции. Как только животное перемещается, обычно возвращаются i Т к назначенной комнате для разведения животных. Животное не будет размещено в компании другого животного, пока оно полностью не восстановится.
- Контролируйте животное дважды в день в течение первых 72 часов после операции и по меньшей мере 3 раза в неделю после этого. Мониторинг включает взвешивание животного три раза в неделю.
- Администрирование carpofen (5 мг / кг) подкожно два раза в день в течение первых 72 часов после операции.
2. Закупка ткани
- Метод эвтаназии
- Усыплять животных в заранее определенные моменты времени.
- Индуцировать анестезию через индукционный резервуар со 100% O 2 и 2,5% изофлураном, поставляемым через прецизионный испаритель.
- Чтобы изучить целостность эндотелия, введите животное Эванс Блю.
ПРИМЕЧАНИЕ. Эванс Синий - это отрицательно заряженный азо-краситель с высокой аффинностью связывания с альбумином и может только окрашивать кровеносные сосуды в отсутствие интактного эндотелияS = "xref"> 6. - Для исследований эндотелиальной целостности во время эвтаназии перфузируйте животных 5 мл 0,3% красителя Evans Blue, а затем 5 мл PBS при физиологическом давлении в течение 5 мин. Животное содержится в хирургическом плане анестезии во время процедуры перфузии.
- Чтобы изучить целостность эндотелия, введите животное Эванс Блю.
- После достижения глубокого анестезирующего плана откройте сундук с помощью стернотомии. Сделайте рану в правом предсердии, чтобы дать дренаж крови у животного, и доступ к левому желудочку осуществляется с помощью иглы 21 G и вводить забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS) до тех пор, пока поток эфлюента из правого предсердия не станет прозрачным.
- После перфузии с PBS, вводите живот через срединный разрез.
- Еще раз мобилизуйте тонкую кишку в правую сторону брюшной полости, обнажая инфаренальную аорту, резко рассеивайте аорту из соседних тканей и вырезайте ее из левой почечной вены в бифуркацию аорты.
- Храните вырезанную аорту в 4% параформальдеЭхид до тех пор, пока не произойдет обработка тканей.
- Для исследований целостности эндотелия, откройте аорту в продольном направлении и прикрепите ее к восковому листу, обнажающему всю поверхность просвета 6 . Проведите качественную оценку целостности эндотелия по степени окрашивания краской Evans Blue 6 .
- Для других гистологических анализов отрежьте аорту поперечно и вложите ее в соединения оптимальной температуры резки (OCT), как это определено гистологическим методом, который будет использоваться 7 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Поперечные участки аорты, внедренные в ОКТ, секционировали и окрашивали гематоксилином и эозином, затем контуром окрашивали пятно Верхофф-Ван Гисона (ВВГ), чтобы идентифицировать внутреннюю и внешнюю эластичную пластину 7 . Раздражение травмы вызвало утолщение стенки аорты по сравнению с аортами животных, обработанных с помощью притворной процедуры (лапаротомия и мобилизация небольших кишечников в одиночку). Толщина стенки, определяемая расстоянием от адвентиции до просвета, была наибольшей через три дня после травмы (42,2 ± 1,7 мкм против 22,1 ± 1,1 мкм только для лапаротомии) ( рис. 2А-В ). Травма приводила к появлению клеток с более округлым внешним видом и нерегулярным контуром поверхности просвета ( рис. 2C ).
Увеличение утолщения стенки поврежденной аорты, по меньшей мере, частично обусловлено увеличением пролиферации медиальных сосудистых гладких мышцКлеток. Чтобы доказать, что утолщение стенки связано с увеличением пролиферации, а не с гипертрофией клеток, мы использовали анализ пролиферации ЭДУ. В этом анализе тимидиновый аналог 5-этинил-2'-дезоксиуридин (EdU) вводят внутривенно мыши за 24 часа до эвтаназии. EdU включается в ДНК во время синтеза. EdU обнаруживается реакцией щелчка (катализируемое медью азид-алкин-циклоприсоединение с использованием зелено-флуоресцентного красителя) 8 . Шейные мыши, подвергшиеся воздействию только лапаротомии, не наблюдали флуоресценции в любом слое аорты. Conversley, мыши, подвергшиеся повреждению аорты, продемонстрировали флуоресценцию как в среде, так и в интиме аорты ( рис. 3 ).
Сгущение стенки аорты после травмы при раздавливании активирует клеточные сигнальные пути, связанные с рестенозом у людей. Митоген-активированная протеинкиназа (MAP Kinase) ERK1 / 2 является одним из основных медиаторов формирования гиперплазии интимыВ ответ на стимуляцию митогена ERK1 / 2 фосфорилируется и активируется 9 , 10 . Данные нашей лаборатории также продемонстрировали, что ингибитор циклинзависимой киназы p27 kip1 снижается в ответ на митогенные стимулы в стенке сосуда 12 . Мышей подвергали эвтаназии через 1, 3, 7 дней и 1 месяц после травмы аорты. Инфрараенальная аорта была выделена и экспрессия ERK1 / 2, фосфо-ERK1 / 2 (активированная форма ERK1 / 2) и ингибитор циклической зависимой киназы p27 kip1 определяли с помощью Вестерн-блот-анализа ( фиг. 4A ). Никаких изменений в общей экспрессии белка ERK1 / 2 с течением времени не наблюдалось. Однако через три дня после травмы экспрессия phospho-ERK1 / 2 (Pi-ERK1 / 2) была на 200% больше, чем исходная экспрессия Pi-ERK1 / 2. Экспрессия p27 kip1 уменьшилась в ранние моменты времени и достигла надира приблизительно на 20% от базовой линии за семь днейТравмы. Оба экспрессии Pi-ERK1 / 2 и p27 kip1 аппроксимировали исходные уровни через месяц после травмы ( рисунок 4B ). Таким образом, наблюдаемое утолщение стенки аорты, по меньшей мере, частично связано с увеличением медиальной пролиферации.
Модель аортальной травмы позволяет одновременно оценивать как медиальную пролиферацию гладких мышц, так и функцию эндотелиального барьера. Сканирующую электронную микроскопию (SEM) использовали для характеристики эффекта повреждения при раздавливании на морфологию эндотелия. Лунная поверхность аорты выстилается конфлюентным эндотелием, который предотвращает адгезию клеток и молекул крови ( рис. 5А , шкала шкалы = 100 мкм). Напротив, повреждение при раздавливании приводит к нарушению эндотелиальных клеток и частичной денудации эндотелия ( рисунок 5B , шкала шкалы = 100 мкм). Как видно при более высоком увеличении, нарушение эндотелия приводит к адгезииНа частицах, согласованных по размеру и форме с тромбоцитами. Адгезия этих частиц происходит во всей зоне травмы и не ограничивается областями валовой денудации, наблюдаемыми при меньшем увеличении ( рис. 5C , шкала шкалы = 50 мкм). Морфология адгезивной частицы лучше всего наблюдается при более высоком увеличении. Эти частицы согласуются с тромбоцитами и фибрином ( рис. 5D , шкала шкалы = 10 мкм).
В дополнение к морфологии эндотелия барьерную функцию эндотелия можно оценить с помощью этой модели повреждения сосудов. Азо-краситель Evans Blue не может проникнуть в нормальный интактный эндотелий мышиной аорты. Повреждение барьерной функции эндотелия позволяет окрашивать базовую мембрану с помощью Evans Blue. Мыши, обработанные только лапаротомией (обман), поддерживали барьерную функцию эндотелия, и эти аорты были белыми. Ущерб от ранения привел кДиффузная потеря функции эндотелиального барьера, и эти аорты окрашены в синий цвет. Интенсивность окрашивания с помощью Evans Blue уменьшалась через три дня после травмы при раздавливании, а полная функция барьера восстанавливалась на неделе после травмы ( рисунок 6A ). Функция эндотелиального барьера может быть дополнительно определена путем взвешивания образцов и гомогенизации в 10-кратном объеме 50% раствора трихлоруксусной кислоты. Разбавление супернатанта в 4-кратном этаноле позволяет определить интенсивность флуоресценции (возбуждение 620 нм и излучение 680 нм), как описано Aoki et al . 11 . Количество эвансов Blue, элюированных из инфарренальной аорты, было выше в три раза выше в аортах сразу после травмы по сравнению с аортами, подвергшимися только лапаротомии (раненым - день 0). Аорта продолжала окрашиваться с помощью Evans Blue через один и три дня после травмы, но менее интенсивно, чем во время травмы, что предполагает постепенное восстановление функции эндотелиального барьера. Одна неделя на кормеЧто поврежденная аорта имела эквивалентное окрашивание как аорту, которой лечили только лапаротомию ( рис. 6В ).
Рисунок 1: Травма создается путем прямого измельчения аорты из левой почечной вены в бифуркацию аорты. Рисунок адаптирован с разрешения Yu et al ., PLoS One 2015 12 . Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Травма раздавливания вызывает утонение аорты. ( A ) Ущерб от разрушения вызвал морфологические изменения в аорте. Типичные сечения 5 мкм окрашивали VVG при 0,1, 3 и 7 дней после травмы. Шкала шкалы = 100 мкм. ( B ) Толщина стенки была наибольшей через 3 дня после травмы, 42,2 ± 1,7 мкм и была значительно больше, чем аорта ложных животных, подвергшихся воздействию только лапаротомии, 22,1 ± 1,1 мкм. Статистическую значимость определяли с помощью двухстороннего t-теста Студента. * Обозначает p <0,05, n = 3 ( C ). Урон при раздавливании вызывает округлое появление медиальных VSMC (окрашенных в зеленый цвет для α-гладкомышечного актина) и изменения ориентации клеток. Ядра были контрастированы с DAPI (синий). Шкала шкалы = 10 мкм. Данные представлены как средства и стандартные отклонения. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Травма раздавливания вызывает Cell ProlifeВ аортальной стене. Мыши подвергались либо только лапаротомии (обман), либо лапаротомии с травмой аорты. Тимидин-аналог 5-этинил-2'-дезоксиуридин (EdU) вводили за 24 часа до эвтаназии. EdU включается в ДНК во время синтеза. EdU обнаруживается реакцией щелчка (катализируемое медью азид-алкин-циклоприсоединение с использованием зелено-флуоресцентного красителя). Не было обнаруженного ЭДУ (зеленого) в аортальной стенке поддельных животных. У животных, подвергнутых травме сокрушения, EdU заметно освещался в средах аорты и в несколько меньшей степени в интиме. Сосудистые клетки гладкой мускулатуры идентифицировали окрашиванием α-гладкомышечным актиновым антителом (красный). Этот вывод показывает, что наблюдаемое утолщение стенки, наблюдаемое на рисунке 2, связано с увеличением пролиферации клеток. Шкала шкалы = 10 мкм. Нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этого фигурае.
Рисунок 4: Путь активации митоген-активированной протеинкиназы (MAP-киназы) активируется в ответ на травму дроу. ( A ) MAP Kinase ERK1 / 2 фосфорилируется при активации и ассоциируется с гиперплазией интимы и рестенозом. Мышей подвергали эвтаназии через 1, 3, 7 дней и 1 месяц после травмы аорты. Вестерн-блот-анализ использовали для оценки экспрессии белка общего ERK1 / 2, фосфо-ERK1 / 2 и ингибитора циклинзависимой киназы p27 kip1 . Экспрессия белка была нормализована к ложному животному, которому лечили только лапаротомию. ( B ) Никаких изменений в общей экспрессии белка ERK1 / 2 с течением времени не наблюдалось. Однако через три дня после травмы экспрессия phospho-ERK1 / 2 (Pi-ERK1 / 2) была на 200% больше, чем исходная экспрессия Pi-ERK1 / 2. P27 kip1 выражение уменьшилось в ранние моменты времени aD достигли надира примерно на 20% от исходного уровня через семь дней после травмы. Оба выражения Pi-ERK1 / 2 и p27 kip1 аппроксимировали исходные уровни через месяц после травмы. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5. Травма раздавливания разрушает эндотелиальные клетки аорты. ( A ) Сканирующую электронную микроскопию (SEM) использовали для характеристики влияния повреждения при раздавливании на морфологию эндотелия. Поверхность просвета нормальной аорты выстилается конфлюентным эндотелием, который предотвращает адгезию клеток и молекул, рожденных в крови. ( B ) Повреждение раны приводит к нарушению эндотелиальных клеток и частичной денудации эндотелия. ( C ) Как видно на более высокой величинеРазрушение эндотелия приводит к адгезии частиц, соответствующих размерам и форме с тромбоцитами. Адгезия этих частиц происходит во всей зоне повреждения и не ограничивается областями грубой денудации, наблюдаемыми при меньшем увеличении. ( D ) При более высоком увеличении эти частицы согласуются с тромбоцитами и фибрином. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Туманная аортальная травма позволяет количественно определить функцию эндотелиального барьера. ( A ) Повреждение барьерной функции эндотелия позволяет окрашивать основную мембрану краской Evans Blue. Мыши, получавшие только лапаротомию (обман), поддерживали барьерную функцию эндотелия иEse aortas были белыми. Ущерб от раздавливания привел к диффузной потере функции эндотелиального барьера, и эти аорты окрашивались в синий цвет. Интенсивность окрашивания с помощью Evans Blue уменьшалась через три дня после травмы при раздавливании, а полная барьерная функция восстанавливалась через неделю после травмы. ( B ) Связывание Evans Blue с инфаренальной аортой количественно определяли элюированием Эванса Блю от образца и количественной оценкой интенсивностью флуоресценции. Данные представлены как средства и стандартные отклонения. Самый Evans Blue был элюирован из аорты сразу после травмы раздавливания. Во время травмы аорта в три раза превышала Эванс Блю, чем аорта, подвергнутая только лапаротомии. Поскольку аорте было позволено выздоравливать, было меньше связывания через один и три дня после травмы. Через неделю после травмы аорта связала такое же количество Эванса Синего, что и аорты, подвергшиеся только лапаротомии. Статистическую значимость определяли с помощью двухстороннего t-теста Студента. * DeПримечания p <0,05, n = 3, NS означает не существенное. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы охарактеризовали влияние модели повреждения мышиной аорты, которая приводит к медиальной гиперплазии и дисфункции эндотелиальных барьеров. Частичное отделение EC вдоль аорты интимы сопровождалось потерей клеточного клеточного контакта и усилением клеточных выступов. Соответственно, эндотелиальная барьерная функция была значительно ослаблена, что стимулировало митоген-чувствительные сигнальные пути, что привело к пролиферации VSMC и утолщению стенки сосуда. Сильные стороны этой модели в том, что ее технически легче изучать и выполнять, чем другие аортальные модели болезни, и позволяет одновременно анализировать как пролиферативный ответ на травму, так и функцию эндотелия. Критическим шагом в этом протоколе является фактическая травма при раздавливании. Изменчивость в степени травмы при раздавливании может приводить к различной степени травматизма и, следовательно, к различной степени пролиферации гладких мышечных клеток. Одним из шагов, который снижает эту изменчивость в нашей лаборатории, являетсяCientist, ослепленный для лечения или экспериментального состояния, выполняет все травмы при раздавливании.
Ограничением этой модели является ее обобщаемость для клинически значимых человеческих болезней. Несмотря на ранний устойчивый пролиферативный ответ VSMC в этой модели, он не моделирует поздние события рестеноза, то есть не развивается неоинтима. Снижение воспалительных медиаторов, таких как цитокины, может регулировать этот процесс. Это может быть связано с быстрым восстановлением эндотелия от частичного повреждения. Подобно ранее описанной модели травмы сосудов, связанной с поражением кроликов 13 , инфильтрация иммунных клеток была незначительной. В настоящем исследовании мы оценили профиль воспалительных цитокинов животных-обманутых животных и животных с повреждением аорты с помощью профилирующего массива. Однако не было существенной разницы в профиле цитокинов, что объясняло бы разницу в пролиферативном ответе между обманом и поврежденными животными (данныене показано). Ущерб, описанный в настоящем докладе, временно ограничен. В то время как другие модели аортальной травмы и гиперплазии интимы, такие как модель аортальной ангиопластики, полностью отрицают эндотелий, настоящая модель лишь частично отрицает аорту. Полная денудация эндотелия требует значительно дольше для выздоровления, и эти животные испытывают последствия травмы в течение более длительного периода времени.
Эта модель дает быстрый ответ VSMC и EC на травму, позволяющую количественно определять морфологические и биохимические изменения в течение одной недели. Он более эффективен, чем другие модели, которые занимают 14-28 дней до того, как эффект вмешательства станет очевидным. В этой модели используется аорта для мыши, которая является единственным сосудом для мыши, который приближается к клинически значимому человеческому сосуду. Существенным преимуществом этой методики по сравнению с другими аортальными моделями является то, что эта модель относительно проста в изучении и не требует дорогого или трудного получения eqUipment 2 , 3 , 4 , 5 . В заключение, модель повреждения мышц аорты мыши представляет собой технически простую, недорогую, эффективную платформу in vivo для одновременной оценки реакции VSMC и EC на сосудистую травму.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Эта работа финансировалась Департаментом по вопросам развития карьеры в области ветеранов (1IK2BX001553-01) (TSM) и стипендией Vascular Cures EJ Wylie (TSM).
Acknowledgments
Мы благодарим докторскую степень Hsia Ru-ching от Главной основы электронной микроскопии Школы медицины Университета Мэриленда за ее техническую поддержку в обработке образцов сканирующей электронной микроскопии.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ocular lubricant | Dechra | 17033-211-38 | Pharmaceutical agents |
| Isoflurane | VetOne | 502017 | Pharmaceutical agents |
| Carprofen | Zoetis | 26357 | Pharmaceutical agents |
| Precision vaporizer | Summit Medical | 10675 | Surgical supplies |
| Charcoal scavenger | Bickford Inc. | 80120 | Surgical supplies |
| Isothermal pad | Harvard Apparatus | 50-7053-R | Surgical supplies |
| Sterile cotton-tipped applicator | Fisher Scientific | 23-400-124 | Surgical supplies |
| 4-0 absorbable monofilament suture | Ethicon, Inc | J310 | Surgical supplies |
| 5-0 non-absorbable monofilament suture | Ethicon,Inc | 1666 | Surgical supplies |
| 21-gauge x 1 inch needle | BD Biosciences | 305165 | Surgical supplies |
| 25-gauge x 1 inch needle | BD Biosciences | 305125 | Surgical supplies |
| Dry sterilizer | Cellpoint | 7770 | Surgical supplies |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14058-09 | Surgical instruments |
| Adson forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | Surgical instruments |
| Dumont #5 fine forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | Surgical instruments |
| Vannas Spring Scissors 3 mm cutting edge | Fine Science Tools | 15000-00 | Surgical instruments |
| Needle driver | Fine Science Tools | 91201-13 | Surgical instruments |
| Scalpel handle #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | Surgical instruments |
| Scalpel blades #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | Surgical instruments |
| PBS | Lonza | 17-516F | Reagents for tissue processing |
| Evans Blue | Sigma-Aldrich | E2129 | Reagents for tissue processing |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Reagents for tissue processing |
| Modeling wax | Bego | 40001 | Reagents for tissue processing |
| OCT compound | Tissue-Tek Sakura | 4583 | Reagents for tissue processing |
| Mayer's hematoxylin solution | Sigma-Aldrich | MHS16 | Reagents for immunohistological analysis |
| Eosin Y solution alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110316 | Reagents for immunohistological analysis |
| Elastin stain kit | Sigma-Aldrich | HT25A | Reagents for immunohistological analysis |
| Click-it Edu Alexa-488 Imaging Kit | Invitrogen | C10337 | Reagents for immunohistological analysis |
| Anti-Erk1/2 antibody | Cell Signaling Technology | 4695 | Reagents for immunohistological analysis |
| Anti-phospho-Erk1/2 antibody | Cell Signaling Technology | 4370 | Reagents for immunohistological analysis |
| Anti-p27kip1 antibody | Cell Signaling Technology | 3698 | Reagents for immunohistological analysis |
| Trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | T9159 | Reagents for immunohistological analysis |
References
- Carmeliet, P.
- Carmeliet, P., Moons, L., Collen, D. Mouse models of angiogenesis, arterial stenosis, atherosclerosis and hemostasis. Cardiovasc Res. 39 (1), 8-33 (1998).
- Baker, A. B., et al. Heparanase Alters Arterial Structure, Mechanics, and Repair Following Endovascular Stenting in Mice. Circ Res. 104 (3), 380-387 (2009).
- Petrov, L., Laurila, H., Hayry, P., Vamvakopoulos, J. E. A mouse model of aortic angioplasty for genomic studies of neointimal hyperplasia. J Vasc Res. 42 (4), 292-300 (2005).
- Li, J., et al. Vascular smooth muscle cells of recipient origin mediate intimal expansion after aortic allotransplantation in mice. Am J Path. 158 (6), 1943-1947 (2001).
- Radu, M., Chernoff, J. An in vivo assay to test blood vessel permeability. J Vis Exp. (73), e50062 (2013).
- Turbett, G. R., Sellner, L. N. The use of optimal cutting temperature compound can inhibit amplification by polymerase chain reaction. Diagn Mol Pathol. 6 (5), 298-303 (1997).
- Puchtler, H., Waldrop, F. S. On the mechanism of Verhoeff's elastica stain: a convenient stain for myelin sheaths. Histochem. 62 (3), 233-247 (1979).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- Nelson, P. R., Yamamura, S., Mureebe, L., Itoh, H., Kent, K. C. Smooth muscle cell migration and proliferation are mediated by distinct phases of activation of the intracellular messenger mitogen-activated protein kinase. J Vasc Surg. 27 (1), 117-125 (1998).
- Rzucidlo, E. M. Signaling pathways regulating vascular smooth muscle cell differentiation. Vascular. 17, Suppl 1. S15-S20 (2009).
- Aoki, T., Sumii, T., Mori, T., Wang, X., Lo, E. H. Blood-brain barrier disruption and matrix metalloproteinase-9 expression during reperfusion injury: mechanical versus embolic focal ischemia in spontaneously hypertensive rats. Stroke. 33 (11), 2711-2717 (2002).
- Yu, D., et al. MARCKS Signaling Differentially Regulates Vascular Smooth Muscle and Endothelial Cell Proliferation through a KIS-, p27kip1- Dependent Mechanism. PLoS One. 10 (11), e0141397 (2015).
- Banai, S., et al. Rabbit ear model of injury-induced arterial smooth-muscle cell-proliferation - kinetics, reproducibility, and implications. Circ Res. 69 (3), 748-756 (1991).
