Summary
La restéose après les interventions cardiovasculaires (chirurgie de pontage, angioplastie ou stent) est un problème important qui réduit la durabilité de ces procédures. Une thérapie idéale inhiberait la prolifération des cellules musculaires lisses (VSMC) tout en favorisant la régénération de l'endothélium. Nous décrivons un modèle pour l'évaluation simultanée de la prolifération de VSMC et de la fonction endothéliale in vivo.
Abstract
La reconstruction artérielle, qu'il s'agisse d'une angioplastie ou d'une chirurgie ponctuelle, implique un traumatisme iatrogène causant une perturbation endothéliale et une prolifération de cellules musculaires lisses vasculaires (VSMC). Les modèles murins communs étudient de petits vaisseaux tels que les artères carotide et fémorale. Dans ce cas, nous décrivons un système in vivo dans lequel la prolifération de VSMC et la fonction de barrière endothéliale peuvent être évaluées simultanément dans un grand vaisseau. Nous avons étudié la réponse de l'aorte infrarénale aux blessures chez les souris C57BL / 6. L'aorte a été blessée de la veine rénale gauche à la bifurcation aortique par 30 écrasements transmuraux de 5 secondes avec un applicateur à pointe de coton. Les changements morphologiques ont été évalués avec une histologie conventionnelle. L'épaisseur de la paroi de l'aorte a été mesurée de la surface luminal à l'adventice. L'intégration EdU et le contre-coloration avec DAPI et alpha-acttin ont été utilisés pour démontrer la prolifération de VSMC. L'activation de ERK1 / 2, un modérateur connu de formation d'hyperplasie intimale, a été dissuadéeExtraite par l'analyse Western Blot. L'effet de l'inflammation a été déterminé par l'immunohistochimie pour les cellules B, les lymphocytes T et les macrophages . Les sections en face de l'endothélium ont été visualisées avec microscopie électronique à balayage (SEM). La fonction de barrière endothéliale a été déterminée avec une coloration Evans Blue. Les lésions transmissibles ont entraîné un épaississement de la paroi aortique. Cette blessure a induit la prolifération de VSMC, plus en évidence à 3 jours après la blessure, et une activation précoce de ERK1 / 2 et une diminution de l'expression de p27 kip1. Les lésions n'entraînaient pas une augmentation de l'infiltration des cellules B, des lymphocytes T ou des macrophages dans la paroi du vaisseau. Les lésions ont provoqué une dénudellation partielle de cellules endothéliales et une perte de contact cellulaire. Les blessures ont entraîné une perte significative de la fonction de barrière endothéliale, qui est revenue à la ligne de base après sept jours. Le modèle de blessure aortique émoussée transmural murine fournit un système efficace pour étudier simultanément la prolifération de VSMC et la fonction de barrière endothéliale dans un grand vaisseau.
Introduction
La rhinésie Les procédures cardiovasculaires (bypass chirurgical, angioplastie ou stent) constituent un problème important qui réduit la durabilité de ces procédures. Toutes les procédures de revascularisation sont en proie à la resténose. Les stratégies actuelles pour prévenir la resténose (stents à élution médicamenteuse et ballons enduits de médicaments) inhibent à la fois la cellule musculaire lisse vasculaire (VSMC) et la prolifération des cellules endothéliales (EC). Par conséquent, ces interventions empêchent la resténose médiée par VSMC, mais empêchent également la régénération de l'endothélium. Sans un endothélium intact, les patients doivent être sur des agents antiplaquettaires puissants pour diminuer le risque de thrombose in situ au risque de complications saignantes. Une thérapie idéale inhiberait la prolifération de VSMC tout en favorisant la régénération de l'endothélium. Ainsi, il est nécessaire d'étudier simultanément la prolifération de VSMC et la fonction de barrière endothéliale i n vivo .
À l'heure actuelle, il y a desTous les modèles de souris de resténose 1 . Ces modèles comprennent la ligature de la carotide et l'altération du fil de l'artère fémorale 2 . Les modèles aortiques comprennent le placement de stent 3 , la blessure par ballonnet 4 et l'allogreffe aortique 5 . Tous les modèles actuels sont limités. La ligature carotidienne génère une lésion neointimale médiée par un flux et n'a pas de lésion endothéliale. De plus, les artères carotides et fémorales ont beaucoup moins de couches cellulaires que les vaisseaux humains, ce qui limite leur valeur de traduction. L'aorte de la souris, d'environ 1,3 mm de diamètre, est le seul vaisseau qui se rapproche d'une artère humaine (coronaire) cliniquement pertinente (3).
Malgré le potentiel de traduction des modèles aortiques murins de la maladie, les modèles actuels ont des limites. Ces modèles nécessitent des compétences microchirurgicales avancées et des équipements spécialisés tels que les ballons et stents d'angioplastie. Nous présentons iciUne nouvelle technique reproductible pour induire simultanément la prolifération de VSMC et perturber la fonction de barrière endothéliale.
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Protocol
Déclaration d'éthique: les protocoles pour la manipulation des animaux ont été approuvés par le Comité institutionnel pour les soins et l'utilisation des animaux (IACUC) de l'Université du Maryland (numéro de protocole 0416009) et ont été conduits selon les normes AAALAC-International.
1. Procédure chirurgicale
- Technique anesthésique
- Stériliser tous les instruments utilisés dans la chirurgie de survie avec stérilisation à la vapeur à 121 ° C pendant 30 min.
- Induire l'anesthésie par un réservoir d'induction avec 100% O 2 et 2,5% d'isoflurane livré par vaporisateur de précision. Après l'induction, arrêter l'isoflurane et rincer la chambre avec O 2 . Maintenir l'anesthésie avec 1,5-2% d'isoflurane par masque facial et 1 L / min O 2 par inhalation.
- Fixez à la fois la chambre d'induction et le masque facial à un abatteur de charbon pour l'adsorption des gaz d'échappement pour protéger le personnel. Assurer un plan anesthésique adéquat par démonstrationEn ce sens qu'il n'y a pas de réponse aux stimuli nocifs (pincement de l'orteil).
- Créez un champ opératoire composé d'un bac chirurgical avec un tampon isotherme pour fournir un support thermique pendant la chirurgie. Un coussin isotherme supplémentaire fournira un support thermique aux animaux dans leur cage de récupération.
- Préparation animale
- Effectuer l'enquête suivante sur des souris C57BL / 6 mâles de 10 à 12 semaines.
- Retirer les cheveux sur la surface ventrale abdominale de l'animal du sternum à la région inguinale avec un agent dépilatoire ou une tondeuse électrique avec une lame numéro 40.
- En cas d'agent dépilatoire, appliquer ce composé dans la zone chirurgicale pendant 2-3 min, puis retirer avec du coton. Nous utilisons un composé d'hydroxyde de calcium et d'hydroxyde de sodium disponible dans le commerce.
- Préparer la zone sur l'épaule avec 70% d'alcool et injecter par voie sous-cutanée du carprofène (5 mg / kg) avec une aiguille de calibre 25 ou plus petite. CeLe traitement offrira une analgésie postopératoire pour l'animal.
- Transférer l'animal sur le champ chirurgical et le positionner en recule dentaire.
- Préparez le site chirurgical en éliminant 8-12% de providone-iodé avec un applicateur de coton propre ou une gaze de coton. Puis rincer la peau deux fois avec 70% d'alcool.
- Placez le lubrifiant oculaire dans les deux yeux pour réduire l'incidence de la dessiccation de la cornée. Couvrez le site chirurgical avec un drap stérile.
- Technique opérationnelle
- Faire une incision médiane de laparotomie abdominale d'environ 2 à 2,5 cm de longueur avec un scalpel commençant immédiatement le processus de xiphoïde caudal et s'étendant vers le bassin.
- Mobiliser l'intestin grêle et le duodénum et réfléchir latéralement vers la droite. Enrouler une bande de coton stérile gazée et trempée avec une solution saline stérile pour injecter pour permettre l'emballage des viscères afin d'améliorer l'exposition.
- Avec l'intestin grêle mobilisé sur le côté droit de laAbdomen, exposer le retroperitoneum et exposer l'aorte abdominale de la veine rénale gauche à la bifurcation aortique ( figure 1 ).
- Avec un applicateur stérile à pointe de coton, livrer 30 écrasements consécutifs, chaque cinq secondes de durée.
- Retirez l'emballage et permettez aux viscères de revenir à leur position native.
- Faisceau fermé avec une suture monofilament absorbable 4-0 (polydioxanone). La peau est fermée avec une suture de monofilament non-absorbable 6-0 (nylon).
- Recouvrement et soins post-procédure
- Après la procédure, placez l'animal dans une cage de récupération avec un linge de lit propre sur un tampon isotherme pour continuer le support thermique jusqu'à ce que l'animal puisse ambuler normalement. Ne laissez pas l'animal sans surveillance jusqu'à ce qu'il démontre la capacité de maintenir le recul sternal.
- Surveiller l'animal toutes les heures pour les 4 premières heures après la chirurgie. Une fois que l'animal est en ambulance, il retourne normalement i T à la salle d'élevage assignée. L'animal ne sera pas logé en compagnie d'un autre animal jusqu'à ce qu'il soit totalement récupéré.
- Surveiller l'animal deux fois par jour pendant les 72 premières heures après la chirurgie et au moins 3 fois par semaine par la suite. La surveillance comprend la pesée de l'animal trois fois par semaine.
- Administrer le carpofen (5 mg / kg) par voie sous-cutanée deux fois par jour pendant les 72 premières heures après l'intervention chirurgicale.
2. Approvisionnement en tissu
- Méthode de l'euthanasie
- Éuthaniser les animaux à des points de temps prédéterminés.
- Induire l'anesthésie par un réservoir d'induction avec 100% O 2 et 2,5% d'isoflurane livré par vaporisateur de précision.
- Pour étudier l'intégrité de l'endothélium, administrer le colorant bleu Evans à l'animal.
NOTE: Evans Blue est un colorant azoïque chargé négativement avec une forte affinité de liaison pour l'albumine et ne peut colorer que les vaisseaux sanguins en l'absence d'un endothélium intactS = "xref"> 6. - Pour les études d'intégrité endothéliale, au moment de l'euthanasie, perfuser les animaux avec 5 ml de colorant Evans Blue 0,3% suivi de 5 ml de PBS à la pression physiologique pendant 5 min. L'animal est maintenu dans un plan chirurgical d'anesthésie pendant la procédure de perfusion.
- Pour étudier l'intégrité de l'endothélium, administrer le colorant bleu Evans à l'animal.
- Après avoir atteint un plan anesthésique profond, ouvrez la poitrine avec une sternotomie. Faire une lacération dans l'oreillette droite pour permettre le drainage du sang de l'animal et accéder au ventricule gauche est accessible avec une aiguille de 21 G et injecter une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) jusqu'à ce que l'effluent de l'oreillette droite soit dégagé.
- Après perfusion avec PBS, entre dans l'abdomen par une incision de la ligne médiane.
- Encore une fois, mobiliser l'intestin grêle sur le côté droit de l'abdomen exposant l'aorte infrarouge, disséquer fortement l'aorte des tissus adjacents et l'accise de la veine rénale gauche à la bifurcation aortique.
- Conserver l'aorte excisée dans un paraformald à 4%Solution d'ehyde jusqu'à ce que le traitement du tissu se produise.
- Pour les études d'intégrité endothéliale, ouvrez l'aorte longitudinalement et fixez-la sur une feuille de cire exposant l'intégralité de la surface luminaire 6 . Effectuer une évaluation qualitative de l'intégrité endothéliale par degré de coloration avec du colorant Evans Blue 6 .
- Pour d'autres analyses histologiques, sectionnez l'aorte transversalement et insérez-la dans des composés optimaux de température de coupe (OCT) selon la méthode histologique à utiliser 7 .
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Representative Results
Les sections transversales aorte encastrées dans OCT ont été sectionnées et colorées avec de l'hématoxyline et de l'éosine, puis contre le coloris avec Verhoeff-Van Gieson (VVG) pour identifier la lame élastique interne et externe 7 . L'épaississement de la paroi aortique induit un épaississement de la paroi aortique par rapport aux aortas des animaux traités avec une procédure simulée (laparotomie et mobilisation intestinale seule). L'épaisseur de la paroi, évaluée par la distance de l'adventice à la lumière, était supérieure à trois jours après la blessure (42,2 ± 1,7 μm contre 22,1 ± 1,1 μm pour laparotomie seule) ( figure 2A-B ). Les lésions ont entraîné une apparition plus arrondie et un contour irrégulier de la surface luminaire ( figure 2C ).
L'augmentation de l'épaississement de la paroi de l'aorte blessée est au moins en partie médiée par une prolifération accrue de musculaires vasculaires médiansCellules claires. Pour prouver que l'épaississement de la paroi est due à une prolifération accrue par opposition à l'hypertrophie cellulaire, nous avons utilisé un dosage de prolifération EdU. Dans ce dosage, l'analogue de la thymidine 5-éthynyl-2'-désoxyuridine (EdU) est administré par voie intraveineuse à la souris 24 h avant l'euthanasie. EdU est incorporé dans l'ADN pendant la synthèse. L'EDU est détecté par une réaction de clic (cycloaddition d'azote-alkyde catalysée par du cuivre à l'aide d'un colorant fluorescent vert) 8 . Les souris Sham exposées uniquement à la laparotomie n'avaient aucune fluorescence observée dans aucune couche de l'aorte. Conversley, les souris soumises à une lésion aortique ont démontré une fluorescence dans les médias et l'intima de l'aorte ( figure 3 ).
L'épaississement de la paroi aortique après une blessure par écrasement active les voies de signalisation cellulaire impliquées dans la resténose chez l'homme. La protéine kinase activée par mitogène (MAP Kinase) ERK1 / 2 est l'un des principaux médiateurs de la formation d'hyperplasie intimaleEn réponse à la stimulation d'un mitogène, ERK1 / 2 est phosphorylé et activé 9 , 10 . Les données de notre laboratoire ont également démontré que l'inhibiteur de kinase dépendante de cycline p27 kip1 est diminué en réponse à des stimuli mitogènes dans la paroi vasculaire 12 . Les souris ont été euthanasiées à 1, 3, 7 jours et 1 mois après une blessure par écrasement aortique. L'aorte infrarentale a été isolée et l'expression de la protéine ERK1 / 2, phospho-ERK1 / 2 (la forme activée de ERK1 / 2) et l'inhibiteur de la kinase dépendante de la cycline p27 kip1 ont été déterminées par analyse Western Blot ( Figure 4A ). Aucun changement n'a été observé dans l'expression totale de la protéine ERK1 / 2 au fil du temps. Cependant, trois jours après la blessure, l'expression de phospho-ERK1 / 2 (Pi-ERK1 / 2) était supérieure à 200% par rapport à l'expression initiale de Pi-ERK1 / 2. L' expression de p27 kip1 a diminué au début des points de temps et a atteint un nadir d'environ 20% de la ligne de base sept jours aprèsUne blessure. L' expression kip1 de Pi-ERK1 / 2 et p27 a approché les niveaux de référence un mois après la blessure ( Figure 4B ). Ainsi, l'épaississement observé de la paroi aortique est au moins en partie dû à une augmentation de la prolifération médiale.
Le modèle de blessure aortique permet une évaluation simultanée de la prolifération des muscles lisses médians et de la fonction de la barrière endothéliale. La microscopie électronique à balayage (SEM) a été utilisée pour caractériser l'effet de la blessure par écrasement sur la morphologie de l'endothélium. La surface luminaire de l'aorte est bordée d'un endothelium confluent qui empêche l'adhérence de cellules et de molécules nées de sang ( Figure 5A , Barre d'échelle = 100 μm). En revanche, les blessures par écrasement entraînent une perturbation des cellules endothéliales et une dénudation partielle de l'endothélium ( Figure 5B , Barre d'échelle = 100 μm). Comme on l'a vu à un grossissement plus élevé, la rupture de l'endothélium entraîne une adhésionSur des particules constantes en taille et en forme avec des plaquettes. L'adhérence de ces particules se produit dans toute la zone de blessure et ne se limite pas aux zones de dénudation brute observées à un grossissement inférieur ( Figure 5C , Barre d'échelle = 50 μm). La morphologie de la particule adhérente est mieux observée à un grossissement plus élevé. Ces particules sont compatibles avec les plaquettes et la fibrine ( Figure 5D , Barre d'échelle = 10 μm).
En plus de la morphologie endothéliale, la fonction de barrière de l'endothélium peut être évaluée avec ce modèle de lésion vasculaire. Le colorant azoïque Evans Blue ne peut pas imprégner l'endothélium normal et intact de l'aorte murine. Un endommagement de la fonction de barrière de l'endothélium permet de colorer la membrane basale avec Evans Blue. Les souris traitées à une seule laparotomie (simulée) ont maintenu la fonction de barrière de l'endothélium et ces aortas étaient blanches. Les blessures par écrasement ont entraînéPerte diffuse de la fonction de barrière endothéliale et ces aortas colorées en bleu foncé. L'intensité de la coloration avec Evans Blue a été diminuée trois jours après les blessures par écrasement, et la fonction de barrière complète a été restaurée la semaine après la blessure ( figure 6A ). La fonction de barrière endothéliale peut être encore quantifiée en pesant les échantillons et en homogénéisant dans un volume de 10 fois de solution à 50% d'acide trichloroacétique. Diluer le surnageant en 4 fois d'éthanol permet de déterminer l'intensité de fluorescence (excitation 620 nm et émission 680 nm) comme décrit par Aoki et al . 11 . La quantité de Evans Blue élué de l'aorte infrarentale était plus de trois fois plus élevée dans les aortas immédiatement après une blessure que chez les aortas soumis uniquement à laparotomie (Blessure - Jour 0). L'aorte a continué à tacher avec Evans Blue à un et trois jours après la blessure, mais moins intensément qu'au moment de la blessure, ce qui suggère une récupération progressive de la fonction de barrière endothéliale. Une semaine à l'arrièreSi l'aorte blessée avait une coloration équivalente comme une aorte traitée avec une laparotomie seule ( figure 6B ).
Figure 1: Les lésions sont créées par écrasement brutal de l'aorte de la veine rénale gauche à la bifurcation aortique. Figure adaptée avec la permission de Yu et al ., PLoS One 2015 12 . Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2: Les blessures par écrasement induit l'épaississement de la paroi aortique. ( A ) Les modifications morphologiques induites par un écrasement dans l'aorte. Des sections représentatives de 5 μm ont été colorées avec VVG à 0,1, 3 et 7 jours après la blessure. Barres d'échelle = 100 μm. ( B ) L'épaisseur de la paroi était la plus élevée 3 jours après la blessure, 42,2 ± 1,7 μm, et était significativement plus grande que l'aorte des animaux simulés exposés à la laparotomie seule, 22,1 ± 1,1 μm. La signification statistique a été déterminée avec le test t de deux fils de Student. * Indique p <0,05, n = 3. ( C ) Les blessures par écrasement induit une apparence arrondie de VSMC médiale (colorés en vert pour l'actine du muscle lisse) et l'évolution de l'orientation des cellules. Les noyaux ont été contre-colorés avec DAPI (Bleu). Barres d'échelle = 10 μm. Les données sont présentées comme moyen et écart-type. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3: Blush Injury Induces Cell ProlifeRation dans le mur aortique. Les souris ont été exposées soit à laparotomie seule (faussement), soit à une laparotomie avec une blessure par contamination aortique. Analogue de la thymidine La 5-éthynyl-2'-désoxyuridine (EdU) a été administrée 24 h avant l'euthanasie. EdU est incorporé dans l'ADN pendant la synthèse. L'EDU est détecté par une réaction de clic (cycloaddition d'azote-alkyde catalysée par du cuivre à l'aide d'un colorant fluorescent vert). Il n'y avait aucun EDU détectable (vert) dans la paroi aortique des animaux simulés. Chez les animaux soumis à une blessure par écrasement, EdU coloré de manière prédominante dans les milieux de l'aorte et à un degré légèrement inférieur à l'intima. Les cellules des muscles lisses vasculaires ont été identifiées par coloration avec un anticorps de l'actine du muscle lisse (rouge). Cette découverte suggère que l'épaississement de la paroi observée observé à la figure 2 est dû à une augmentation de la prolifération cellulaire. Barres d'échelle = 10 μm. Cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figurineE.
Figure 4: La voie de protéine kinase activée par Mitogen (MAP Kinase) est activée en réponse à une blessure par écrasement. ( A ) La MAP Kinase ERK1 / 2 est phosphorylée lorsqu'elle est activée et est associée à une hyperplasie et à une resténose à l'intimité. Les souris ont été euthanasiées à 1, 3, 7 jours et 1 mois après une blessure par écrasement aortique. L'analyse Western Blot a été utilisée pour évaluer l'expression protéique de ERK1 / 2 total, phospho-ERK1 / 2 et l'inhibiteur kinase dépendante de cycline p27 kip1 . L'expression des protéines a été normalisée à un animal simulant traité avec laparotomie seule. ( B ) Aucun changement n'a été observé dans l'expression totale de la protéine ERK1 / 2 au fil du temps. Cependant, trois jours après la blessure, l'expression de phospho-ERK1 / 2 (Pi-ERK1 / 2) était supérieure à 200% par rapport à l'expression initiale de Pi-ERK1 / 2. L' expression p27 kip1 a diminué au début des points etD atteint un nadir d'environ 20% de la ligne de base sept jours après la blessure. L' expression kip1 de Pi-ERK1 / 2 et p27 a approximé les niveaux de référence un mois après la blessure. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5. Les blessures par écrasement perturbent les cellules endothéliales aortiques. ( A ) La microscopie électronique à balayage (SEM) a été utilisée pour caractériser l'effet de la blessure par écrasement sur la morphologie de l'endothélium. La surface luminaire de l'aorte normale est bordée par un confluent, l'endothélium qui empêche l'adhésion des cellules et des molécules nées dans le sang. ( B ) Les blessures par écrasement entraînent une rupture des cellules endothéliales et une dénudation partielle de l'endothélium. ( C ) Comme on l'a vu à plus haut magnificaLa rupture de l'endothélium entraîne une adhérence des particules en forme et en taille avec des plaquettes. L'adhérence de ces particules se produit dans toute la zone de blessure et ne se limite pas aux zones de dénudation brute observées à un grossissement plus faible. ( D ) À un grossissement plus élevé, ces particules sont compatibles avec les plaquettes et la fibrine. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 6: L'accident aortique brutal permet la quantification de la fonction de barrière endothéliale. ( A ) Les dommages à la fonction de barrière de l'endothélium permettent la coloration de la membrane basale avec du colorant Evans Blue. Les souris traitées à une seule laparotomie (simulée) ont maintenu la fonction de barrière de l'endothélium et de la thérapieCes aortas étaient blancs. Une blessure par écrasement a entraîné une perte diffuse de la fonction de barrière endothéliale et ces aortas ont été colorées en bleu foncé. L'intensité de la coloration avec Evans Blue a été diminuée trois jours après les blessures par écrasement, et la fonction de barrière complète a été restaurée la semaine après la blessure. ( B ) La liaison de Evans Blue à l'aorte infrarentale a été quantifiée en éluant Evans Blue à partir de l'échantillon et en quantifiant par intensité de fluorescence. Les données sont présentées comme moyen et écart-type. Le plus Evans Blue a été élué de l'aorte immédiatement après une blessure par écrasement. Au moment de la blessure, l'aorte a été reliée trois fois plus par Evans Blue que l'aorte soumise à laparotomie seule. Lorsque l'aorte a été autorisée à se rétablir, il y a eu moins de liaison à un et trois jours après la blessure. Une semaine après la blessure, l'aorte a lié la même quantité de Evans Blue que les aortas soumis à laparotomie seule. La signification statistique a été déterminée avec le test t de deux fils de Student. * DeNotes p <0,05, n = 3, NS indique non significatif. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Nous avons caractérisé les effets d'un modèle de blessure aortique murine qui se traduit par une hyperplasie médiale et un dysfonctionnement de la barrière endothéliale. Le détachement partiel de CE le long de l'intima de l'aorte a accompagné la perte de contact cellulaire et l'amélioration des protrusions cellulaires. De manière correspondante, la fonction de barrière endothéliale a été considérablement altérée, ce qui a stimulé les voies de signalisation sensibles aux mitogènes, entraînant la prolifération de VSMC et l'épaississement de la paroi vasculaire. Les atouts de ce modèle sont qu'il est techniquement plus facile d'apprendre et d'exécuter que d'autres modèles aortiques de la maladie et permet une évaluation simultanée de la réponse proliférative aux blessures et à la fonction endothéliale. L'étape critique dans ce protocole est la blessure réelle de l'écrasement. La variabilité dans l'étendue de la blessure par écrasement pourrait entraîner des degrés divers de blessure et donc des quantités variables de prolifération cellulaire des muscles lisses. Une étape qui réduit cette variabilité dans notre laboratoire est d'avoir un sScientifique, aveuglé au traitement ou à l'état expérimental, effectue toutes les blessures par écrasement.
Une limitation de ce modèle est sa généralisation aux processus de maladie humaine cliniquement pertinents. En dépit de la réponse proliférative rapide et rapide de VSMC dans ce modèle, elle ne modélise pas les événements tardifs de la resténose, c'est-à-dire qu'aucune neointima n'a été développée. La diminution des médiateurs inflammatoires tels que les cytokines pourrait réguler ce processus. Cette constatation pourrait être due à la récupération rapide de l'endothélium d'une blessure partielle. À l'instar d'un modèle de blessure par écrasement vasculaire signalé précédemment chez les lapins 13 , l'infiltration des cellules immunitaires était mineure. Dans la présente enquête, nous avons évalué le profil des cytokines inflammatoires, les animaux simulés et les animaux lésés aortiques avec le tableau des profils. Cependant, il n'y avait pas de différence significative dans le profil de la cytokine qui expliquerait la différence dans la réponse proliférative entre les animaux simulés et blessés (donnéespas montré). La blessure décrite dans le présent rapport est temporairement limitée. Alors que d'autres modèles de lésions aortiques et d'hyperplasie de l'intimité telles que le modèle d'angioplastie aortique dénote totalement l'endothélium, le modèle présent ne dénie que partiellement l'aorte. Le dénudement complet de l'endothélium nécessite beaucoup plus de temps à se rétablir et ces animaux subissent les effets d'une blessure pendant une période plus longue.
Ce modèle produit une réponse rapide des VSMC et des EC à une blessure permettant de quantifier les changements morphologiques et biochimiques en une semaine. Il est plus efficace que d'autres modèles qui prennent 14-28 jours avant que l'effet de l'intervention ne soit évident. Ce modèle utilise l'aorte murine qui est le seul vaisseau murin qui se rapproche d'un vaisseau humain cliniquement pertinent. L'avantage significatif de cette technique par rapport à d'autres modèles aortiques est que ce modèle est relativement facile à apprendre et ne nécessite pas d'éq ni coûteux ni difficile à obtenirUps 2 , 3 , 4 , 5 . En conclusion, le modèle de blessure à la crème aortique murine fournit une plate-forme in vivo techniquement simple, peu coûteuse et efficace pour évaluer simultanément la réponse des VSMC et des EC aux blessures vasculaires.
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Disclosures
Ce travail a été financé par le Prix de perfectionnement professionnel du ministère des Anciens Combattants (1IK2BX001553-01) (TSM) et la bourse EJ Wylie Vastery Cures (TSM).
Acknowledgments
Nous remercions Hsia Ru-ching PhD, de l'École Electronique de Microscopie de l'École de Médecine de l'Université de Maryland, pour son soutien technique dans le traitement des échantillons de microscopie électronique à balayage.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ocular lubricant | Dechra | 17033-211-38 | Pharmaceutical agents |
| Isoflurane | VetOne | 502017 | Pharmaceutical agents |
| Carprofen | Zoetis | 26357 | Pharmaceutical agents |
| Precision vaporizer | Summit Medical | 10675 | Surgical supplies |
| Charcoal scavenger | Bickford Inc. | 80120 | Surgical supplies |
| Isothermal pad | Harvard Apparatus | 50-7053-R | Surgical supplies |
| Sterile cotton-tipped applicator | Fisher Scientific | 23-400-124 | Surgical supplies |
| 4-0 absorbable monofilament suture | Ethicon, Inc | J310 | Surgical supplies |
| 5-0 non-absorbable monofilament suture | Ethicon,Inc | 1666 | Surgical supplies |
| 21-gauge x 1 inch needle | BD Biosciences | 305165 | Surgical supplies |
| 25-gauge x 1 inch needle | BD Biosciences | 305125 | Surgical supplies |
| Dry sterilizer | Cellpoint | 7770 | Surgical supplies |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14058-09 | Surgical instruments |
| Adson forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | Surgical instruments |
| Dumont #5 fine forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | Surgical instruments |
| Vannas Spring Scissors 3 mm cutting edge | Fine Science Tools | 15000-00 | Surgical instruments |
| Needle driver | Fine Science Tools | 91201-13 | Surgical instruments |
| Scalpel handle #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | Surgical instruments |
| Scalpel blades #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | Surgical instruments |
| PBS | Lonza | 17-516F | Reagents for tissue processing |
| Evans Blue | Sigma-Aldrich | E2129 | Reagents for tissue processing |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Reagents for tissue processing |
| Modeling wax | Bego | 40001 | Reagents for tissue processing |
| OCT compound | Tissue-Tek Sakura | 4583 | Reagents for tissue processing |
| Mayer's hematoxylin solution | Sigma-Aldrich | MHS16 | Reagents for immunohistological analysis |
| Eosin Y solution alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110316 | Reagents for immunohistological analysis |
| Elastin stain kit | Sigma-Aldrich | HT25A | Reagents for immunohistological analysis |
| Click-it Edu Alexa-488 Imaging Kit | Invitrogen | C10337 | Reagents for immunohistological analysis |
| Anti-Erk1/2 antibody | Cell Signaling Technology | 4695 | Reagents for immunohistological analysis |
| Anti-phospho-Erk1/2 antibody | Cell Signaling Technology | 4370 | Reagents for immunohistological analysis |
| Anti-p27kip1 antibody | Cell Signaling Technology | 3698 | Reagents for immunohistological analysis |
| Trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | T9159 | Reagents for immunohistological analysis |
References
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