Summary
Restenose efter kardiovaskulære procedurer (bypass-kirurgi, angioplastik eller stenting) er et signifikant problem, der reducerer holdbarheden af disse procedurer. En ideel terapi ville inhibere proliferation af glat muskelcelle (VSMC), samtidig med at der fremmes regenerering af endotelet. Vi beskriver en model til samtidig vurdering af VSMC proliferation og endotelfunktion in vivo.
Abstract
Arteriel rekonstruktion, hvad enten det drejer sig om angioplastik eller bypass-kirurgi, involverer iatrogen traume, der forårsager endotelafbrydelse og vasculær glat muskelcelle (VSMC) proliferation. Almindelige murine modeller studerer små fartøjer som carotid og lårarterier. Heri beskriver vi et in vivo system, hvor både VSMC proliferation og endothelial barrierefunktion kan vurderes samtidigt i en stor beholder. Vi undersøgte infrarenal aorta respons på skade hos C57BL / 6 mus. Aorta blev skadet fra venstre renalven til aorta-bifurcationen med 30 transmurale knusninger af 5 sekunder lang varighed med en bomuldsspidsapplikator. Morfologiske ændringer blev vurderet med konventionel histologi. Aorta vægtykkelse blev målt fra luminale overflade til adventitia. EdU-integration og counter-farvning med DAPI og alpha-actin blev anvendt til at demonstrere VSMC proliferation. Aktivering af ERK1 / 2, en kendt moderator for intimal hyperplasi dannelse, blev afskrækketMined ved Western Blot-analyse. Virkningen af inflammation blev bestemt ved immunhistokemi for B-celler, T-celler og makrofager . En ansigtsafsnit af endothel blev visualiseret med scanningselektronmikroskopi (SEM). Endotelbarrierefunktionen blev bestemt med Evans Blue-farvning. Transmural skade resulterede i aorta vægtykkelse. Denne skade inducerede VSMC proliferation mest prominente ved 3 dage efter skade og tidlig aktivering af ERK1 / 2 og nedsat p27 kip1 ekspression. Skader resulterede ikke i forøget B-celler, T-celler eller makrofager infiltration i beholdervæggen. Skader forårsagede delvis endotelcelle denudation og tab af cellecellekontakt. Skader resulterede i et signifikant tab af endotelbarrierefunktionen, som returnerede til baseline efter syv dage. Den murine transmurale stump aorta skadesmodel tilvejebringer et effektivt system til samtidig undersøgelse af både VSMC proliferation og endotelbarrierefunktion i en stor beholder.
Introduction
restenose Følgende kardiovaskulære procedurer (bypass-operation, angioplastik eller stenting) er et signifikant problem, der reducerer holdbarheden af disse procedurer. Alle revaskulariseringsprocedurer er plaget af restenose. Nuværende strategier til forebyggelse af restenose (lægemiddeleluerende stents og lægemiddelcoatede balloner) hæmmer både vaskulær glatmuskelcelle (VSMC) og endotelcelleproliferation (EC). Følgelig forhindrer disse interventioner VSMC-medieret restenose, men forhindrer også regenerering af endotelet. Uden intakt endotel skal patienter være på stærke antiplatelet midler for at mindske risikoen for in situ trombose med risiko for blødningskomplikationer. En ideel terapi ville inhibere VSMC proliferation samtidig med at regenerering af endotelet. Der er således et behov for samtidig undersøgelse af VSMC proliferation og endotelbarrierefunktion i n vivo .
I øjeblikket er der alvorligeAl musemodeller af restenose 1 . Disse modeller indbefatter carotidligering og femoral arterie ledningsskade 2 . Aorta modeller omfatter stent placering 3 , ballon skade 4 og aorta allograft 5 . Alle de nuværende modeller er begrænsede. Carotidligering genererer en strømningsmedieret neointimal læsion og har ikke endotelskader. Derudover har både carotid- og femorale arterier mange gange færre cellelag end humane fartøjer, hvilket begrænser deres translationsværdi. Mus aorta, som er ca. 1,3 mm i diameter, er det eneste skib, der nærmer sig en klinisk relevant (kranset) human arterie (3).
På trods af translationspotentialet hos murine aorta-modeller af sygdom har nuværende modeller begrænsninger. Disse modeller kræver avancerede mikrokirurgiske færdigheder og specialudstyr som angioplastikballoner og stenter. Her præsenterer viEn ny reproducerbar teknik til samtidig at inducere VSMC proliferation og forstyrre endotelbarrierefunktionen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etikerklæring: Protokollerne til dyrehåndtering blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of Maryland (protokol nr. 0416009) og udført i henhold til AAALAC-International standarder.
1. kirurgisk procedure
- Anæstetisk teknik
- Steriliser alle instrumenter, der anvendes til overlevelsekirurgi med dampsterilisering ved 121 ° C i 30 minutter.
- Fremkald anæstesi via en induktionstank med 100% O2 og 2,5% isofluran leveret via præcisionsfordamper. Post-induktion, afbryd isofluran og skyl kammeret med O2. Vedligeholde anæstesi med 1,5-2% isofluran via ansigtsmaske og 1 L / min O 2 ved indånding.
- Fastgør både induktionskammeret og ansigtsmasken til en kulskovler til affaldsgasadsorption for at beskytte personale. Sørg for et passende bedøvelsesplan ved demonstrationAt der ikke er noget svar på skadelige stimuli (tåhinde).
- Opret et operativt felt bestående af en kirurgisk bakke med isotermisk pad for at tilvejebringe termisk støtte under operationen. En yderligere isothermal pad vil give termisk støtte til dyr i deres genoprettelsesbur.
- Dyreforberedelse
- Gennemfør følgende undersøgelse af 10-12 uger gamle C57BL / 6 mus.
- Fjern håret på den ventrale abdominal overflade af dyret fra brysthinden til den inguinale region med et depilator eller en elektrisk klipper med et nummer 40 blad.
- I tilfælde af depilator, påfør denne forbindelse til det kirurgiske område i 2-3 minutter og fjern det med bomuld. Vi bruger en kommercielt tilgængelig forbindelse af calciumhydroxid og natriumhydroxid.
- Klargør området over skulderen med 70% alkohol og injicer subkutant carprofen (5 mg / kg) med en 25 gauge eller mindre boringsnål. Det herBehandling vil give postoperativ analgesi til dyret.
- Overfør dyret til det kirurgiske felt og position i dorsal recumbency.
- Forbered det kirurgiske sted ved at skrubbe 8-12% providone-iod med en ren bomuldsapplikator eller bomuldsgas. Skyl derefter huden to gange med 70% alkohol.
- Placer okulært smøremiddel i begge øjne for at reducere forekomsten af hornhindeudtørring. Dæk det kirurgiske område med en steril drapering.
- Operativ teknik
- Lav et median abdominal laparotomi incision ca. 2-2,5 cm i længden med en skalpels begyndelse umiddelbart caudal xiphoid processen og strækker sig mod bækkenet.
- Mobil tarm og tolvfingertarmen og reflekterer sideværts til højre. Rul op en strimmel steril bomuld gennemblødt og gennemblødt med steril saltvand til injektion for at tillade pakning af indvolde for at forbedre eksponeringen.
- Med tyndtarmen mobiliseret til højre side afMave, udsætte retroperitoneum og udsætte abdominal aorta fra venstre renal ven til aorta bifurcation ( figur 1 ).
- Med en steril bomuldsspids applikator, lever 30 på hinanden følgende knusninger, hver fem sekunders varighed.
- Fjern pakningen og lad indvoldet vende tilbage til deres oprindelige position.
- Luk fascia med en løbende 4-0 absorberbar monofilament sutur (polydioxanon). Hud er lukket med en løbende 6-0 ikke-absorberbar monofilament sutur (nylon).
- Recovery og Post-Procedure Care
- Efter proceduren skal dyret anbringes i et genoprettelsesbur med rent strøelse på en isotermisk pude for at fortsætte termisk støtte, indtil dyret kan ambulere normalt. Forlad ikke dyret uovervåget, indtil det demonstrerer evnen til at opretholde sternal recumbency.
- Overvåg dyret hver time i de første 4 timer efter operationen. Når dyret er ambulerende, vender jeg normalt tilbage T til det tildelte mødestue. Dyret vil ikke blive indkvarteret i selskab med et andet dyr, før det er fuldt ud genoprettet.
- Overvåg dyret to gange dagligt i de første 72 timer efter operationen og mindst 3 gange om ugen derefter. Overvågning omfatter vejer dyret tre gange om ugen.
- Administrer carpofen (5 mg / kg) subkutant to gange dagligt i de første 72 timer efter operationen.
2. Indkøb af væv
- Metoden for eutanasi
- Euthanize dyrene på forudbestemte tidspunkter.
- Fremkald anæstesi via en induktionstank med 100% O2 og 2,5% isofluran leveret via præcisionsfordamper.
- For at studere integriteten af endotelet, administrer Evans Blue farvestof til dyret.
BEMÆRK: Evans Blue er et negativt ladet azofarvestof med høj bindingsaffinitet for albumin og kan kun plette blodkar i fravær af intakt endotheliumS = "xref"> 6. - For endothelial integritetsundersøgelser perfunderer dyrene med 5 ml 0,3% Evans Blue farvestof efterfulgt af 5 ml PBS ved fysiologisk tryk i 5 min. På tidspunktet for eutanasi. Dyret opretholdes i et kirurgisk plan af anæstesi under perfusionsproceduren.
- For at studere integriteten af endotelet, administrer Evans Blue farvestof til dyret.
- Efter at have opnået et dybt anæstetisk plan, skal du åbne brystet med en sternotomi. Lav en laceration i højre atrium for at tillade dræning af blod fra dyret og få adgang til venstre ventrikel tilgås med en 21 G nål og injicer fosfatbufferet saltvand (PBS), indtil udledningen fra højre atrium er tydeligt.
- Efter perfusion med PBS, skal du gå ind i maven gennem et midtlinie snit.
- Endnu en gang mobilisere tyndtarmen til højre side af maven, der udsætter infrarenal aorta, skarpt dissekerer aorta fra tilstødende væv og punkner det fra venstre renalven til aorta bifurcationen.
- Opbevar den udskårne aorta i en 4% paraformaldEhydopløsning indtil vævsbehandling finder sted.
- For endothelial integritet undersøgelser, åbne aorta langsgående og pin det til et voksark, der eksponerer hele luminale overfladen 6 . Udfør en kvalitativ vurdering af endothelial integritet ved graden af farvning med Evans Blue dye 6 .
- For andre histologiske analyser skal du snitte aorta på tværs og indlejre det i forbindelser med optimal skæringstemperatur (OCT) som dikteret af den histologiske metode, der skal anvendes 7 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Transversale sektioner aorta indlejret i OCT blev snittet og farvet med hæmatoxylin og eosin og derefter modfarvet med Verhoeff-Van Gieson (VVG) plet for at identificere det indre og det ydre elastiske laminat 7 . Crush skade fremkaldt aorta vægtykkelse sammenlignet med aortaerne af dyr behandlet med en sham procedure (laparotomi og små tarm mobilisering alene). Vægtykkelse, som vurderet af afstanden fra adventitia til lumen, var størst tre dage efter skade (42,2 ± 1,7 μm vs. 22,1 ± 1,1 μm alene for laparotomi) ( Figur 2A-B ). Skade resulterede i, at cellerne havde et mere afrundet udseende og en uregelmæssig kontur af den luminale overflade ( figur 2C ).
Øget vægtykkelse af den skadede aorta er i det mindste delvist medieret af forøget proliferation af medial vaskulær glat musCle celler. For at bevise, at vægtykkelse skyldes forøget proliferation i modsætning til cellehypertrofi, anvendte vi et EdU proliferationsassay. I dette assay administreres thymidinanalogen 5-ethynyl-2'-deoxyuridin (EdU) intravenøst til musen 24 timer før eutanasi. EdU er inkorporeret i DNA under syntesen. EdU detekteres ved en klikreaktion (kobberkatalyseret azide-alkyncyloaddition ved anvendelse af grøn-fluorescerende farvestof) 8 . Sham mus udsat kun for laparotomi havde ingen observeret fluorescens i et hvilket som helst lag af aorta. Conversley, mus, der blev udsat for aorta-skade, viste fluorescens i både medierne og intima af aorta ( figur 3 ).
Aortisk vægtykkelse efter crush-skade aktiverer cellesignalveje impliceret i restenose hos mennesker. Den mitogenaktiverede proteinkinase (MAP Kinase) ERK1 / 2 er en af de primære mediatorer for intimal hyperplasi dannelseSom reaktion på stimulering fra et mitogen phosphoryleres ERK1 / 2 og aktiveres 9 , 10 . Data fra vores laboratorium har også vist, at den cyclinafhængige kinaseinhibitor p27 kip1 er reduceret som respons på mitogene stimuli i beholdervæggen 12 . Mus blev euthaniseret på 1, 3, 7 dage og 1 måned efter aorta crush skade. Infrarenal aorta blev isoleret og proteinekspression af ERK1 / 2, phospho-ERK1 / 2 (den aktiverede form af ERK1 / 2), og den cyclinafhængige kinaseinhibitor p27 kip1 blev bestemt ved Western blot-analyse ( Figur 4A ). Der blev ikke observeret nogen ændring i total ERK1 / 2 proteinekspression over tid. Imidlertid var phospho-ERK1 / 2 (Pi-ERK1 / 2) tre dage efter skade over 200% større end baseline Pi-ERK1 / 2-ekspression. P27 kip1- ekspression faldt ved tidlige tidspunkter og nåede en nadir på ca. 20% af basislinjen syv dage afTer skade. Både Pi-ERK1 / 2 og p27 kip1 ekspression tilnærmede baseline niveauer en måned efter skade ( figur 4B ). Således er den observerede fortykning af aortavæggen i det mindste delvist på grund af forøget medial proliferation.
Aortic injury model muliggør samtidig vurdering af både medial glat muskel proliferation og endotel barriere funktion. Scanningelektronmikroskopi (SEM) blev brugt til at karakterisere effekten af crush-skaden på endotelets morfologi. Aortalens luminale overflade er foret med et sammenflytende endotel, som forhindrer vedhæftning af blodfødte celler og molekyler ( Figur 5A , Skalestang = 100 μm). I modsætning hertil resulterer knuseskader i afbrydelse af endotelceller og delvis denudation af endotelet ( Figur 5B , Scale bar = 100 μm). Som set ved højere forstørrelse resulterer afbrydelse af endotelet i adhæsionPå partikler i overensstemmelse med størrelse og form med blodplader. Adhæsion af disse partikler forekommer i hele skadeområdet, og er ikke begrænset til områder med brutal denudation observeret ved lavere forstørrelse ( figur 5C , skala bar = 50 μm). Morfologien af den klæbende partikel observeres bedst ved højere forstørrelse. Disse partikler er i overensstemmelse med blodplader og fibrin ( Figur 5D , Scale bar = 10 μm).
Udover endotelmorfologi kan endotelets barrierefunktion vurderes med denne model af vaskulær skade. Azo-farvestoffet Evans Blue kan ikke gennemsyre det normale, intakte endotel i den murale aorta. Skader på barrierefunktionen i endotelet muliggør farvning af kældermembranen med Evans Blue. Mus behandlet til en laparotomi alene (sham) opretholdt barrierefunktionen af endotelet, og disse aorta var hvide. Crush skade resulterede i aDiffus tab af endotelbarrierefunktion og disse aorta farvede mørkeblå. Intensiteten af farvning med Evans Blue blev reduceret tre dage efter crush-skade, og fuld barrierefunktion blev genoprettet i uge efter skade ( figur 6A ). Endotelbarrierefunktionen kan yderligere kvantificeres ved at veje prøverne og homogenisere i 10 gange volumen 50% trichloreddikesyreopløsning. Fortynding af supernatanten i 4 gange ethanol tillader bestemmelse af fluorescensintensitet (excitation 620 nm og emission 680 nm) som beskrevet af Aoki et al . 11 . Mængden af Evans Blue elueret fra infrarenal aorta var over tre gange højere i aorta umiddelbart efter skade sammenlignet med aorta udsat for laparotomi (Skadet - Dag 0). Aorta fortsatte med at plette med Evans Blue på en og tre dage efter skade, men mindre intenst end på tidspunktet for skade, hvilket tyder på en gradvis genopretning af endotelbarrierefunktionen. En uge aftEr skade den skadede aorta havde ækvivalent farvning som en aorta behandlet med laparotomi alene ( figur 6B ).
Figur 1: Skader er skabt ved at knuse Aorta fra venstre venet til aortabifurcationen. Figur tilpasset med tilladelse fra Yu et al ., PLoS One 2015 12 . Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Crush Injury inducerer Aortic Wall Thickening. ( A ) Crush skade fremkaldte morfologiske ændringer i aorta. Repræsentative 5 μm tværsnit blev farvet med VVG ved 0,1, 3 og 7 dage efter skade. Skalestænger = 100 μm. ( B ) Vægtykkelsen var størst 3 dage efter skade, 42,2 ± 1,7 μm, og var signifikant større end aortaen af skamdyr, der blev udsat for laparotomi alene, 22,1 ± 1,1 μm. Statistisk betydning blev bestemt med Studentens tohale t-test. * Angiver p <0,05, n = 3. ( C ) Crush-skade forårsagede et afrundet udseende af mediale VSMC'er (farvet i grønt for a-glat muskelaktin) og ændret celleorientering. Nuclei blev modstreget med DAPI (Blue). Skalestænger = 10 μm. Data præsenteres som middel og standardafvigelser. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Crush Injury inducerer Cell ProlifeRation i Aortic-væggen. Mus blev udsat for enten laparotomi alene (sham) eller laparotomi med aorta crush skade. Thymidinanalog 5-ethynyl-2'-deoxyuridin (EdU) blev indgivet 24 timer forud for eutanasi. EdU er inkorporeret i DNA under syntesen. EdU detekteres ved en klikreaktion (kobberkatalyseret azidalkyncyloaddition ved anvendelse af grøn-fluorescerende farvestof). Der var ingen påviselig EdU (grøn) i aorta-væggen hos skamdyrene. I dyrene, der blev udsat for crush skade, farvede EdU fremtrædende i aorta-medierne og i en mindre grad i intima. Vaskulære glatte muskelceller blev identificeret ved farvning med a-glat muskelactinantistof (rødt). Dette fund antyder, at den observerede vægtykkelse observeret i figur 2 skyldes en stigning i celleproliferation. Skalestænger = 10 μm. Klik her for at se en større version af dette figure.
Figur 4: Den Mitogen-aktiverede Proteinkinase (MAP Kinase) Pathway er aktiveret som reaktion på Crush Injury. ( A ) MAP-kinasen ERK1 / 2 phosphoryleres, når den aktiveres, og er forbundet med intimal hyperplasi og restenose. Mus blev euthaniseret på 1, 3, 7 dage og 1 måned efter aorta crush skade. Western blot-analyse blev anvendt til at vurdere proteinekspression af det totale ERK1 / 2, phospho-ERK1 / 2 og den cyclinafhængige kinaseinhibitor p27 kip1 . Proteinekspression blev normaliseret til et sham-dyr behandlet med laparotomi alene. ( B ) Der blev ikke observeret nogen ændring i total ERK1 / 2 proteinekspression over tid. Imidlertid var phospho-ERK1 / 2 (Pi-ERK1 / 2) tre dage efter skade over 200% større end baseline Pi-ERK1 / 2-ekspression. P27 kip1 ekspression faldt ved tidlige tidspunkter anD nåede en nadir på ca. 20% af baseline syv dage efter skade. Både Pi-ERK1 / 2 og p27 kip1- ekspressionen tilnærmede baseline niveauer en måned efter skade. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5. Crush Injury forstyrrer aorta endotelceller. ( A ) Scanningelektronmikroskopi (SEM) blev anvendt til at karakterisere effekten af crush-skaden på endotelets morfologi. Den luminale overflade af den normale aorta er foret med et sammenflytende endotel, som forhindrer vedhæftning af blodfødte celler og molekyler. ( B ) Crush skade resulterer i forstyrrelsen af endotelceller og delvis denudation af endotelet. ( C ) Som set ved højere magnificaAfbrydelse af endotelet resulterer i adhæsion af partikler i overensstemmelse med størrelse og form med blodplader. Adhæsion af disse partikler forekommer gennem hele skadezonen, og er ikke begrænset til områder med brutal denudation observeret ved lavere forstørrelse. ( D ) Ved højere forstørrelse er disse partikler konsistente med blodplader og fibrin. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Blunt Aortic Injury Tillader kvantificering af Endothelial Barrier Function. ( A ) Skader på barrierefunktionen i endotelet muliggør farvning af kældermembranen med Evans Blue-farvestof. Mus behandlet til en laparotomi alene (sham) opretholdt barrierefunktionen af endotelet og thEse aorta var hvide. Crush skade resulterede i et diffust tab af endotel barriere funktion og disse aortas farvede mørkeblå. Intensiteten af farvning med Evans Blue blev reduceret tre dage efter crush-skade, og fuld barrierefunktion blev genoprettet i uge efter skade. ( B ) Binding af Evans Blue til infrarenal aorta blev kvantificeret ved at eluere Evans Blue fra prøven og kvantificering ved fluorescensintensitet. Data præsenteres som middel og standardafvigelser. Den mest Evans Blue blev elueret fra aorta umiddelbart efter crush skade. På tidspunktet for skaden bundet aorta tre gange gange mere Evans Blue end aorta alene underkastet laparotomi. Da aorta fik lov til at komme sig tilbage, var der mindre bindende en og tre dage efter skade. En uge efter skaden bundet aortaen samme mængde Evans Blue som aortaene underkastet laparotomi alene. Statistisk betydning blev bestemt med Studentens tohale t-test. * DeNoter p <0,05, n = 3, NS angiver ikke signifikant. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har karakteriseret virkningerne af en murin aorta skadesmodel, der resulterer i medial hyperplasi og endotel barriere dysfunktion. Delvis EC-frigørelse langs aorta-intima ledsaget af tabet af cellecellekontakt og forbedring af cellefremspring. Tilsvarende var endotelbarrierefunktionen signifikant svækket, hvilket stimulerede de mitogenfølsomme signaleringsveje, hvilket førte til proliferation af VSMC'er og fortykkelse af beholdervæggen. Styrken i denne model er, at det er teknisk lettere at lære og udføre end andre aorta-modeller af sygdom og muliggør samtidig vurdering af både det proliferative respons på skade og endotelfunktion. Det kritiske trin i denne protokol er den faktiske crush skade. Variabilitet i omfanget af crush skade kan resultere i varierende grader af skade og dermed variable mængder af glat muskelcelle proliferation. Et trin der reducerer denne variabilitet i vores laboratorium er at have en sCientist, blinde til behandling eller eksperimentelle tilstand, udføre alle de crush skader.
En begrænsning af denne model er dens generalisering af klinisk relevante humane sygdomsprocesser. På trods af den tidlige robuste proliferative respons af VSMC'er i denne model, modellerer den ikke de senere begivenheder af restenose, dvs. ingen neointima udviklet. Reducerede inflammatoriske mediatorer som cytokiner kan regulere denne proces. Denne konklusion kunne skyldes den hurtige genopretning af endotelet fra en partiel skade. I lighed med en tidligere rapporteret vaskulær crush injury model i kaniner 13 var infiltrering af immunceller mindre. I den foreliggende undersøgelse vurderede vi profilen af inflammatoriske cytokiner til skamdyr og aorta skader dyr med profiler array. Der var imidlertid ingen signifikant forskel i cytokinprofilen, der ville forklare forskellen i det proliferative respons mellem skam og skadede dyr (dataikke vist). Skaden beskrevet i den foreliggende rapport er midlertidigt begrænset. Mens andre modeller af aorta-skade og intimal hyperplasi, såsom aorta-angioplastikmodellen, udelukker fuldstændigt endotelet, den nuværende model udelukker kun delvis aorta. Komplet denudation af endotelet kræver betydeligt længere tid at komme sig, og disse dyr oplever virkningerne af skade i længere tid.
Denne model frembringer et hurtigt respons af VSMC'er og EC'er til skade, der tillader kvantificering af morfologiske og biokemiske ændringer på en uge. Det er mere effektivt end andre modeller, der tager 14-28 dage, før virkningen af intervention er tydelig. Denne model bruger den murine aorta, som er den eneste murine beholder, der nærmer sig et klinisk relevant menneskefartøj. Den væsentlige fordel ved denne teknik sammenlignet med andre aortamodeller er, at denne model er forholdsvis let at lære og ikke kræver dyrt eller svært at opnå eqUipment 2 , 3 , 4 , 5 . Som konklusion tilvejebringer den murine aorta-crush-skadesmodel en teknisk simpel, billig, effektiv in vivo platform for samtidig evaluering af responsen af VSMC'er og EC'er til vaskulær skade.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dette arbejde blev finansieret af Department of Veterans Affairs Karriereudvikling Award (1IK2BX001553-01) (TSM) og Vascular Cures EJ Wylie Scholarship (TSM).
Acknowledgments
Vi takker Hsia Ru-ching Ph.D., fra Electron Microscopy Core Facility ved University of Maryland School of Medicine, for hendes tekniske support til behandling af scanning elektroniske mikroskopi prøver.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ocular lubricant | Dechra | 17033-211-38 | Pharmaceutical agents |
| Isoflurane | VetOne | 502017 | Pharmaceutical agents |
| Carprofen | Zoetis | 26357 | Pharmaceutical agents |
| Precision vaporizer | Summit Medical | 10675 | Surgical supplies |
| Charcoal scavenger | Bickford Inc. | 80120 | Surgical supplies |
| Isothermal pad | Harvard Apparatus | 50-7053-R | Surgical supplies |
| Sterile cotton-tipped applicator | Fisher Scientific | 23-400-124 | Surgical supplies |
| 4-0 absorbable monofilament suture | Ethicon, Inc | J310 | Surgical supplies |
| 5-0 non-absorbable monofilament suture | Ethicon,Inc | 1666 | Surgical supplies |
| 21-gauge x 1 inch needle | BD Biosciences | 305165 | Surgical supplies |
| 25-gauge x 1 inch needle | BD Biosciences | 305125 | Surgical supplies |
| Dry sterilizer | Cellpoint | 7770 | Surgical supplies |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14058-09 | Surgical instruments |
| Adson forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | Surgical instruments |
| Dumont #5 fine forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | Surgical instruments |
| Vannas Spring Scissors 3 mm cutting edge | Fine Science Tools | 15000-00 | Surgical instruments |
| Needle driver | Fine Science Tools | 91201-13 | Surgical instruments |
| Scalpel handle #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | Surgical instruments |
| Scalpel blades #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | Surgical instruments |
| PBS | Lonza | 17-516F | Reagents for tissue processing |
| Evans Blue | Sigma-Aldrich | E2129 | Reagents for tissue processing |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Reagents for tissue processing |
| Modeling wax | Bego | 40001 | Reagents for tissue processing |
| OCT compound | Tissue-Tek Sakura | 4583 | Reagents for tissue processing |
| Mayer's hematoxylin solution | Sigma-Aldrich | MHS16 | Reagents for immunohistological analysis |
| Eosin Y solution alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110316 | Reagents for immunohistological analysis |
| Elastin stain kit | Sigma-Aldrich | HT25A | Reagents for immunohistological analysis |
| Click-it Edu Alexa-488 Imaging Kit | Invitrogen | C10337 | Reagents for immunohistological analysis |
| Anti-Erk1/2 antibody | Cell Signaling Technology | 4695 | Reagents for immunohistological analysis |
| Anti-phospho-Erk1/2 antibody | Cell Signaling Technology | 4370 | Reagents for immunohistological analysis |
| Anti-p27kip1 antibody | Cell Signaling Technology | 3698 | Reagents for immunohistological analysis |
| Trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | T9159 | Reagents for immunohistological analysis |
References
- Carmeliet, P.
- Carmeliet, P., Moons, L., Collen, D. Mouse models of angiogenesis, arterial stenosis, atherosclerosis and hemostasis. Cardiovasc Res. 39 (1), 8-33 (1998).
- Baker, A. B., et al. Heparanase Alters Arterial Structure, Mechanics, and Repair Following Endovascular Stenting in Mice. Circ Res. 104 (3), 380-387 (2009).
- Petrov, L., Laurila, H., Hayry, P., Vamvakopoulos, J. E. A mouse model of aortic angioplasty for genomic studies of neointimal hyperplasia. J Vasc Res. 42 (4), 292-300 (2005).
- Li, J., et al. Vascular smooth muscle cells of recipient origin mediate intimal expansion after aortic allotransplantation in mice. Am J Path. 158 (6), 1943-1947 (2001).
- Radu, M., Chernoff, J. An in vivo assay to test blood vessel permeability. J Vis Exp. (73), e50062 (2013).
- Turbett, G. R., Sellner, L. N. The use of optimal cutting temperature compound can inhibit amplification by polymerase chain reaction. Diagn Mol Pathol. 6 (5), 298-303 (1997).
- Puchtler, H., Waldrop, F. S. On the mechanism of Verhoeff's elastica stain: a convenient stain for myelin sheaths. Histochem. 62 (3), 233-247 (1979).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- Nelson, P. R., Yamamura, S., Mureebe, L., Itoh, H., Kent, K. C. Smooth muscle cell migration and proliferation are mediated by distinct phases of activation of the intracellular messenger mitogen-activated protein kinase. J Vasc Surg. 27 (1), 117-125 (1998).
- Rzucidlo, E. M. Signaling pathways regulating vascular smooth muscle cell differentiation. Vascular. 17, Suppl 1. S15-S20 (2009).
- Aoki, T., Sumii, T., Mori, T., Wang, X., Lo, E. H. Blood-brain barrier disruption and matrix metalloproteinase-9 expression during reperfusion injury: mechanical versus embolic focal ischemia in spontaneously hypertensive rats. Stroke. 33 (11), 2711-2717 (2002).
- Yu, D., et al. MARCKS Signaling Differentially Regulates Vascular Smooth Muscle and Endothelial Cell Proliferation through a KIS-, p27kip1- Dependent Mechanism. PLoS One. 10 (11), e0141397 (2015).
- Banai, S., et al. Rabbit ear model of injury-induced arterial smooth-muscle cell-proliferation - kinetics, reproducibility, and implications. Circ Res. 69 (3), 748-756 (1991).
