Summary
心血管手术后的再狭窄（旁路手术，血管成形术或支架置入术）是降低这些手术的耐久性的重大问题。理想的治疗方法是抑制平滑肌细胞（VSMC）的增殖，同时促进内皮的再生。我们描述了同时评估体内VSMC增殖和内皮功能的模型。
Abstract
动脉重建，无论是血管成形术还是旁路手术，都涉及医源性创伤，引起内皮细胞破裂和血管平滑肌细胞（VSMC）增殖。常见的小鼠模型研究小血管如颈动脉和股动脉。这里我们描述一种体内系统，其中VSMC增殖和内皮屏障功能可以在大型血管中同时进行评估。我们研究了C57BL / 6小鼠肾下主动脉对损伤的反应。主动脉从左肾静脉到主动脉分叉，用棉花头施放器以5秒持续时间进行30次透壁压迫。用常规组织学评估形态学变化。从腔表面到外膜测量主动脉壁厚度。用DAPI和α-肌动蛋白进行EdU整合和反染色以证明VSMC增殖。激活ERK1 / 2，一种已知的内膜增生形成调节剂是阻止的由Western Blot分析开采。通过B细胞，T细胞和巨噬细胞的免疫组织化学测定炎症的作用。用扫描电子显微镜（SEM）观察内皮的内表面部分。用伊文思蓝染色测定内皮屏障功能。透壁性损伤导致主动脉壁增厚。这种损伤引起VSMC增殖，损伤后3天最突出，ERK1 / 2的早期激活和p27 kip1表达降低。损伤不会导致血管壁中增加的B细胞，T细胞或巨噬细胞浸润。损伤导致部分内皮细胞剥蚀和细胞 - 细胞接触丧失。损伤导致内皮屏障功能的显着损失，七天后恢复到基线。小鼠透壁性钝性主动脉损伤模型提供了一种同时研究大血管中VSMC增殖和内皮屏障功能的有效系统。
Introduction
再狭窄 遵循心血管手术（旁路手术，血管成形术或支架置入术）是降低这些手术的耐久性的重大问题。所有血运重建手术都受到再狭窄的困扰。目前防止再狭窄的策略（药物洗脱支架和药物包衣球囊）抑制血管平滑肌细胞（VSMC）和内皮细胞增殖（EC）。因此，这些干预措施可以预防VSMC介导的再狭窄，而且可以防止内皮细胞的再生。没有完整的内皮，患者需要使用有效的抗血小板药物，以降低出血并发症风险的原位血栓形成的风险。理想的治疗方法是抑制VSMC增殖，同时促进内皮再生。因此，需要同时研究VSMC增殖和内皮屏障功能。
目前来看，再狭窄的小鼠模型1 。这些模型包括颈动脉结扎和股动脉线损伤2 。主动脉模型包括支架置入3 ，球囊损伤4和主动脉同种异体移植5 。所有目前的型号都是有限的。颈动脉结扎产生流动介导的新生内膜损伤并且不具有内皮损伤。此外，颈动脉和股动脉与人血管相比，细胞层的折叠多少，限制了它们的平移值。直径约1.3毫米的小鼠主动脉是接近临床相关（冠状动脉）人动脉（3）的唯一血管。
尽管鼠主动脉疾病模型具有翻译潜力，但目前的模型有局限性。这些模型需要先进的显微外科技术和专门的设备，如血管成形术气球和支架。在这里，我们现在一种新颖的，可重复的技术，以同时诱导VSMC增殖并破坏内皮屏障功能。
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Protocol
道德声明：动物处理方案由马里兰大学机构动物保护和使用委员会（IACUC）批准（协议号0416009），并按照AAALAC-International标准进行。
手术程序
- 麻醉技术
- 在121°C蒸汽灭菌30分钟后，将所有用于生存手术的仪器灭菌。
- 通过经精密蒸发器输送的100％O 2和2.5％异氟烷的感应箱诱导麻醉。后感应，中止异氟烷并用O 2冲洗室。 通过面罩和吸入1 L / min O 2维持1.5-2％异氟烷麻醉。
- 将诱导室和面罩连接到用于废气吸附的炭清除剂中，以保护人员。通过证明确保充足的麻醉机表示没有对有毒刺激（脚趾捏）的反应。
- 创建由具有等温垫的手术托盘组成的手术区域，以在手术期间提供热支撑。额外的等温垫将为其恢复笼中的动物提供热支持。
- 动物准备
- 对10-12周龄的雄性C57BL / 6小鼠进行以下调查。
- 用脱毛剂或具有40号刀片的电动剪刀从头骨上取下动物腹侧腹部的头发至腹股沟区域。
- 在脱毛剂的情况下，将该化合物施用于手术区2-3分钟，然后用棉花去除。我们使用市售的氢氧化钙和氢氧化钠的化合物。
- 用70％酒精制备肩膀上的区域，并用25号或更小的针孔皮下注射卡洛芬（5 mg / kg）。这个治疗将为动物提供术后止痛。
- 将动物转移到外科手术区域，并且位于背侧卧位。
- 用干净的棉花涂布器或棉纱布擦洗8-12％的碘 - 碘来准备手术部位。然后用70％酒精冲洗皮肤两次。
- 在双眼中放置眼部润滑剂以减少角膜干燥的发生率。用无菌悬垂覆盖手术部位。
- 操作技术
- 做一个中间腹部剖腹手术切口大约2-2.5厘米长度与手术刀开始立即尾端剑突过程并延伸到骨盆。
- 调动小肠和十二指肠，并向右侧向反射。卷起一条无菌棉布，并用无菌盐水进行注射，以便包装内脏以改善暴露。
- 随着小肠动员到右侧腹部暴露后腹膜并将腹主动脉从左肾静脉暴露于主动脉分叉（ 图1 ）。
- 使用无菌棉花涂抹器，每次持续5秒，连续进行粉碎30次。
- 取出包装，并允许内脏返回原来的位置。
- 使用运行中的4-0可吸收单丝缝合（聚二恶烷酮）封闭筋膜。用运行中的6-0不可吸收的单丝缝合线（尼龙）封闭皮肤。
- 恢复和后期护理
- 在手术之后，将动物置于具有干净的床垫的恢复笼中，以等温垫以继续热支持，直到动物能够正常行走。不要让动物无人看管，直到它显示出维持胸骨躺卧的能力。
- 术后第4 h每小时监测动物。一旦动物正在行走正常返回我到指定的畜牧室。在完全恢复之前，动物不会被安置在另一只动物的公司内。
- 在手术后的第一个72小时内每天监测动物两次，每周至少3次。监测包括每周三次称重动物。
- 皮下注射卡波芬（5 mg / kg），术后第一个72 h，每日两次。
2.采购组织
- 安乐死方法
- 在预定的时间点安乐死动物。
- 通过经精密蒸发器输送的100％O 2和2.5％异氟烷的感应箱诱导麻醉。
- 研究内皮细胞的完整性，将伊文思蓝染料给予动物。
注意：Evans Blue是一种带负电荷的偶氮染料，对白蛋白具有很高的结合亲和力，只能在没有完整内皮的情况下染色血管s =“xref”> 6。 - 对于内皮完整性研究，在安乐死时，用5 mL 0.3％伊文思蓝染料，然后用生理压力5 mL PBS灌注动物5 min。在灌注过程中，将动物维持在麻醉手术平面中。
- 研究内皮细胞的完整性，将伊文思蓝染料给予动物。
- 达到深度麻醉平面后，用胸骨切开术打开胸部。在右心房撕裂以允许从动物排出血液，并用21G针头进入左心室，并注射磷酸盐缓冲盐水（PBS），直到来自右心房的流出物清除。
- 用PBS灌注后，通过中线切口进入腹部。
- 再次，将小肠移动到暴露肾下主动脉的腹部右侧，从相邻组织中急剧解剖主动脉，并将其从左肾静脉切除至主动脉分叉。
- 将切除的主动脉存放在4％的多形态中直到组织处理发生。
- 对于内皮完整性研究，纵向打开主动脉并将其固定到暴露整个管腔表面6的蜡片上。用Evans Blue染料6进行染色程度，对内皮完整性进行定性评估。
- 对于其他组织学检查，横断面主动脉，并将其嵌入最佳切割温度（OCT）化合物中，如所使用的组织学方法所决定。
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Representative Results
切片嵌入OCT的横断面主动脉切片，用苏木精和伊红染色，然后用Verhoeff-Van Gieson（VVG）染色法染色，鉴定内外弹性片7 。与用假手术治疗的动物的主动脉相比，剖腹术和单独的小肠动员相比，粉碎性损伤导致主动脉壁增厚。损伤后3天（42.2±1.7μm，单独用于剖腹手术时为22.1±1.1μm），外膜厚度与外膜距离为止（ 图2A-B ）。损伤导致细胞具有更圆的外观和腔表面的不规则轮廓（ 图2C ）。
损伤的主动脉增加的壁增厚至少部分地由内侧血管平滑肌增生的增加介导cle细胞。为了证明壁增厚是由于与细胞肥大相反的增殖增加，我们使用了EdU增殖试验。在该测定中，在安乐死前24小时静脉内给予胸苷类似物5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）。合成期间将EdU并入DNA。通过点击反应（铜催化的使用绿色荧光染料的叠氮化物 - 炔环加成） 8来检测EdU。仅暴露于剖腹手术的假小鼠在主动脉的任何层中均未观察到荧光。 Conversley，经受主动脉损伤的小鼠在主动脉的介质和内膜中均显示出荧光（ 图3 ）。
粉碎性损伤后主动脉壁增厚激活与人类再狭窄相关的细胞信号通路。丝裂原活化蛋白激酶（MAP激酶）ERK1 / 2是内膜增生形成的主要介质之一响应于有丝分裂原的刺激，ERK1 / 2被磷酸化并激活9,10 。我们实验室的数据也证明，细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p27 kip1在血管壁12的促有丝分裂刺激反应中减少。在主动脉夹层损伤后1,3,7天和1个月，将小鼠安乐死。分离肾下主动脉，通过蛋白质印迹分析确定ERK1 / 2，磷酸化ERK1 / 2（ERK1 / 2的活化形式）和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p27 kip1的蛋白表达（ 图4A ）。总ERK1 / 2蛋白表达随时间推移无变化。然而，损伤后3天，磷酸化ERK1 / 2（Pi-ERK1 / 2）表达比基线Pi-ERK1 / 2表达大超过200％。 p27 kip1表达在早期时间点下降，并且达到基线7天的约20％的最低点三伤Pi-ERK1 / 2和p27 kip1表达在损伤后一个月接近基线水平（ 图4B ）。因此观察到的主动脉壁增厚至少部分是由于内侧增生增加。
主动脉损伤模型允许同时评估内侧平滑肌增生和内皮屏障功能。扫描电子显微镜（SEM）用于表征挤压损伤对内皮形态的影响。主动脉的腔表面由汇合的内皮衬里，防止血液细胞和分子的粘附（ 图5A ，Scale bar =100μm）。相比之下，挤压伤害导致内皮细胞破裂和内皮部分剥蚀（ 图5B ，Scale bar = 100μm）。如在较高放大倍率下所见，内皮的破坏导致粘连对粒子尺寸和形状与血小板一致。这些颗粒的粘附性发生在整个损伤区域，并不限于在较低放大倍率下观察到的总剥蚀区域（ 图5C ，Scale bar =50μm）。粘附颗粒的形态最好在较高的放大倍数下观察。这些颗粒与血小板和纤维蛋白一致（ 图5D ，Scale bar =10μm）。
除了内皮形态外，还可以用这种血管损伤模型来评估内皮的屏障功能。偶氮染料伊文思蓝不能渗透到正常的，完整的鼠主动脉内皮。对内皮的屏障功能的损害允许用Evans Blue染色基底膜。单独进行剖腹术（假手术）的小鼠维持内皮的屏障功能，这些主动脉为白色。粉碎伤害导致a内皮屏障功能弥漫性丧失，这些主动脉染色深蓝色。粉碎伤后3天，伊文思蓝染色强度降低，损伤后一周恢复完全屏障功能（ 图6A ）。可以通过称重样品并在10倍体积的50％三氯乙酸溶液中匀浆来进一步定量内皮屏障功能。在4倍乙醇中稀释上清液允许测定荧光强度（激发620nm和发射680nm），如Aoki 等人所述。 11 。与仅进行剖腹术的主动脉（受伤 - 第0天）相比，从肾下主动脉溶出的伊文思蓝的量在损伤后立即主动脉高3倍以上。主动脉在损伤后一天和三天继续染色伊文思蓝，但与损伤时相比不太强烈，表明内皮屏障功能逐渐恢复。一个星期后呃损伤的主动脉作为单独用剖腹手术治疗的主动脉具有相当的染色（ 图6B ）。
图1：通过将主动脉从左肾静脉直接破碎到主动脉分叉来创建损伤。图适应于Yu 等人 ， PLoS One 2015 12的许可。 请点击此处查看此图的较大版本。
图2：粉碎损伤引起主动脉壁增厚。 （ A ）粉碎性损伤引起主动脉形态变化。代表性的5μm横截面用0V的VVG染色，损伤后1,3,7天。刻度棒=100μm。 （ B ）损伤后3天的壁厚最大值为42.2±1.7μm，明显大于单独接受剖腹手术的假手术主动脉22.1±1.1μm。统计学意义用学生的双尾t检验确定。 *表示p <0.05，n = 3.（ C ）粉碎性损伤引起内侧VSMC的圆滑外观（α-平滑肌肌动蛋白以绿色染色）并改变细胞取向。核用DAPI（蓝色）复染色。刻度棒=10μm。数据以平均值和标准偏差表示。 请点击此处查看此图的较大版本。
图3：粉碎伤害引起细胞生存主动脉壁的配给。暴露于单独的剖腹手术（假手术）或主动脉夹层损伤的剖腹手术。在安乐死前24小时给予胸苷类似物5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）。合成期间将EdU并入DNA。通过点击反应（铜催化的使用绿色荧光染料的叠氮化物 - 炔炔环加成）检测到EdU。在假动物的主动脉壁中没有可检测的EdU（绿色）。在受到挤压损伤的动物中，EdU在主动脉的介质中显着地染色，并且在内膜中稍微程度上染色。通过用α-平滑肌肌动蛋白抗体（红色）染色鉴定血管平滑肌细胞。这一发现表明，图2中观察到的观察到的壁增厚是由于细胞增殖的增加。刻度棒=10μm。 请点击这里查看此图片的较大版本即
图4：有丝分裂原激活的蛋白激酶（MAP激酶）途径被激活以应对粉碎损伤。 （ A ）MAP激酶ERK1 / 2在被激活时被磷酸化并与内膜增生和再狭窄有关。在主动脉夹层损伤后1,3,7天和1个月，将小鼠安乐死。蛋白质印迹分析用于评估总ERK1 / 2，磷酸化ERK1 / 2和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p27 kip1的蛋白表达。将蛋白质表达标准化为仅用剖腹手术治疗的假手术。 （ B ）总ERK1 / 2蛋白表达随时间推移无变化。然而，损伤后3天，磷酸化ERK1 / 2（Pi-ERK1 / 2）表达比基线Pi-ERK1 / 2表达大超过200％。 p27 kip1表达在早期时间点下降损伤后7天达到基线约20％的最低点。 Pi-ERK1 / 2和p27 kip1表达在损伤后一个月接近基线水平。 请点击此处查看此图的较大版本。
图5.粉碎性损伤破坏主动脉内皮细胞。 （ A ）扫描电子显微镜（SEM）用于表征挤压损伤对内皮形态的影响。正常主动脉的腔表面由汇合的内皮衬里，其防止血液细胞和分子的粘附。 （ B ）粉碎伤害导致内皮细胞的破裂和内皮的部分剥蚀。 （ C ）从较高的宏观看内皮的破裂导致颗粒与血小板在尺寸和形状上的粘附。这些颗粒的粘附性发生在整个损伤区域，并不限于在较低放大倍数下观察到的总剥蚀区域。 （ D ）在较高放大倍数下，这些颗粒与血小板和纤维蛋白一致。 请点击此处查看此图的较大版本。
图6：钝性主动脉损伤允许定量内皮屏障功能。 （ A ）对内皮的屏障功能的损害允许用伊文思蓝染料染色基底膜。单独进行剖腹术（假手术）的小鼠维持内皮和第三天的屏障功能ese主动脉是白色的。粉碎伤害导致内皮屏障功能的弥漫性丧失，并且这些主动脉被染成深蓝色。粉碎伤后3天，伊文思蓝染色强度降低，损伤后一周恢复完全屏障功能。 （ B ）通过从样品中洗脱伊文思蓝并通过荧光强度定量，定量伊文思蓝与肾下主动脉的结合。数据以平均值和标准偏差表示。最大的伊文思蓝在挤压伤后立即从主动脉中洗脱出来。在受伤时，主动脉比单独进行剖腹手术的主动脉更多的是伊万斯蓝三倍以上。由于主动脉被允许恢复，损伤后一天和三天的绑定较少。损伤后一周，主动脉与单独进行剖腹手术的主动脉相同数量的伊文思蓝。统计学意义用学生的双尾t检验确定。 * de注意p <0.05，n = 3，NS表示不重要。 请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
我们已经描述了导致内侧增生和内皮屏障功能障碍的鼠主动脉损伤模型的影响。沿主动脉内膜的部分EC分离伴随细胞细胞接触的丧失和细胞突起的增强。相应地，内皮屏障功能受到显着损害，刺激了丝裂原敏感信号传导途径，导致VSMC的增殖和血管壁的增厚。这种模式的优点是在技术上比其他主动脉疾病模型更容易学习和执行，并允许同时评估对损伤和内皮功能的增殖反应。该协议的关键步骤是实际的挤压伤害。挤压损伤程度的变化可能导致不同程度的损伤，从而导致平滑肌细胞增殖的变化。减少我们实验室变异性的一个步骤是有一个科学家，对治疗或实验条件蒙蔽，执行所有的挤压伤害。
这种模式的局限性是其对临床相关的人类疾病过程的可推广性。尽管VSMCs在该模型中早期具有强烈的增殖反应，但并不模拟再狭窄的晚期事件，即没有新内膜发育。减少的炎症介质如细胞因子可能调节这一过程。这一发现可能是由于部分损伤使内皮迅速恢复。类似于以前报道的兔子13中的血管挤压损伤模型，免疫细胞的浸润是轻微的。在本次调查中，我们评估了具有分析器阵列的假动物和主动脉损伤动物的炎性细胞因子的概况。然而，在细胞因子谱中没有显着差异，这将解释假手术和受损动物之间的增殖反应的差异（数据未示出）。本报告描述的伤害在时间上是有限的。而主动脉损伤和内膜增生如主动脉瓣成形术模型的其他模型完全剥夺了内皮，本模型仅部分剥夺主动脉。完全剥离内皮需要更长的恢复时间，并且这些动物经受较长时间的损伤影响。
该模型产生VSMCs和ECs对损伤的快速反应，允许在一周内定量形态和生物化学变化。在干预效果明显之前14-28天，其他型号的效率更高。该模型使用鼠动物，它是唯一接近临床相关人类血管的鼠血管。与其他主动脉模型相比，该技术的显着优点是该模型相对容易学习，并且不需要昂贵或难以获得eq设备2，3，4，5。总之，小鼠主动脉夹层损伤模型提供了技术上直接，便宜，有效的体内平台，以同时评估VSMC和EC对血管损伤的反应。
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Disclosures
这项工作由退伍军人事务部职业发展部（1IK2BX001553-01）（TSM）和Vascular Cures EJ Wylie奖学金（TSM）资助。
Acknowledgments
我们感谢马里兰大学医学院电子显微镜核心设备的谢汝清博士在技术支持下处理扫描电子显微镜样品。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ocular lubricant | Dechra | 17033-211-38 | Pharmaceutical agents |
| Isoflurane | VetOne | 502017 | Pharmaceutical agents |
| Carprofen | Zoetis | 26357 | Pharmaceutical agents |
| Precision vaporizer | Summit Medical | 10675 | Surgical supplies |
| Charcoal scavenger | Bickford Inc. | 80120 | Surgical supplies |
| Isothermal pad | Harvard Apparatus | 50-7053-R | Surgical supplies |
| Sterile cotton-tipped applicator | Fisher Scientific | 23-400-124 | Surgical supplies |
| 4-0 absorbable monofilament suture | Ethicon, Inc | J310 | Surgical supplies |
| 5-0 non-absorbable monofilament suture | Ethicon,Inc | 1666 | Surgical supplies |
| 21-gauge x 1 inch needle | BD Biosciences | 305165 | Surgical supplies |
| 25-gauge x 1 inch needle | BD Biosciences | 305125 | Surgical supplies |
| Dry sterilizer | Cellpoint | 7770 | Surgical supplies |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14058-09 | Surgical instruments |
| Adson forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | Surgical instruments |
| Dumont #5 fine forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | Surgical instruments |
| Vannas Spring Scissors 3 mm cutting edge | Fine Science Tools | 15000-00 | Surgical instruments |
| Needle driver | Fine Science Tools | 91201-13 | Surgical instruments |
| Scalpel handle #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | Surgical instruments |
| Scalpel blades #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | Surgical instruments |
| PBS | Lonza | 17-516F | Reagents for tissue processing |
| Evans Blue | Sigma-Aldrich | E2129 | Reagents for tissue processing |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Reagents for tissue processing |
| Modeling wax | Bego | 40001 | Reagents for tissue processing |
| OCT compound | Tissue-Tek Sakura | 4583 | Reagents for tissue processing |
| Mayer's hematoxylin solution | Sigma-Aldrich | MHS16 | Reagents for immunohistological analysis |
| Eosin Y solution alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110316 | Reagents for immunohistological analysis |
| Elastin stain kit | Sigma-Aldrich | HT25A | Reagents for immunohistological analysis |
| Click-it Edu Alexa-488 Imaging Kit | Invitrogen | C10337 | Reagents for immunohistological analysis |
| Anti-Erk1/2 antibody | Cell Signaling Technology | 4695 | Reagents for immunohistological analysis |
| Anti-phospho-Erk1/2 antibody | Cell Signaling Technology | 4370 | Reagents for immunohistological analysis |
| Anti-p27kip1 antibody | Cell Signaling Technology | 3698 | Reagents for immunohistological analysis |
| Trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | T9159 | Reagents for immunohistological analysis |
References
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