Summary
Dette arbejde beskriver en ny protokol til vurdering af forurenings økotoksicitet, herunder nye forurenende stoffer som nanomaterialer, ved anvendelse af den marine bakterie Vibrio anguillarum . Denne metode gør det muligt at bestemme LC 50 eller dødelighed, den koncentration, der forårsager et 50% fald i bakteriens dyrbarhed efter en 6 h eksponering.
Abstract
Bakterier er en vigtig bestanddel af økosystemet, og ændringer i mikrobielle samfund kan have en væsentlig indvirkning på biogeokemiske cykel- og madbaner. Toksicitetstest baseret på mikroorganismer anvendes i vid udstrækning, fordi de er relativt hurtige, reproducerbare, billige og ikke er forbundet med etiske problemer. Her beskriver vi en økotoksikologisk metode til evaluering af den biologiske respons af den marine bakterie Vibrio anguillarum. Denne metode vurderer akut toksicitet af kemiske forbindelser, herunder nye forurenende stoffer, såsom nanopartikler, samt miljøprøver. Slutpunktet er reduktionen af bakteriel dyrkning ( dvs. evnen til at replikere og danne kolonier) på grund af eksponering for et toksisk middel. Denne reduktion kan generelt betegnes som dødelighed. Prøven tillader bestemmelse af LC 50 , koncentrationen, der forårsager et 50% fald i bakterier, der aktivt replikerer og danner kolonier efterEn 6 h eksponering. De dyrkelige bakterier tælles i form af kolonidannende enheder (CFU), og "dødeligheden" evalueres og sammenlignes med kontrollen. I dette arbejde blev toksiciteten af kobbersulfat (CuSO 4 ) evalueret. Et klart dosis-responsforhold blev observeret med en gennemsnitlig LC 50 på 1,13 mg / l efter tre uafhængige tests. Denne protokol sammenlignet med eksisterende metoder med mikroorganismer er anvendelig i et bredere udvalg af saltholdighed og har ingen begrænsninger for farvede / uklare prøver. Den bruger saltvandsløsning som eksponeringsmedium og undgår eventuelle forstyrrelser af vækstmedium med de undersøgte forureninger. LC 50- beregningen letter sammenligninger med andre bioassays, der almindeligvis anvendes til økotoksikologiske vurderinger af havmiljøet.
Introduction
Økotoksikologiske bioassays vurderer toksiciteten af kemikalier eller miljøprøver med standard biologiske modeller, der integrerer virkningerne af fysiske, kemiske og biologiske stressorer på økosystemer. På grund af økosystemernes kompleksitet skal økotoksikologiske risikovurderinger vurdere et batteri af bioassays, som involverer organismer fra forskellige trofiske niveauer. Toksicitetsanalyser på forsøgsdyr kan være dyre, tidskrævende og etisk tvivlsomme. Drevet til begrænsning af dyreforsøg og udvikling af alternative tilgange ( f.eks. På bakterier og ikke-hvirveldyr) er nu et afgørende problem, som rapporteret inden for rammerne af den nuværende europæiske lovgivning, herunder EU's dyrebeskyttelsesdirektiv, det syvende ændringsforslag til EU-kosmetikdirektivet og REACH.
Krebsdyr, fisk og alger anvendes stort set til toksicitetsmålinger i havmiljøet 1 . Bakterier er en vigtig komponentT af økosystemet, og ændringer i mikrobielle samfund kan have væsentlige virkninger på biogeokemisk cykling og andre kritiske økosystemtjenester. Toksicitetstest baseret på mikroorganismer vinder popularitet, fordi de er relativt hurtige, reproducerbare og billige og ikke rejser etiske spørgsmål 2 . Formålet med dette arbejde er at beskrive en økotoksikologisk protokol til evaluering af responsen fra den marine bakterie Vibrio anguillarum ( Listonella anguillarum, Vibrionaceae), når den udsættes for miljømæssige forurenende stoffer.
V. anguillarum er en gramnegativ , kort, kurveformet stangbakterie (0,5 x 1,5 μm) med et polært flagellum. Typisk fundet i brak eller saltvand er det halotolerant med en optimal saltholdighed på ca. 20 og en optimal temperatur mellem 25 og 30 ° C 3 . Det er blevet valgt som en organisme model på grund af sin ubiquity og dens vigtige økologiske roller i oceAns over hele verden 4 . Nogle serotyper af V. anguillarum er kendt for at forårsage vibriose i en række marine eller brackede fiskearter 5 , 6 . Til dette kræver nogle trin i eksperimentet standard mikrobiologiske fremgangsmåder, men der kræves ikke noget specielt sikkerhedsudstyr eller forholdsregler. Den foreslåede toksicitetsprøvningsprotokol anvender den bakterielle kulturlighed ( dvs. evnen til at replikere og danne kolonier) som endepunkt og tillader bestemmelse af LC 50 , koncentrationen, der forårsager en 50% reduktion af bakterier, der aktivt replikerer og danner kolonier efter En eksponering på 6 timer. I Vibrio , som i andre mikrober, kan denne reduktion, som vi generelt angiver som dødelighed, delvis skyldes individer i den levedygtige men ikke-kulturelle (VBNC) fase 7 . I denne undersøgelse anvendte vi denne metode til at måle de toksiske virkninger af kobbersulfat (CuSO 4), Et referencetoksisk stof.
Denne metode blev udviklet til at tilvejebringe en egnet, mikroorganismebaseret test til den økotoksiske vurdering af forurenende stoffer / kemiske forbindelser, herunder nye forurenende stoffer som nanomaterialer. Nyheden af denne protokol sammenlignet med eksisterende metoder anvendt til mikroorganismer er hovedsagelig relateret til eksponeringsmediet og endepunktet. Faktisk udføres eksponeringen i saltvandsløsning og undgår enhver mulig forstyrrelse af vækstmediet med de undersøgte forureninger, som kan påvirke det biologiske respons 8 . Slutpunktet er reduktionen af bakteriel dyrkning, som let kan sammenlignes med andre akutte endepunkter, der anvendes til økotoksikologisk screening i marine / brakede miljøer, baseret på overlevelse / dødelighed. Desuden anvender protokollen teknikken med væsk-til-plade-mikro-tæller, der allerede er anvendt på E. coli 9 , reducerende volumener og således eksperimentelle effekterOrt (se trin 3.3 og 3.4 i protokollen for detaljer).
Protocol
1. Fremstilling af reagenser / materialer
- Forbered (ca. 300) sterile 1,5 ml rør til seriel fortynding af bakterielle suspensioner samt 15 ml sterile rør som testbeholdere mærket med testkoncentrationerne.
- Forbered 2% NaCl opløsning som eksponeringsmediet og steriliser det. Alternativt kan du bruge steriliseret syntetisk eller naturligt havvand med saltholdighed fra 5 til 40.
- Forbered tryptisk soja agar (TSA) vækstmedium med 2% NaCl i overensstemmelse med etiketteretningerne og i betragtning af mængden af NaCI, som allerede er til stede i mediet.
- Hæld TSA'en (kølig men stadig flydende) ind i 90 mm petriskålene, der tidligere var mærket med testkoncentrationen og eksponeringstiden, replikatallet og fortyndingsfaktoren; 19 mL er et passende volumen.
- Forbered tryptisk soja bouillon (TSB) vækstmedium i henhold til etiketten anvisninger. Tilsæt den passende mængde NaCl for at opnå den samme saltholdighed som eksponeringsmediet.
- ForberedeEn CuSO 4 stamopløsning med dobbeltdestilleret vand og steriliser den (nødvendige) alikvot ved hjælp af et 0,2 μm sprøjtefilter. I tilfælde af miljøprøver udarbejder man et passende interval af fortyndinger af prøven og steriliserer dem ved hjælp af et 0,2 μm sprøjtefilter.
- Forbered testopløsningerne i 15 ml rørene mærket med testkoncentrationerne. Fyld den negative kontrol med 5 ml eksponeringsmedium (2% NaCl). Fyld de andre rør med den passende mængde eksponeringsmedium og CuSO 4 stamopløsning for at opnå testkoncentrationerne i et 5 ml slutvolumen.
2. Bakterieinokulumpræparation
- 12-18 timer før testen, tilbered en flydende frisk kultur af Vibrio anguillarum . Brug en steril sløjfe til at vælge en enkelt, isoleret isolerede koloni fra en overnight-kultur på et fast medium (TSA). Inokulere et rør fyldt med 10 ml TSB og inkuber bakteriekulturen ved 25 ° C i 12-18 timer. Efter 12-18 timer estimerer bakteriens koncentration af inokulumet spektrofotometrisk. Vortex inokulumet og måle den optiske densitet ved 600 nm bølgelængde ved anvendelse af TSB som blank.
- For at opnå en kendt bakteriekoncentration fortyndes 2 ml af det hvirveldyrede inokulum ved at tilsætte mængden af TSB beregnet ved hjælp af denne formel:
TSB mL = [(OD / 0,14) * 2] - 2. - Kontroller, at den optiske densitet af det fortyndede inokulum er 0,140 (± 0,005), hvilket svarer til 0,5 point på McFarlands nephelometriske standard.
- Centrifug det fortyndede inokulum i 10 minutter ved 3.000 g . Eliminer supernatanten og suspender den mikrobielle pellet igen i 1 ml 2% NaCl-opløsning (eksponeringsmedium).
3. Testning af eksponering
- Tilsæt 150 μl af det genopslæmmede bakterieinokulum til hvert rør, herunder kontrollen. Inkubér V. anguillarum suspensionerne i 6 timer ved 25 ° C under mørke og i kontinuereS ryster for at undgå sedimentering.
- Ved begyndelsen (T0) og slutningen (T6) af eksponeringstiden udføres bakteriel optælling i alle de eksponerede bakteriesuspensioner ved anvendelse af kolonidannende enhed (CFU) tællingsmetoder.
- Forbered serielle fortyndinger af hver eksponeret bakteriesuspension i triplicat ved anvendelse af en ti-gange fortyndingsfaktor (op til 10 -5 ). Tilsæt 100 μl af hver bakteriesuspension til det tilsvarende rør, der allerede er fyldt med 900 μl eksponeringsmedium (2% NaCl). Fortsæt med den serielle fortynding, hvirvler ved hvert trin for at suspendere bakterierne igen.
- Plad 10 μl af 10-4 og 10 -5 fortyndinger på TSA Petri-skåle i det tilsvarende segment. Lad dråberne hurtigt glide i en lille cirkel ved at dreje pladen. Inkuber pladerne ved 25 ° C i 48 timer.
4. CFU Counting
- Efter 48 timer tæller de kolonier, der dyrkes på petriskålene; Plader med bMellem 5 og 50 kolonier er optimale til nøjagtig tælling.
- Beregn antallet af levedygtige bakterier pr. Ml af hver eksponeret bakteriesuspension ved at anvende følgende formler:
10-4 → CFU / ml = n ° CFU x 100 x 10.000
10 -5 → CFU / ml = n ° CFU x 100 x 100.000 - Brug gennemsnittet af de tal, der er opnået i parallelle replikater for at vurdere dødeligheden sammenlignet med kontrollen. Beregn dødeligheden som en procentdel med følgende formel:
M% = 100 - [(N / C) * 100]
BEMÆRK: Hvor N = antal CFU / mL dyrket efter eksponeringen for toksikanten; C = antal CFU dyrket i kontrolmediet. - Beregn LC 50 ( dvs. koncentrationen af toksikant, der reducerer antallet af aktivt replikerende bakterier med 50% pr. Ml, CFU / mL) med ikke-lineær regressionsanalyse ved hjælp af en passende statistisk software (se materialebordet). Kør en envejs analyse af varians (ANOVA) follSkyldes post-hoc parret t- test for at vurdere væsentlige forskelle mellem behandlinger.
Representative Results
Resultaterne af tre uafhængige forsøg med eksponering af V. anguillarum til fire koncentrationer af CuSO 4 viser et klart dosis-responsforhold og en signifikant reduktion af bakterier, som aktivt replikerer og danner kolonier med en stigende koncentration af referencetoksicanten ( Figur 1 : ANOVA, F = 20,28, p <0,001). Antallet af CFU / ml reduceres signifikant ved 1,25 mg / l (post-hoc Tukey test, p <0,05) sammenlignet med kontrol (CNTR). Eventuelle dyrbare bakterier blev påvist ved den højeste koncentration, der blev testet. Der blev ikke fundet nogen forskel i CuSO 4- toksicitet langs eksponeringsmediumets brede saltholdningsområde ( dvs. 5, 20 eller 35 g / L NaCl, data ikke vist). En repræsentativ output fra den statistiske analyse, der viser den ikke-lineære regression, er rapporteret i supplerende figur 1 . LC 50- værdierne beregnet for de tre uafhængige forsøg (<Strong> Tabel 1) fremhæve muligheden og reproducerbarheden af denne metode.
Figur 1: Vibrio anguillarum udsat for CuSO 4. Det gennemsnitlige antal CFU / ml (CFU = kolonidannende enhed) udsat for anden koncentration af CuSO4 i 6 timer. Værdierne repræsenterer middelværdien (± SD) af tre uafhængige forsøg. Reduktionerne af bakterier, der aktivt replikerer og danner kolonier med hensyn til kontrollen (CNTR), rapporteres i de gule kasser (som procentdele). Væsentlige forskelle med kontrollen, baseret på en post-hoc Tukey test, er angivet med asterisker (* = p <0,05; ** = p <0,01). Klik her for at se en større version af denne figur.
Tabel 1: Lethal koncentration (LC 50 ) værdier for Vibrio anguillarum udsat for CuSO 4 . Resultater af tre uafhængige forsøg og midler (± SD) er rapporteret.
Supplerende Figur 1: Ikke-lineær regressionsanalyse. Repræsentativ udgang fra en ikke-lineær regressionsanalyse (Logit-Hill-model) udført på testens resultater. Klik her for at downloade denne figur.
Discussion
Dette værk beskriver et nyt bioassay med den marine bakterie V. anguillarum, der med succes blev anvendt til at vurdere de toksiske virkninger af CuSO 4 , en referenstoksicant, der viser et klart dosis-respons forhold. Den marine bakterie V. anguillarum blev valgt som en modelorganisme, fordi den er halotolerant, allestedsnærværende og repræsentativ for marine økosystemer.
Prøven kan udføres ved en bred vifte af saltholdighedsværdier (5-40) og kan bruge saltopløsninger og syntetiske eller naturlige havvand som eksponeringsmedium, så længe mikroorganismer let kan overleve i hele testens løbetid. Dette giver mulighed for analyse af forskellige slags prøver, herunder brak og marine miljøer.
Intet vækstmedium er påkrævet i eksponeringsfasen, idet dets interferens med forurenende stoffer 8 og dets mulige indflydelse på det biologiske respons undgås. thE-protokollen er pålidelig, hurtig, omkostningseffektiv og forholdsvis let. Fremgangsmåden med væsken-til-plade-mikro-tal 9 giver fordelen ved at anvende små (prøve) volumener, selvom dette indebærer en høj grad af nøjagtighed og robusthed. Resultaterne af de tre uafhængige forsøg og replikater for hver behandling viser den høje repeterbarhed af denne metode. Anvendelsen af bakterier som en biologisk model, samt teknikkens tilpasningsevne, favoriserer den økologiske og miljømæssige relevans af denne procedure. Andre kritiske tekniske problemer er nøjagtighed ved fremstillingen af det bakterielle inokulum og den sterilitet, der kræves i nogle trin i proceduren.
Den foreslåede test er hurtigere (6 timer) end andre marine økotoksikologiske analyser (24-96 timer) og hæver ikke de etiske problemer som følge af brugen af højere organismer. Endvidere viser data på referencetoksicanten LC 50- værdier, som er sammenlignelige med de opnåede med akut t Ests på andre marine arter 10 , 11 , der viser en god følsomhed. Blandt bakterielle bioassays er V. fischeri luminescensinhiberingstesten den mest almindelige og velstandardiserede 12 . Denne bioassay er meget hurtig (15-30 minutter) og gælder for test af fastfaseprøver, men det kan påvirkes af farvede og uklare prøver, som forstyrrer luminescensmålinger. Saltholdighed er en begrænsende faktor ved anvendelsen af ovennævnte test, med 2% NaCl påkrævet 13 . Tværtimod giver testen, der foreslås her med V. anguillarum, overkommelige resultater ved en bred vifte af saltholdige værdier, har ingen begrænsninger med hensyn til uklare eller farvede prøver og kræver billigere udstyr sammenlignet med luminescensanalysatorerne. En sammenligning mellem resultaterne af vores undersøgelse og de tilgængelige i litteraturen for V. fisheri 14 ,Ss = "xref"> 15 , 16 viser sammenlignelige EC 50- værdier, der yderligere understøtter effektiviteten af dette bioassay.
Dette bioassay vurderer reduktionen af den bakterielle dyrkning, der generelt betegnes som dødelighed, i stedet for populationsvæksthastighed eller enzymatisk aktivitetsinhibering, som anvendes i de tests, der for øjeblikket er tilgængelige for mikroorganismer. LC 50- beregningen tillader sammenligning med andre bioassays, der almindeligvis anvendes til den økotoksikologiske vurdering af havmiljøer, som ofte har overlevelse / dødelighed som slutpunkt. En interkalibreringsøvelse er presserende nødvendigt for at evaluere / bekræfte pålideligheden og reproducerbarheden af denne test og for at understøtte dens standardisering og anvendelse i regulatoriske protokoller.
Den stigende brug af nanomaterialer og deres potentielle frigivelse i miljøet indebærer behovet for risikovurdering 17 . Men clasSical (øko) toksikologiske tilgange til disse nye forurenende stoffer synes ikke at give overkommelige resultater og kan kræve nogle tilpasninger 18 . Karakteristikaene ved dette nye bioassay muliggør dets nemme og anvendelige anvendelse på toksicitetsvurderingen af nanopartikler. Faktisk vil muligheden for at udføre analysen ved forskellige salthalter give regnskab over nanopartikeladfærd under forskellige ionstyrker, en miljøparametervariabel, som signifikant kan påvirke toksicitet 19 . Desuden anbefales det ikke at anvende vækstmedium og næringsstoffer i nanopartiklernes økotoksicitetsvurderinger, fordi organiske stoffer kan lette deres absorption ved at øge de toksiske virkninger 20 eller kan forårsage aggregering, reducere den biotilgængelige fraktion og dermed deres toksicitet 21 .
Afslutningsvis er bioassayet på Vibrio anguillarum apRomiseringsværktøj til risikovurdering af klassiske og nye forureninger, samt til vurdering af status for marine og brakede miljøer.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af forskningsprojektet: "NanoBioTech ambiente e salute. Progetto 2: Ambiente. Strumenti e metodi per monitoraggio ecotossicologico delle Nanoparticelle" ( "Nano-BioTechnology: miljø og sundhed. Projekt 2: Miljø. Værktøjer og metoder til økotoksikologiske Overvågning af nanopartikler " ) tildelt LM fra Regione Lazio-Consorzio Hypatia. AR blev finansieret af et postdoktoralt bidrag fra universitetet i Tor Vergata / Regione Lazio-Consorzio Hypatia som led i det tidligere nævnte projekt. En aftale med ISPRA-Tor Vergata University (N. 2015/52857) tillod gensidig brug af faciliteter og udveksling af forskere.
Forfatterne er skyldige til prof. Maria Cristina Thaller, vores værtsengel for alle mikrobielle aktiviteter, for at øge interesse for den mikrobielle verden og for stærkt at bidrage til at forbedre vores forskning i spørgsmålet. Forfatterne anerkender taknemmeligt Andrea Tornambè og EriKa Magaletti til det dyrebare samarbejde med ISPRA Lab of Phytoplankton økologi og økotoksikologi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vibrio anguillarum (strain AL 102, serotype O1) | Obtained from the laboratory collection of NOIFMA (Norway) | ||
| Tryptic Soy Agar | Liofilchem | 610052 | Dehydrated Culture Media |
| Tryptic Soy Broth growth medium | Liofilchem | 610053 | Dehydrated Culture Media |
| CuSO4·5H2O | Sigma-Aldrich | 209198 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S-3014 | |
| Name of Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Biosafety Laminar Flow Hood | ESCO | ||
| Incubator | Fratelli Galli | Mod. 2100 | |
| Name of Software | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Benchmark Dose Software | US EPA | Benchmark Dose 2.4.0 | 2012 |
References
- Guidance on information requirements and chemical safety assessment. , ECHA (European CHemicals Agency). Available from: http://guidance.echa.europa.au/docs/guidance document/information (2008).
- Parvez, S., Venkataraman, C., Mukherji, S. A review on advantages of implementing luminescence inhibition test (Vibrio fischeri) for acute toxicity prediction of chemicals. Environm. Internat. 32 (2), 256-268 (2006).
- Rad, M., Shahsavani, D. Isolation and characterization of Vibrio (Listonella) anguillarum from catfish. Turkish J. Veter. Animal. 34 (4), 413-415 (2010).
- Thompson, F., Iida, T., Swings, J. Biodiversity of Vibrios. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 68, 403-431 (2004).
- Austin, B., Austin, D. A. Vibrionaceae representatives: characteristics of the disease. Bacterial Fish Pathogens: Disease of Farmed and Wild Fish. 29-30, Springer-Praxis. Chichester, UK. 108-115 (1999).
- Larsen, J. L., Mellergaard, S. Microbiological and hygienic problems in marine aquaculture: furunculosis and vibriosis in rainbow trout (Salmo gairdneri). L.). Bull. Eur. Assoc. Fish Pathol. 1, 29-31 (1981).
- Oliver, J. D. The viable but nonculturable state in bacteria. J. Microbiol. 43 (1), 93-100 (2005).
- Hsieh, C. -Y., Tsai, M. -H., Ryan, D. K., Pancorbo, O. C. Toxicity of the 13 priority pollutant metals to Vibrio fisheri in the Microtox chronic toxicity test. Sci. Total Environ. 320, 37-50 (2004).
- Migliore, L., Rotini, A., Thaller, M. C. Low doses of Tetracycline trigger the E. coli growth: a case of hormetic response. Dose-Response. 11, 550-557 (2013).
- Adams, M. S., Stauber, J. L. Development of a whole-sediment toxicity test using a benthic marine microalga. Environm. Toxicol. Chem. 23 (8), 1957-1968 (2004).
- Manfra, L., et al. Ecotoxicity of diEthylene Glycol and risk assessment for marine environment. J. Hazard. Mat. 284, 130-135 (2015).
- Microtox® Acute Toxicity Solid-Phase Test. , Azur Environmental. 20 (1995).
- Metodi analitici per le acque. Manuali e Linee Guida (Analytical methods for waters. Manual and Guidelines). Metodi Ecotossicologici (Ecotoxicological methods). 29 (3), APAT IRSA-CNR. 8030 (2003).
- Heinlaan, M., Ivask, A., Blinova, I., Dubourguier, H. -C., Kahru, A. Toxicity of nanosized and bulk ZnO, CuO and TiO2 to bacteria Vibrio fischeri and crustaceans Daphnia magna and Thamnocephalus platyurus. Chemosphere. 71, 1308-1316 (2008).
- Mortimer, M., Kasemets, K., Heinlaan, M., Kurvet, I., Kahru, A. High throughput kinetic Vibrio fischeri bioluminescence inhibition assay for study of toxic effects of nanoparticles. Toxicol. In Vitro. 22 (5), 1412-1417 (2008).
- Bondarenko, O. M., et al. Multilaboratory evaluation of 15 bioassays for (eco) toxicity screening and hazard ranking of engineered nanomaterials: FP7 project NANOVALID. Nanotoxicology. 10 (9), 1229-1242 (2016).
- Matranga, V., Corsi, I. Toxic effects of engineered nanoparticles in the marine environment: model organisms and molecular approaches. Mar. Envir. Res. 76, 32-40 (2012).
- Corsi, I., et al. Common strategies and technologies for the ecosafety assessment and design of nanomaterials entering the marine environment. ACS NANO. 8 (10), 9694-9709 (2014).
- Handy, R. D., von der Kammer, F., Lead, J. R., Hassellöv, M., Owen, R., Crane, M. The ecotoxicology and chemistry of manufactured nanoparticles. Ecotoxicology. 17, 287-314 (2008).
- Kasemets, K., Suppi, S., Kunnis-Beres, K., Kahru, A. Toxicity of CuO nanoparticles to yeast Saccharomyces cerevisiae BY4741 wild-type and its nine isogenic single-gene deletion mutants. Chem. Res. Toxicol. 26, 356-367 (2013).
- Ivask, A., et al. Mechanisms of toxic action of Ag, ZnO and CuO nanoparticles to selected ecotoxicological test organisms and mammalian cells in vitro: A comparative review. Nanotoxicology. 8 (1), 57-71 (2013).
