Summary
Dette arbeidet beskriver en ny protokoll for å vurdere forurensningens økotoksisitet, inkludert nye forurensninger som nanomaterialer, ved hjelp av den marine bakterien Vibrio anguillarum . Denne metoden gjør det mulig å bestemme LC 50 , eller dødelighet, konsentrasjonen som forårsaker en 50% reduksjon i bakteriens dyrbarhet, etter en 6 timers eksponering.
Abstract
Bakterier er en viktig komponent i økosystemet, og endringer i mikrobiell samfunn kan ha en betydelig effekt på biogeokjemiske sykler og matbaner. Toksisitetstest basert på mikroorganismer er mye brukt fordi de er relativt raske, reproduserbare, billige og ikke er forbundet med etiske problemer. Her beskriver vi en økotoksikologisk metode for å evaluere den biologiske responsen hos den marine bakterien Vibrio anguillarum. Denne metoden vurderer akutt toksisitet av kjemiske forbindelser, inkludert nye forurensninger som nanopartikler, samt miljøprøver. Endepunktet er reduksjon av bakteriell kulturlighet ( dvs. evnen til å replikere og danne kolonier) på grunn av eksponering for et giftmiddel. Denne reduksjonen kan generelt betegnes som dødelighet. Testen tillater bestemmelse av LC 50 , konsentrasjonen som forårsaker en 50% reduksjon av bakterier som aktivt replikerer og danner kolonier, etter atEn 6 h eksponering. De kulturelle bakteriene regnes som kolonidannende enheter (CFU), og "dødeligheten" evalueres og sammenlignes med kontrollen. I dette arbeidet ble toksisiteten av kobbersulfat (CuSO 4 ) evaluert. Et klart forhold mellom dose og respons ble observert, med en gjennomsnittlig LC 50 på 1,13 mg / l etter tre uavhengige tester. Denne protokollen, sammenlignet med eksisterende metoder med mikroorganismer, er anvendelig i et bredere spekter av saltholdighet og har ingen begrensninger for fargede / uklare prøver. Det bruker saltoppløsning som eksponeringsmedium, og unngår eventuelle forstyrrelser av vekstmedium med de undersøkte forurensningene. LC 50- beregningen muliggjør sammenligninger med andre biologiske analyser som vanligvis brukes på økotoksikologiske vurderinger av havmiljøet.
Introduction
Økotoksikologiske bioassays evaluerer toksisiteten til kjemikalier eller miljøprøver med standard biologiske modeller, som integrerer effektene av fysiske, kjemiske og biologiske stressorer på økosystemene. På grunn av økosystemets kompleksitet må økotoksikologiske risikovurderinger vurdere et batteri av bioassays som involverer organismer fra forskjellige trofiske nivåer. Toksisitetsanalyser på laboratoriedyr kan være dyre, tidkrevende og etisk tvilsom. Kjøringen for å begrense dyreforsøk og utvikle alternative tilnærminger ( f.eks. På bakterier og ikke-vertebratte dyr) er nå et sentralt tema, som rapportert i rammen av gjeldende europeisk lovgivning, inkludert EUs dyrevernsdirektiv, 7. tilpasning til EU-kosmetikkdirektivet, og REACH.
Krepsdyr, fisk og alger brukes i stor grad til toksisitetsmålinger i havmiljøet 1 . Bakterier er en viktig komponentT av økosystemet, og endringer i mikrobielle samfunn kan ha betydelige effekter på biogeokjemisk sykling og andre kritiske økosystemtjenester. Toksisitetstest basert på mikroorganismer blir stadig mer populært fordi de er relativt raske, reproduserbare og billige og ikke tar opp etiske problemer 2 . Målet med dette arbeidet er å beskrive en økotoksikologisk protokoll for å evaluere responsen til den marine bakterien Vibrio anguillarum ( Listonella anguillarum, Vibrionaceae) når den er utsatt for miljøgifter.
V. anguillarum er en gramnegativ , kort, kurveformet stangbakterie (0,5 x 1,5 μm) med en polar flagellum. Typisk funnet i brak eller saltvann, det er halotolerant, med en optimal saltholdighet på ca. 20 og en optimal temperatur mellom 25 og 30 ° C 3 . Den er valgt som en organisme modell på grunn av sin ubiquity og dens viktige økologiske roller i oceAns over hele verden 4 . Noen serotyper av V. anguillarum er kjent for å forårsake vibriose i en rekke marine eller brakke arter 5 , 6 . For dette krever noen trinn i forsøket standard mikrobiologiske metoder, men det er ikke nødvendig med spesielle sikkerhetsutstyr eller forholdsregler. Den foreslåtte toksisitetsprøveprotokollen bruker bakteriell kulturlighet ( dvs. evnen til å replikere og danne kolonier) som endepunkt og tillater bestemmelse av LC 50 , konsentrasjonen som forårsaker en 50% reduksjon av bakterier som aktivt replikerer og danner kolonier, etter at En eksponering på 6 timer. I Vibrio , som i andre mikrober, kan denne reduksjonen, som vi generelt indikerer som dødelighet, delvis skyldes individer i den levedyktige, men ikke-kulturelle (VBNC) fase 7 . I denne studien brukte vi denne metoden for å måle de toksiske effektene av kobbersulfat (CuSO 4), En referanse toksikant.
Denne metoden ble utviklet for å gi en egnet, mikroorganismebasert test for økotoksisk vurdering av forurensende stoffer / kjemiske forbindelser, inkludert fremvoksende forurensninger som nanomaterialer. Nyheten til denne protokollen i forhold til eksisterende metoder som brukes for mikroorganismer, er hovedsakelig relatert til eksponeringsmediet og endepunktet. Faktisk utføres eksponeringen i saltoppløsning, og unngår mulig forstyrrelse av vekstmediet med de undersøkte forurensningene, som kan påvirke den biologiske responsen 8 . Endepunktet er reduksjon av bakteriell kulturlighet, noe som lett kan sammenlignes med andre akutte endepunkter som benyttes for økotoksikologisk screening i marine / brune miljøer, basert på overlevelse / dødelighet. Videre bruker protokollen teknikken med væsk-til-plate-mikro-teller, som allerede er brukt på E. coli 9 , reduserende volumer og dermed eksperimentelle effekterOrt (se punkt 3.3 og 3.4 i protokollen for detaljer).
Protocol
1. Fremstilling av reagenser / materialer
- Forbered (ca. 300) sterile 1,5 ml rør for seriell fortynning av bakterielle suspensjoner, samt 15 mL sterile rør som testbeholdere merket med testkonsentrasjonene.
- Klargjør 2% NaCl-oppløsning som eksponeringsmedium og steriliser det. Alternativt kan du bruke sterilisert syntetisk eller naturlig sjøvann, med saltholdighet fra 5 til 40.
- Forbered tryptisk soya agar (TSA) vekstmedium med 2% NaCl i henhold til etikettretningene og vurderer mengden av NaCl som allerede er tilstede i mediet.
- Hell TSA (kald, men likevel flytende) inn i 90 mm petriskålene som tidligere er merket med testkonsentrasjon og eksponeringstid, replikatall og fortynningsfaktor; 19 mL er et passende volum.
- Forbered tryptisk soyabuljong (TSB) vekstmedium i henhold til etikettretningen. Tilsett riktig mengde NaCl for å oppnå samme saltholdighet som eksponeringsmediet.
- ForberedeEn CuSO 4 stamløsning med dobbeltdestillert vann og steriliser den (nødvendige) alikvoten ved hjelp av et 0,2 μm sprøytefilter. I tilfelle av miljøprøver, lag et passende intervall for fortynninger av prøven og steriliser dem med et 0,2 μm sprøytefilter.
- Klargjør testløsningene i 15 ml rørene merket med testkonsentrasjonene. Fyll den negative kontrollen med 5 ml eksponeringsmedium (2% NaCl). Fyll de andre rørene med riktig mengde eksponeringsmedium og CuSO 4 stamløsning for å oppnå testkonsentrasjonene i et 5 ml sluttvolum.
2. Bakteriell inokulumpreparasjon
- 12-18 timer før testen, lag en flytende frisk kultur av Vibrio anguillarum . Ved hjelp av en steril sløyfe, velg en enkelt, velisolert koloni fra en overnattingskultur på et fast medium (TSA). Inokuler et rør fylt med 10 ml TSB og inkuber bakteriekulturen ved 25 ° C i 12-18 timer. Etter 12-18 timer estimerer bakteriekonsentrasjonen av inokulumet spektrofotometrisk. Vortex inokulumet og måle den optiske tettheten ved 600 nm bølgelengde ved bruk av TSB som blank.
- For å oppnå en kjent bakteriekonsentrasjon, fortynne 2 ml av det virvelte inokulumet ved å tilsette mengden TSB beregnet ved denne formel:
TSB mL = [(OD / 0,14) * 2] - 2. - Kontroller at den optiske densiteten til det fortynnede inokulumet er 0,140 (± 0,005), som tilsvarer 0,5 punktet på McFarlands nephelometriske standard.
- Sentrifug det fortynnede inokulumet i 10 minutter ved 3000 g . Eliminer supernatanten og suspender den mikrobielle pelleten i 1 ml 2% NaCl-oppløsning (eksponeringsmedium).
3. Teste eksponering
- Tilsett 150 μL av det resuspenderte bakterieinokulumet til hvert rør, inkludert kontrollen. Inkubér V. anguillarum suspensjonene i 6 timer ved 25 ° C under mørke og i kontinuerlig brukS risting for å unngå sedimentering.
- Ved begynnelsen (T 0 ) og slutten (T 6 ) av eksponeringstiden, utfør bakteriell telling i alle de eksponerte bakterielle suspensjonene ved hjelp av kolonidannende enhet (CFU) tellingsmetoder.
- Forbered serielle fortynninger av hver eksponert bakteriesuspensjon i tre eksemplarer ved å bruke en ti-ganger fortynningsfaktor (opptil 10 -5 ). Tilsett 100 μl av hver bakteriesuspensjon til det tilsvarende rør som allerede er fylt med 900 μl eksponeringsmedium (2% NaCl). Fortsett med seriell fortynning, vortexing ved hvert trinn for å suspendere bakteriene på nytt.
- Plate 10 μl av 10-4 og 10 -5 fortynninger på TSA Petri-tallerkener i det tilsvarende segmentet. La dråper raskt glide i en liten sirkel ved å rotere platen. Inkuber platene ved 25 ° C i 48 timer.
4. CFU Counting
- Etter 48 timer må du telle koloniene som vokser på petriskålene; Plater med bEtween 5 og 50 kolonier er optimale for nøyaktig telling.
- Beregn antall levedyktige bakterier per ml av hver eksponert bakteriesuspensjon ved å bruke følgende formler:
10-4 → CFU / ml = n ° CFU x 100 x 10.000
10 -5 → CFU / ml = n ° CFU x 100 x 100.000 - Bruk gjennomsnittet av tallene oppnådd i parallelle replikater for å evaluere dødeligheten sammenlignet med kontrollen. Beregn dødeligheten som en prosentandel med følgende formel:
M% = 100 - [(N / C) * 100]
MERK: Hvor N = antall CFU / mL dyrket etter eksponering for giftig stoffet; C = antall CFU dyrket i kontrollmediet. - Beregn LC 50 ( dvs. konsentrasjonen av toksikant som reduserer antall aktivt replikerende bakterier med 50% per ml, CFU / mL) med ikke-lineær regresjonsanalyse ved hjelp av en passende statistisk programvare (se materialebordet). Kjør en enveisanalyse av varians (ANOVA) follSkyldes post-hoc parvise tester for å evaluere signifikante forskjeller mellom behandlinger.
Representative Results
Resultatene av tre uavhengige forsøk på å eksponere V. anguillarum til fire konsentrasjoner av CuSO 4 viser et klart dose-respons forhold og en signifikant reduksjon av bakterier som aktivt replikerer og danner kolonier med en økende konsentrasjon av referanse-toksikanten ( Figur 1 , ANOVA, F = 20,28, p <0,001). Antallet CFU / ml reduseres signifikant ved 1,25 mg / l (post-hoc Tukey test, p <0,05) sammenlignet med kontroll (CNTR). Eventuelle dyrbare bakterier ble detektert ved den høyeste konsentrasjonen som ble testet. Ingen forskjeller i CuSO 4 toksisitet ble funnet langs det brede saltholdighetsområdet for eksponeringsmediet ( dvs. 5, 20 eller 35 g / l NaCl, data ikke vist). En representativ utgang fra den statistiske analysen som viser den ikke-lineære regresjonen, er rapportert i tilleggs figur 1 . LC 50- verdiene beregnet for de tre uavhengige forsøkene (<Strong> Tabell 1) fremhever muligheten og reproduserbarheten av denne metoden.
Figur 1: Vibrio anguillarum utsatt for CuSO 4. Gjennomsnittlig antall CFU / ml (CFU = kolonidannende enhet) utsatt for annen konsentrasjon av CuSO 4 i 6 timer. Verdiene representerer gjennomsnittet (± SD) av tre uavhengige forsøk. Reduksjonene av bakterier som aktivt replikerer og danner kolonier med hensyn til kontrollen (CNTR), rapporteres i de gule boksene (i prosent). Vesentlige forskjeller med kontrollen, basert på en post-hoc Tukey test, er angitt med stjerner (* = p <0,05; ** = p <0,01). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tabell 1: Lethal konsentrasjon (LC 50 ) verdier for Vibrio anguillarum eksponert for CuSO 4 . Resultatene av tre uavhengige forsøk og midler (± SD) er rapportert.
Supplerende Figur 1: Ikke-lineær regresjonsanalyse. Representativ utgang fra en ikke-lineær regresjonsanalyse (Logit-Hill-modell) utført på resultatene av testen. Vennligst klikk her for å laste ned denne figuren.
Discussion
Dette arbeidet beskriver et nytt bioassay med den marine bakterien V. anguillarum som ble brukt til å vurdere de toksiske effektene av CuSO 4 , en referanse giftig, som viser et klart dose-respons forhold. Den marine bakterien V. anguillarum ble valgt som en modellorganisme fordi den er halotolerant, allestedsnærværende og representativ for marine økosystemer.
Testen kan utføres ved et bredt spekter av saltholdighetsverdier (5-40) og kan bruke saltvannsløsninger og syntetiske eller naturlige sjøvann som eksponeringsmedium, så lenge mikroorganismer lett kan overleve i hele testperioden. Dette gjør det mulig å analysere ulike typer prøver, inkludert brak og marine miljøer.
Det er ikke nødvendig med vekstmedium i eksponeringsfasen, og unngår forstyrrelser av forurensningene 8 og dets mulige innflytelse på den biologiske responsen. thE-protokollen er pålitelig, rask, kostnadseffektiv og relativt enkel. Fremgangsmåten med væsken til plate-mikro-teller 9 gir fordelen av å bruke små (prøve) volumer, selv om dette innebærer en høy grad av nøyaktighet og robusthet. Resultatene av de tre uavhengige forsøkene og replikatene for hver behandling viser den høye repeterbarheten av denne metoden. Bruken av bakterier som en biologisk modell, samt teknikkens tilpasningsevne, favoriserer økologisk og miljømessig relevans av denne prosedyren. Andre kritiske tekniske problemer er nøyaktighet i fremstillingen av det bakterielle inokulum og steriliteten som kreves i noen trinn i prosedyren.
Den foreslåtte testen er raskere (6 timer) enn andre marine økotoksikologiske analyser (24-96 timer) og øker ikke de etiske problemene som oppstår ved bruk av høyere organismer. Videre viser data på referanse-toksikanten LC 50- verdier som er sammenlignbare med de som er oppnådd med akutt t Ests på andre marine arter 10 , 11 , som viser god følsomhet. Blant bakterielle bioassays er V. fischeri luminescensinhiberingsprøven den vanligste og godt standardiserte 12 . Dette bioassayet er veldig raskt (15-30 minutter) og gyldig for testing av fastfaseprøver, men det kan påvirkes av fargede og uklare prøver som forstyrrer luminescensmålinger. Salthet er en begrensende faktor ved bruk av den ovennevnte testen, med 2% NaCl påkrevd 13 . Tvert imot gir testen som foreslås her med V. anguillarum, overkommelige resultater ved et bredt spekter av saltholdighetsverdier, har ingen begrensninger i forhold til uklare eller fargede prøver, og krever billigere utstyr sammenlignet med luminescensanalysatorene. En sammenligning mellom resultatene av vår studie og de tilgjengelige i litteraturen for V. fisheri 14 ,Ss = "xref"> 15 , 16 viser sammenlignbare EC 50- verdier, som ytterligere støtter effektiviteten av dette bioassayet.
Dette bioassayet vurderer reduksjonen av den bakterielle kulturbarheten, generelt referert til som dødelighet, i stedet for populasjonsvekst eller enzymatisk aktivitetsinhibering, som brukes i de testene som for øyeblikket er tilgjengelige for mikroorganismer. LC 50- beregningen tillater sammenligning med andre biologiske analyser som vanligvis brukes til økotoksikologisk vurdering av marine miljøer, som ofte har overlevelse / dødelighet som sluttpunkt. En interkalibreringsøvelse er presserende nødvendig for å evaluere / bekrefte påliteligheten og reproduserbarheten av denne testen og for å støtte standardiseringen og bruken i regulatoriske protokoller.
Den økende bruken av nanomaterialer og deres potensielle utslipp i miljøet innebærer behovet for risikovurdering 17 . Men clasSical (eco) toksikologiske tilnærminger for disse fremvoksende forurensningene synes ikke å gi rimelige resultater og kan kreve noen tilpasninger 18 . Kjennetegnene til dette nye bioassayet tillater at det er lett og nyttig bruk for toksisitetsvurderingen av nanopartikler. Faktisk vil muligheten for å utføre analysen ved forskjellige salter gi en oversikt over nanopartikkeladferdene under forskjellige ionstyrker, en miljøparametervariabel som kan påvirke giftigheten 19 signifikant. Videre anbefales ikke bruk av vekstmedium og næringsstoffer i økotoksisitetsvurderinger av nanopartikler fordi organiske stoffer kan lette deres absorpsjon ved å øke de giftige virkninger 20 eller kan forårsake aggregering, redusere den biotilgjengelige fraksjonen og dermed deres toksisitet 21 .
Til slutt er bioassayet på Vibrio anguillarum apRomiseringsverktøy for risikovurdering av klassiske og fremvoksende forurensninger, samt for vurdering av status for marine og brakede miljøer.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av forskningsprosjektet: "NanoBioTech ambiente e salute. Progetto 2: Ambiente. Strumenti e metodi per monitoraggio ecotossicologico delle Nanoparticelle" ( "Nano-BioTechnology: miljø og helse. Prosjekt 2: Miljø. Verktøy og metoder for økotoksikologiske Overvåking av nanopartikler " ) gitt til LM fra Regione Lazio-Consorzio Hypatia. AR ble finansiert av et postdoktoralt stipend fra Universitetet i Tor Vergata / Regione Lazio-Consorzio Hypatia under rammen av det tidligere nevnte prosjektet. En avtale med ISPRA-Tor Vergata University (N. 2015/52857) tillot gjensidig bruk av fasiliteter og utveksling av forskere.
Forfatterne er gjeldt til prof. Maria Cristina Thaller, vår verneengel for alle mikrobielle aktiviteter, for å øke interessen for den mikrobielle verden og for sterkt å bidra til å forbedre vår forskning på problemet. Forfatterne takker gjerne Andrea Tornambè og EriKa Magaletti for det dyrebare samarbeidet med ISPRA Lab av Phytoplankton økologi og økotoksikologi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vibrio anguillarum (strain AL 102, serotype O1) | Obtained from the laboratory collection of NOIFMA (Norway) | ||
| Tryptic Soy Agar | Liofilchem | 610052 | Dehydrated Culture Media |
| Tryptic Soy Broth growth medium | Liofilchem | 610053 | Dehydrated Culture Media |
| CuSO4·5H2O | Sigma-Aldrich | 209198 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S-3014 | |
| Name of Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Biosafety Laminar Flow Hood | ESCO | ||
| Incubator | Fratelli Galli | Mod. 2100 | |
| Name of Software | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Benchmark Dose Software | US EPA | Benchmark Dose 2.4.0 | 2012 |
References
- Guidance on information requirements and chemical safety assessment. , ECHA (European CHemicals Agency). Available from: http://guidance.echa.europa.au/docs/guidance document/information (2008).
- Parvez, S., Venkataraman, C., Mukherji, S. A review on advantages of implementing luminescence inhibition test (Vibrio fischeri) for acute toxicity prediction of chemicals. Environm. Internat. 32 (2), 256-268 (2006).
- Rad, M., Shahsavani, D. Isolation and characterization of Vibrio (Listonella) anguillarum from catfish. Turkish J. Veter. Animal. 34 (4), 413-415 (2010).
- Thompson, F., Iida, T., Swings, J. Biodiversity of Vibrios. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 68, 403-431 (2004).
- Austin, B., Austin, D. A. Vibrionaceae representatives: characteristics of the disease. Bacterial Fish Pathogens: Disease of Farmed and Wild Fish. 29-30, Springer-Praxis. Chichester, UK. 108-115 (1999).
- Larsen, J. L., Mellergaard, S. Microbiological and hygienic problems in marine aquaculture: furunculosis and vibriosis in rainbow trout (Salmo gairdneri). L.). Bull. Eur. Assoc. Fish Pathol. 1, 29-31 (1981).
- Oliver, J. D. The viable but nonculturable state in bacteria. J. Microbiol. 43 (1), 93-100 (2005).
- Hsieh, C. -Y., Tsai, M. -H., Ryan, D. K., Pancorbo, O. C. Toxicity of the 13 priority pollutant metals to Vibrio fisheri in the Microtox chronic toxicity test. Sci. Total Environ. 320, 37-50 (2004).
- Migliore, L., Rotini, A., Thaller, M. C. Low doses of Tetracycline trigger the E. coli growth: a case of hormetic response. Dose-Response. 11, 550-557 (2013).
- Adams, M. S., Stauber, J. L. Development of a whole-sediment toxicity test using a benthic marine microalga. Environm. Toxicol. Chem. 23 (8), 1957-1968 (2004).
- Manfra, L., et al. Ecotoxicity of diEthylene Glycol and risk assessment for marine environment. J. Hazard. Mat. 284, 130-135 (2015).
- Microtox® Acute Toxicity Solid-Phase Test. , Azur Environmental. 20 (1995).
- Metodi analitici per le acque. Manuali e Linee Guida (Analytical methods for waters. Manual and Guidelines). Metodi Ecotossicologici (Ecotoxicological methods). 29 (3), APAT IRSA-CNR. 8030 (2003).
- Heinlaan, M., Ivask, A., Blinova, I., Dubourguier, H. -C., Kahru, A. Toxicity of nanosized and bulk ZnO, CuO and TiO2 to bacteria Vibrio fischeri and crustaceans Daphnia magna and Thamnocephalus platyurus. Chemosphere. 71, 1308-1316 (2008).
- Mortimer, M., Kasemets, K., Heinlaan, M., Kurvet, I., Kahru, A. High throughput kinetic Vibrio fischeri bioluminescence inhibition assay for study of toxic effects of nanoparticles. Toxicol. In Vitro. 22 (5), 1412-1417 (2008).
- Bondarenko, O. M., et al. Multilaboratory evaluation of 15 bioassays for (eco) toxicity screening and hazard ranking of engineered nanomaterials: FP7 project NANOVALID. Nanotoxicology. 10 (9), 1229-1242 (2016).
- Matranga, V., Corsi, I. Toxic effects of engineered nanoparticles in the marine environment: model organisms and molecular approaches. Mar. Envir. Res. 76, 32-40 (2012).
- Corsi, I., et al. Common strategies and technologies for the ecosafety assessment and design of nanomaterials entering the marine environment. ACS NANO. 8 (10), 9694-9709 (2014).
- Handy, R. D., von der Kammer, F., Lead, J. R., Hassellöv, M., Owen, R., Crane, M. The ecotoxicology and chemistry of manufactured nanoparticles. Ecotoxicology. 17, 287-314 (2008).
- Kasemets, K., Suppi, S., Kunnis-Beres, K., Kahru, A. Toxicity of CuO nanoparticles to yeast Saccharomyces cerevisiae BY4741 wild-type and its nine isogenic single-gene deletion mutants. Chem. Res. Toxicol. 26, 356-367 (2013).
- Ivask, A., et al. Mechanisms of toxic action of Ag, ZnO and CuO nanoparticles to selected ecotoxicological test organisms and mammalian cells in vitro: A comparative review. Nanotoxicology. 8 (1), 57-71 (2013).
