Summary
Ce travail décrit un nouveau protocole pour évaluer l'écotoxicité des polluants, y compris les contaminants émergents tels que les nanomatériaux, en utilisant la bactérie marine Vibrio anguillarum . Cette méthode permet de déterminer la LC 50 , ou la mortalité, la concentration qui entraîne une diminution de 50% de la culture bactérienne, après une exposition de 6 h.
Abstract
Les bactéries sont une composante importante de l'écosystème et les altérations de la communauté microbienne peuvent avoir un impact significatif sur le cycle biogéochimique et les réseaux alimentaires. Les tests de toxicité basés sur des microorganismes sont largement utilisés car ils sont relativement rapides, reproductibles, peu coûteux et ne sont pas associés à des problèmes éthiques. Ici, nous décrivons une méthode écotoxicologique pour évaluer la réponse biologique de la bactérie marine Vibrio anguillarum. Cette méthode évalue la toxicité aiguë des composés chimiques, y compris les nouveaux contaminants tels que les nanoparticules, ainsi que des échantillons environnementaux. Le critère d'évaluation est la réduction de la culture bactérienne ( c'est-à-dire la capacité de se répliquer et de former des colonies) en raison de l'exposition à un toxique. Cette réduction peut être généralement appelée mortalité. Le test permet la détermination de la LC 50 , la concentration qui provoque une diminution de 50% des bactéries en reproduisant activement et formant des colonies, aprèsUne exposition de 6 h. Les bactéries cultivables sont comptées en termes d'unités de formation de colonies (CFU), et la «mortalité» est évaluée et comparée au témoin. Dans ce travail, la toxicité du sulfate de cuivre (CuSO 4 ) a été évaluée. Une relation dose-réponse claire a été observée, avec une LC 50 moyenne de 1,13 mg / L, après trois tests indépendants. Ce protocole, par rapport aux méthodes existantes avec des microorganismes, est applicable dans une large gamme de salinité et n'a pas de limites pour les échantillons colorés / turbides. Il utilise la solution saline comme support d'exposition, en évitant toute interférence éventuelle de milieu de croissance avec les contaminants étudiés. Le calcul LC 50 facilite les comparaisons avec d'autres bioensaiements couramment appliqués aux évaluations écotoxicologiques du milieu marin.
Introduction
Les essais biologiques écotoxicologiques évaluent la toxicité des produits chimiques ou des échantillons environnementaux avec des modèles biologiques standard, intégrant les effets des facteurs de stress physiques, chimiques et biologiques sur les écosystèmes. En raison de la complexité des écosystèmes, les évaluations des risques écotoxicologiques doivent tenir compte d'une batterie de bio-essais impliquant des organismes de différents niveaux trophiques. Les tests de toxicité sur les animaux de laboratoire peuvent être coûteux, longs et éthiquement douteux. La volonté de limiter les essais sur les animaux et de développer des approches alternatives ( par exemple, sur les bactéries et les animaux non vertébrés) est maintenant une question essentielle, telle que rapportée dans le cadre de la législation européenne actuelle, y compris la Directive européenne pour la protection des animaux, le septième amendement à la EU Cosmetics Directive, et REACH.
Les crustacés, les poissons et les algues sont largement utilisés pour des mesures de toxicité dans le milieu marin 1 . Les bactéries sont un composant importantT de l'écosystème et les modifications apportées aux communautés microbiennes peuvent avoir des effets significatifs sur le cyclisme biogéochimique et d'autres services essentiels des écosystèmes. Les tests de toxicité basés sur les microorganismes gagnent en popularité parce qu'ils sont relativement rapides, reproductibles et bon marché et ne soulèvent pas de problèmes éthiques 2 . Le but de ce travail est de décrire un protocole écotoxicologique pour évaluer la réponse de la bactérie marine Vibrio anguillarum ( Listonella anguillarum, Vibrionaceae) lorsqu'il est exposé à des contaminants environnementaux.
V. anguillarum est une bactérie Gram-négative, courte, en forme de tige (0.5 x 1.5 μm) avec un flagelle polaire. Habituellement trouvé dans l'eau saumâtre ou salée, il est halotolérant, avec une salinité optimale d'environ 20 et une température optimale entre 25 et 30 ° C 3 . Il a été choisi comme modèle d'organisme en raison de son ubiquité et de ses importants rôles écologiques en oce4 ans dans le monde entier. Certains sérotypes de V. anguillarum sont connus pour provoquer de la vibriose dans une variété d'espèces de poissons marins ou saumâtres 5 , 6 . Pour cela, certaines étapes de l'expérience nécessitent des pratiques microbiologiques standard, mais aucun équipement de sécurité ou aucune précaution particulière n'est nécessaire. Le protocole de test de toxicité proposé utilise la culture bactérienne ( c'est-à-dire la capacité de se répliquer et de former des colonies) comme point final et permet la détermination de la LC 50 , la concentration qui provoque une réduction de 50% des bactéries en reproduisant activement et en formant des colonies après Une exposition de 6 h. Dans Vibrio , comme dans d'autres microbes, cette réduction, que nous indiquons généralement comme mortalité, peut être partiellement due à des individus dans la phase 7 viable mais non cultivable (VBNC). Dans cette étude, nous avons appliqué cette méthode pour mesurer les effets toxiques du sulfate de cuivre (CuSO 4), Un toxique de référence.
Cette méthode a été développée pour fournir un test approprié, à base de microorganisme pour l'évaluation écotoxique des polluants / composés chimiques, y compris les contaminants émergents tels que les nanomatériaux. La nouveauté de ce protocole par rapport aux méthodes existantes utilisées pour les microorganismes est principalement liée au milieu d'exposition et au point final. En fait, l'exposition est effectuée dans une solution saline, en évitant toute interférence possible du milieu de croissance avec les contaminants étudiés, ce qui peut influencer la réponse biologique 8 . Le critère d'évaluation est la réduction de la culture bactérienne, qui peut être facilement comparée à d'autres paramètres aigus utilisés pour le dépistage écotoxicologique dans les milieux marins et saumâtres, en fonction de la survie / mortalité. En outre, le protocole utilise la technique des micro-comptages liquides à la plaque, déjà utilisés sur E. coli 9 , réduisant les volumes et donc l'eff expérimentalOrt (voir les étapes 3.3 et 3.4 du protocole pour plus de détails).
Protocol
1. Préparation des réactifs / matériaux
- Préparer (environ 300) tubes stériles de 1,5 mL pour la dilution en série des suspensions bactériennes, ainsi que 15 ml de tubes stériles comme récipients d'essai étiquetés avec les concentrations d'essai.
- Préparez 2% de solution de NaCl comme milieu d'exposition et stérilisez-la. Alternativement, utilisez de l'eau de mer stérile ou naturelle stérilisée, avec une salinité allant de 5 à 40.
- Préparer un milieu de croissance à l'agar tryptique de soja (TSA) avec 2% de NaCl selon les indications de l'étiquette et compte tenu de la quantité de NaCl déjà présente dans le milieu.
- Verser le TSA (frais mais toujours liquide) dans les plats de Petri de 90 mm préalablement étiquetés avec la concentration d'essai et le temps d'exposition, le nombre de réplication et le facteur de dilution; 19 mL est un volume approprié.
- Préparer le milieu de croissance tryptique de bouillon de soja (TSB) selon les indications de l'étiquette. Ajouter la quantité appropriée de NaCl pour obtenir la même salinité que le milieu d'exposition.
- PréparerUne solution mère de CuSO 4 avec de l'eau double-distillée et stérilise l'aliquote (nécessaire) en utilisant un filtre à seringue de 0,22 μm. Dans le cas d'échantillons environnementaux, préparer un intervalle approprié de dilutions de l'échantillon et les stériliser à l'aide d'un filtre à seringue de 0,22 μm.
- Préparez les solutions d'essai dans les tubes de 15 mL étiquetés avec les concentrations d'essai. Remplissez le témoin négatif avec 5 ml du milieu d'exposition (2% de NaCl). Remplissez les autres tubes avec la quantité appropriée de milieu d'exposition et la solution stock de CuSO 4 pour obtenir les concentrations d'essai dans un volume final de 5 mL.
2. Préparation de l'inoculum bactérien
- 12-18 h avant le test, préparer une culture fraîche liquide de Vibrio anguillarum . À l'aide d'une boucle stérile, sélectionnez une seule colonie bien isolée d'une culture de nuit sur un milieu solide (TSA). Inoculer un tube rempli de 10 ml de TSB et incuber la culture bactérienne à 25 ° C pendant 12 à 18 h. Après 12-18 h, estimer la concentration bactérienne de l'inoculum par spectrophotométrie. Vortex l'inoculum et mesure la densité optique à une longueur d'onde de 600 nm, en utilisant le TSB en blanc.
- Pour obtenir une concentration bactérienne connue, diluer 2 mL de l'inoculum vortexé en ajoutant la quantité de TSB calculée selon cette formule:
TSB mL = [(OD / 0.14) * 2] - 2. - Vérifiez que la densité optique de l'inoculum dilué est de 0,140 (± 0,005), ce qui correspond à 0,5 point sur la norme néphélométrique McFarland.
- Centrifuger l'inoculum dilué pendant 10 min à 3 000 g . Éliminer le surnageant et ré-suspendre le culot microbien dans 1 mL de solution à 2% de NaCl (milieu d'exposition).
3. Test d'exposition
- Ajouter 150 μL de l'inoculum bactérien ré-suspendu à chaque tube, y compris le contrôle. Incuber les suspensions de V. anguillarum pendant 6 h à 25 ° C sous l'obscurité et en continuouTremble pour éviter la sédimentation.
- Au début (T 0 ) et à la fin (T 6 ) du temps d'exposition, effectuer le dépistage bactérien dans toutes les suspensions bactériennes exposées en utilisant des méthodes de comptage d'unités de formation de colonies (CFU).
- Préparez les dilutions en série de chaque suspension bactérienne exposée en trois exemplaires, en appliquant un facteur de dilution de dix fois (jusqu'à 10 -5 ). Ajouter 100 μL de chaque suspension bactérienne au tube correspondant déjà rempli de 900 μl de milieu d'exposition (2% de NaCl). Procédez avec la dilution en série, tourbillonnant à chaque étape pour ré-suspendre les bactéries.
- Placer 10 μL des dilutions 10 -4 et 10 -5 sur des boîtes de Petri TSA dans le segment correspondant. Laissez rapidement tomber les gouttes dans un petit cercle en tournant la plaque. Incuber les plaques à 25 ° C pendant 48 h.
4. Comptage CFU
- Après 48 h, comptez les colonies cultivées sur les plats de Petri; Plats abritant bEntre 5 et 50 colonies sont optimales pour un comptage précis.
- Calculer le nombre de bactéries viables par mL de chaque suspension bactérienne exposée en appliquant les formules suivantes:
10 -4 → CFU / mL = n ° CFU x 100 x 10 000
10 -5 → CFU / mL = n ° CFU x 100 x 100 000 - Utilisez la moyenne des comptes obtenus dans les répliques parallèles pour évaluer la mortalité par rapport au contrôle. Calculez la mortalité en pourcentage avec la formule suivante:
M% = 100 - [(N / C) * 100]
NOTE: Lorsque N = nombre de CFU / mL cultivé après l'exposition au toxique; C = nombre d'UFC cultivées dans le milieu témoin. - Calculer la LC 50 ( c.-à-d. La concentration de toxine qui réduit le nombre de bactéries réactivant activement de 50% par ml, CFU / mL) avec une analyse de régression non linéaire en utilisant un logiciel statistique approprié (voir la table des matières). Exécuter une analyse de variance (ANOVA) à sens uniqueDû par des tests t-shirts post-hoc pour évaluer les différences significatives entre les traitements.
Representative Results
Les résultats de trois essais indépendants d'exposition de V. anguillarum à quatre concentrations de CuSO 4 montrent une relation dose-réponse claire et une diminution significative des bactéries se reproduisant activement et formant des colonies avec une concentration croissante de toxine de référence ( Figure 1 , ANOVA, F = 20,28, p <0,001). Le nombre de CFU / mL est significativement réduit à 1,25 mg / L (test post-hoc de Tukey, p <0,05) par rapport au contrôle (CNTR). Toutes les bactéries cultivables ont été détectées à la plus haute concentration testée. Aucune différence dans la toxicité du CuSO 4 n'a été trouvée le long de la large gamme de salinité du milieu d'exposition ( c.-à-d., 5, 20 ou 35 g / L de NaCl, données non présentées). Une sortie représentative de l'analyse statistique montrant la régression non linéaire est rapportée dans la Figure 1 supplémentaire . Les valeurs LC 50 calculées pour les trois essais indépendants (<Forte> Tableau 1) met en évidence la faisabilité et la reproductibilité de cette méthode.
Figure 1: Vibrio anguillarum exposé au CuSO 4. Le nombre moyen de CFU / mL (CFU = unité formant une colonie) exposé à une concentration différente de CuSO 4 pendant 6 h. Les valeurs représentent la moyenne (± SD) de trois essais indépendants. Les réductions de bactéries qui se reproduisent activement et forment des colonies par rapport au contrôle (CNTR) sont indiquées dans les cases jaunes (en pourcentage). Des différences significatives avec le contrôle, basées sur un test post-hoc de Tukey, sont indiquées par des astérisques (* = p <0,05; ** = p <0,01). Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Tableau 1: Valeurs de concentration létale (LC 50 ) pour Vibrio anguillarum exposé au CuSO 4 . Les résultats de trois essais et moyens indépendants (± DE) sont rapportés.
Figure 1 supplémentaire: analyse de régression non linéaire. Production représentative d'une analyse de régression non linéaire (modèle Logit-Hill) effectuée sur les résultats du test. Cliquez ici pour télécharger ce chiffre.
Discussion
Ce travail décrit un nouvel essai biologique avec la bactérie marine V. anguillarum qui a été appliquée avec succès pour évaluer les effets toxiques du CuSO 4 , un toxique de référence, démontrant une relation dose-réponse claire. La bactérie marine V. anguillarum a été choisie comme organisme modèle car elle est halotolérante, omniprésente et représentative des écosystèmes marins.
Le test peut être effectué à une large gamme de valeurs de salinité (5-40) et peut utiliser des solutions salines et des eaux de mer synthétiques ou naturelles comme milieu d'exposition, pour autant que les microorganismes puissent survivre facilement pendant toute la durée de l'essai. Cela permet d'analyser différents types d'échantillons, y compris les environnements saumâtres et marins.
Aucun milieu de croissance n'est nécessaire pendant la phase d'exposition, en évitant son interférence avec les contaminants 8 et son influence possible sur la réponse biologique. ThLe protocole e est fiable, rapide, rentable et relativement simple. La procédure des micro-comptages liquides à la plaque 9 donne l'avantage d'utiliser de petits volumes (échantillons), bien que cela implique un haut degré de précision et de robustesse. Les résultats des trois essais et répétitions indépendants pour chaque traitement montrent la grande répétabilité de cette méthode. L'utilisation de la bactérie comme modèle biologique, ainsi que l'adaptabilité de la technique, favorisent la pertinence écologique et environnementale de cette procédure. D'autres problèmes techniques essentiels sont la précision dans la préparation de l'inoculum bactérien et la stérilité requise dans certaines étapes de la procédure.
Le test proposé est plus rapide (6 h) que les autres tests écotoxicologiques marins (24 à 96 h) et ne soulève pas les problèmes éthiques résultant de l'utilisation d'organismes supérieurs. En outre, les données sur le toxique de référence montrent des valeurs de LC 50 comparables à celles obtenues avec t aiguë Sur d'autres espèces marines 10 , 11 , démontrant une bonne sensibilité. Parmi les essais biologiques bactériens, le test d'inhibition de la luminescence V. fischeri est le plus fréquent et bien standardisé 12 . Cet essai biologique est très rapide (15 à 30 minutes) et valable pour tester des échantillons en phase solide, mais il peut être affecté par des échantillons colorés et turbides qui interfèrent avec les mesures de luminescence. La salinité est un facteur limitant dans l'utilisation de l'essai précité, avec 2% de NaCl requis 13 . Au contraire , le test proposé ici avec V. anguillarum donne des résultats abordables à une large gamme de valeurs de salinité, n'a pas de limites en ce qui concerne les échantillons turbides ou colorés et nécessite un équipement moins coûteux par rapport aux analyseurs de luminescence. Une comparaison entre les résultats de notre étude et ceux disponibles dans la littérature pour V. fisheri 14 ,Ss = "xref"> 15 , 16 montre des valeurs EC 50 comparables, ce qui confirme l'efficacité de cet essai biologique.
Cet essai biologique évalue la réduction de la culture bactérienne, généralement appelée mortalité, au lieu du taux de croissance de la population ou de l'inhibition de l'activité enzymatique, qui sont utilisés dans les tests actuellement disponibles pour les microorganismes. Le calcul LC 50 permet une comparaison avec d'autres bioensaiements couramment appliqués à l'évaluation écotoxicologique des milieux marins, qui ont souvent la survie / mortalité comme point final. Un exercice d'interétalonnage est urgent pour évaluer / confirmer la fiabilité et la reproductibilité de ce test et pour soutenir sa standardisation et son utilisation dans les protocoles réglementaires.
L'utilisation croissante des nanomatériaux et leur libération potentielle dans l'environnement impliquent la nécessité d'une évaluation des risques 17 . Cependant, clasLes approches socioéconomiques (éco) toxicologiques pour ces contaminants émergents semblent ne pas donner des résultats abordables et peuvent nécessiter des adaptations 18 . Les caractéristiques de ce nouvel essai biologique permettent leur application facile et utile à l'évaluation de la toxicité des nanoparticules. En fait, la possibilité d'effectuer le dosage à des salinités différentes donnera des comptes sur le comportement des nanoparticules sous différentes forces ioniques, une variable de paramètre environnemental qui peut affecter de manière significative la toxicité 19 . En outre, aucune évaluation de l'écotoxicité des nanoparticules n'est recommandée dans le cas des nanoparticules, car les substances organiques peuvent faciliter leur absorption en augmentant les effets toxiques 20 ou peuvent provoquer une agrégation, en réduisant la fraction biodisponible et donc leur toxicité 21 .
En conclusion, l'essai biologique sur Vibrio anguillarum est apPour l'évaluation des risques des contaminants classiques et émergents, ainsi que pour l'évaluation du statut des milieux marins et saumâtres.
Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont pas d'intérêts financiers concurrents.
Acknowledgments
Ce travail a été financé par le projet de recherche: "NanoBioTech ambiente e salute. Progetto 2: Ambiente. Strumenti e metodi per il surveaggio ecotossicologico delle Nanoparticelle" ( "Nano-BioTechnology: environnement et santé. Projet 2: Environnement. Outils et méthodes pour l'écotoxicologie Suivi des nanoparticules " ) accordé à LM de Regione Lazio-Consorzio Hypatia. AR a été financé par une subvention postdoctorale de l'Université de Tor Vergata / Regione Lazio-Consorzio Hypatia dans le cadre du projet précédemment cité. Un accord avec l'Université ISPRA-Tor Vergata (N. 2015/52857) a permis l'utilisation mutuelle des installations et des échanges de chercheurs.
Les auteurs sont redevables à la Professeure Maria Cristina Thaller, notre ange gardienne pour toutes les activités microbiennes, pour susciter l'intérêt pour le monde microbien et pour aider à améliorer nos recherches sur le sujet. Les auteurs remercient Andrea Tornambè et EriKa Magaletti pour la collaboration précieuse avec le laboratoire ISPRA de l'écologie et de l'écotoxicologie du phytoplancton.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vibrio anguillarum (strain AL 102, serotype O1) | Obtained from the laboratory collection of NOIFMA (Norway) | ||
| Tryptic Soy Agar | Liofilchem | 610052 | Dehydrated Culture Media |
| Tryptic Soy Broth growth medium | Liofilchem | 610053 | Dehydrated Culture Media |
| CuSO4·5H2O | Sigma-Aldrich | 209198 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S-3014 | |
| Name of Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Biosafety Laminar Flow Hood | ESCO | ||
| Incubator | Fratelli Galli | Mod. 2100 | |
| Name of Software | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Benchmark Dose Software | US EPA | Benchmark Dose 2.4.0 | 2012 |
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