Summary
Questo lavoro descrive un nuovo protocollo per valutare l'ecotossicità degli inquinanti, compresi i contaminanti emergenti come i nanomateriali, utilizzando il batterio marino Vibrio anguillarum . Questo metodo consente di determinare la LC 50 o la mortalità, la concentrazione che causa una diminuzione del 50% della colturabilità dei batteri, dopo un'esposizione di 6 ore.
Abstract
I batteri sono una componente importante dell'ecosistema, e le alterazioni microbiche della comunità possono avere un effetto significativo sui cicli biogeochemici e sulle reti alimentari. I test di tossicità basati sui microrganismi sono ampiamente usati perché sono relativamente rapidi, riproducibili, economici e non sono associati a problemi etici. Qui descriviamo un metodo ecotossicologico per valutare la risposta biologica del batterio marino Vibrio anguillarum. Questo metodo valuta la tossicità acuta dei composti chimici, compresi nuovi contaminanti come nanoparticelle, così come campioni ambientali. L'endpoint è la riduzione della coltura batterica ( cioè la capacità di replicare e formare colonie) a causa dell'esposizione a un tossicodipendente. Questa riduzione può essere generalmente definita come mortalità. La prova consente la determinazione del LC 50 , la concentrazione che provoca una diminuzione del 50% dei batteri che replicano attivamente e formano colonie dopoUn'esposizione di 6 ore. I batteri coltivabili vengono contati in termini di unità di formazione della colonia (CFU) e la "mortalità" viene valutata e confrontata con il controllo. In questo lavoro è stata valutata la tossicità del solfato di rame (CuSO 4 ). È stata osservata una chiara relazione dose-risposta, con un LC 50 medio di 1,13 mg / L, dopo tre test indipendenti. Questo protocollo, rispetto ai metodi esistenti con i microrganismi, è applicabile in una più ampia gamma di salinità e non ha limitazioni per campioni colorati / torbidi. Utilizza la soluzione salina come mezzo di esposizione evitando eventuali interferenze di terreno di crescita con i contaminanti studiati. Il calcolo del LC 50 facilita i confronti con altri biomassaggi comunemente applicati alle valutazioni ecotossicologiche dell'ambiente marino.
Introduction
I test biologici ecotossicologici valutano la tossicità di sostanze chimiche o campioni ambientali con modelli biologici standard, integrando gli effetti degli stress fisici, chimici e biologici sugli ecosistemi. A causa della complessità degli ecosistemi, le valutazioni dei rischi ecotossicologici devono considerare una batteria di biosaggi che coinvolgono organismi provenienti da diversi livelli trofici. I test di tossicità sugli animali da laboratorio possono essere costosi, richiedono molto tempo e sono eticamente discutibili. L'obiettivo di limitare i test sugli animali e sviluppare approcci alternativi ( ad esempio, su batteri e animali non vertebrati) è ormai una questione fondamentale, come riportato nel quadro dell'attuale legislazione europea, tra cui la direttiva UE sulla protezione degli animali, il 7 ° emendamento Direttiva cosmetica dell'UE e REACH.
I crostacei, i pesci e le alghe sono ampiamente utilizzati per misure di tossicità nell'ambiente marino 1 . I batteri sono un componente importanteT dell'ecosistema e le alterazioni delle comunità microbiche possono avere effetti significativi sul ciclo biogeochimico e sugli altri servizi ecosistemici critici. I test di tossicità basati sui microrganismi stanno guadagnando popolarità perché sono relativamente rapidi, riproducibili e poco costosi e non sollevano questioni etiche 2 . Lo scopo di questo lavoro è quello di descrivere un protocollo ecotossicologico per valutare la risposta del batterio marino Vibrio anguillarum ( Listonella anguillarum, Vibrionaceae) quando è esposto a contaminanti ambientali.
V. anguillarum è un batterico a forma di curva a forma di curva gram-negativo (0,5 x 1,5 μm) con un flagello polare. Tipicamente trovato in acqua salmastra o salata, è halotolerante, con una salinità ottimale di circa 20 e una temperatura ottimale tra 25 e 30 ° C 3 . È stato scelto come un modello di organismo a causa della sua ubiquità e dei suoi importanti ruoli ecologici in oceanoAns in tutto il mondo 4 . Alcuni sierotipi di V. anguillarum sono noti per causare vibriosi in una varietà di specie di pesci marini o salmastre 5 , 6 . A tal fine, alcune fasi dell'esperimento richiedono pratiche microbiologiche standard, ma non sono necessarie speciali attrezzature di sicurezza o precauzioni. Il protocollo di prova di tossicità proposto utilizza la coltura batterica ( cioè la capacità di replicare e formare colonie) come endpoint e consente la determinazione del LC 50 , la concentrazione che causa una riduzione del 50% dei batteri che replicano attivamente e formano colonie dopo Un esposizione di 6 ore. In Vibrio , come in altri microbi, questa riduzione, che generalmente indichiamo come mortalità, può essere parzialmente dovuta agli individui nella fase 7 vitale ma non culturabile (VBNC). In questo studio abbiamo applicato questo metodo per misurare gli effetti tossici del solfato di rame (CuSO 4), Un tossico di riferimento.
Questo metodo è stato sviluppato per fornire un test idoneo a base di microrganismi per la valutazione ecotossica degli inquinanti / composti chimici, compresi i contaminanti emergenti quali i nanomateriali. La novità di questo protocollo rispetto ai metodi esistenti utilizzati per i microrganismi è principalmente correlata al mezzo di esposizione e all'endpoint. Infatti, l'esposizione viene effettuata in soluzione salina, evitando eventuali interferenze del mezzo di crescita con i contaminanti studiati, che possono influenzare la risposta biologica 8 . L'endpoint è la riduzione della coltura batterica, che può essere facilmente confrontata con altri endpoint acuti utilizzati per lo screening ecotossicologico in ambienti marini / salmastri, basati sulla sopravvivenza / mortalità. Inoltre, il protocollo utilizza la tecnica dei micro-contatori liquidi a piastre, già utilizzati per E. coli 9 , riducendo i volumi e quindi l'effOrt (vedere i punti 3.3 e 3.4 del protocollo per i dettagli).
Protocol
1. Preparazione di reagenti / materiali
- Preparare (circa 300) tubi sterili da 1,5 ml per la diluizione in serie di sospensioni batteriche, nonché 15 ml di tubi sterili come contenitori di prova etichettati con le concentrazioni di prova.
- Preparare la soluzione al NaCl di 2% come mezzo di esposizione e sterilizzarla. In alternativa, utilizzare acqua di mare sintetica o naturale sterilizzata, con salinità variabile da 5 a 40.
- Preparare il substrato di crescita TSA con 2% di NaCl secondo le indicazioni dell'etichetta e considerando la quantità di NaCl già presente nel mezzo.
- Versare il TSA (fresco ma ancora liquido) nei piatti Petri da 90 mm precedentemente etichettati con la concentrazione di prova e il tempo di esposizione, il numero di replicazione e il fattore di diluizione; 19 mL è un volume appropriato.
- Preparare il medium di crescita del brodo di soia (tryptic soy broth, TSB) secondo le indicazioni della etichetta. Aggiungere la quantità appropriata di NaCl per ottenere la stessa salinità del mezzo di esposizione.
- PreparareUna soluzione di riserva CuSO 4 con acqua doppia distillata e sterilizzare l'aliquota (necessaria) usando un filtro da 0,22 μm di siringa. In caso di campioni ambientali, preparare un intervallo appropriato di diluizioni del campione e sterilizzarle utilizzando un filtro da 0,22 μm.
- Preparare le soluzioni di prova nei tubi da 15 mL etichettati con le concentrazioni di prova. Riempire il controllo negativo con 5 ml del mezzo di esposizione (2% NaCl). Riempire gli altri tubi con la quantità appropriata di media di esposizione e la soluzione di riserva CuSO 4 per ottenere le concentrazioni di prova in un volume finale di 5 mL.
2. Preparazione dell'inoculo batterico
- 12-18 h prima della prova, preparare una coltura liquida fresca di Vibrio anguillarum . Usando un ciclo sterile, selezionare una colonia singola e ben isolata da una coltura durante la notte su un mezzo solido (TSA). Inoculare un tubo riempito con 10 ml di TSB e incubare la coltura batterica a 25 ° C per 12-18 h. Dopo 12-18 h, stimare la concentrazione batterica dell'inoculo spettrofotometrico. Vortex l'inoculo e misurare la densità ottica a lunghezza d'onda di 600 nm, usando TSB come vuoto.
- Per ottenere una concentrazione batterica nota, diluire 2 mL dell'inoculo vortex aggiungendo la quantità di TSB calcolata da questa formula:
TSB mL = [(OD / 0,14) * 2] - 2. - Verificare che la densità ottica dell'inoculo diluito sia di 0,140 (± 0,005), che corrisponde al 0,5 punti dello standard nephelometrico McFarland.
- Centrifugare l'inoculo diluito per 10 min a 3.000 g . Eliminare il surnatante e ri-sospendere il pellet microbico in 1 mL di soluzione NaCl del 2% (mezzo di esposizione).
3. Testare l'esposizione
- Aggiungere 150 μL di inoculo batterico ri-sospeso ad ogni tubo, compreso il controllo. Incubare le sospensioni V. anguillarum per 6 ore a 25 ° C sotto oscurità e continuitàS scuotendo per evitare la sedimentazione.
- All'inizio (T0) e alla fine (T 6 ) del tempo di esposizione, eseguire il conteggio batterico in tutte le sospensioni batteriche esposte utilizzando i metodi di conteggio della colonia (CFU).
- Preparare le diluizioni seriali di ogni sospensione batterica esposta in triplice copia, applicando un fattore di diluizione di dieci volte (fino a 10 -5 ). Aggiungere 100 μL di ogni sospensione batterica al tubo corrispondente già riempito con 900 μL di mezzo di esposizione (2% NaCl). Procedere con la diluizione seriale, vorticando ad ogni passo per riattivare i batteri.
- Piastra 10 μL delle diluizioni 10 -4 e 10 -5 su piatti TSA Petri nel segmento corrispondente. Rapidamente lasciare scorrere le gocce in un piccolo cerchio ruotando la piastra. Incubare le piastre a 25 ° C per 48 h.
4. Conteggio CFU
- Dopo 48 ore contate le colonie coltivate sui piatti di Petri; Piastre che ospitano bTra 5 e 50 colonie sono ottimali per il conteggio preciso.
- Calcolare il numero di batteri vitali per ml di ciascuna sospensione batterica esposta applicando le seguenti formule:
10 -4 CFU / mL = n ° CFU x 100 x 10.000
10 -5 CFU / mL = n ° CFU x 100 x 100.000 - Utilizzare la media dei conteggi ottenuti in repliche parallele per valutare la mortalità rispetto al controllo. Calcolare la percentuale di mortalità con la seguente formula:
M% = 100 - [(N / C) * 100]
NOTA: dove N = numero di CFU / mL cresciuti dopo l'esposizione al tossicodipendente; C = numero di CFU coltivate nel mezzo di controllo. - Calcolare il LC 50 ( cioè la concentrazione di tossicità che riduce il numero di batteri attivi replicanti del 50% per ml; CFU / mL) con analisi di regressione non lineare utilizzando un software statistico appropriato (vedere la tabella dei materiali). Esegui un'analisi univoca di varianza (ANOVA)Dovuto da t-test post-hoc a coppia per valutare le differenze significative tra i trattamenti.
Representative Results
I risultati di tre studi indipendenti di esposizione di V. anguillarum a quattro concentrazioni di CuSO4 mostrano una chiara relazione dose-risposta e una significativa diminuzione di batteri che replicano attivamente e formano colonie con una concentrazione crescente del tossico di riferimento ( Figura 1 ; ANOVA, F = 20,28, p <0,001). Il numero di CFU / mL è significativamente ridotto a 1,25 mg / L (test Tukey post-hoc, p <0,05) rispetto al controllo (CNTR). Tutti i batteri coltivabili sono stati rilevati alla concentrazione massima misurata. Non sono state riscontrate differenze nella tossicità CuSO 4 lungo l'ampia gamma di salinità del mezzo di esposizione ( cioè 5, 20 o 35 g / L NaCl, dati non mostrati). Un'uscita rappresentativa dell'analisi statistica che mostra la regressione non lineare è riportata nella Figura 1 supplementare . I valori LC 50 calcolati per i tre studi indipendenti (<Forte> Tabella 1) evidenzia la fattibilità e la riproducibilità di questo metodo.
Figura 1: Vibrio anguillarum esposto a CuSO 4. Il numero medio di CFU / mL (CFU = unità di formazione della colonia) esposto a diverse concentrazioni di CuSO 4 per 6 ore. I valori rappresentano la media (± SD) di tre prove indipendenti. Le riduzioni di batteri che replicano attivamente e formano colonie rispetto al controllo (CNTR) sono riportate nelle caselle gialle (come percentuali). Le differenze significative con il controllo, basate su un test post-hoc di Tukey, sono indicate con asterischi (* = p <0.05; ** = p <0.01). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Tabella 1: valori di concentrazione letale (LC 50 ) per Vibrio anguillarum esposti a CuSO 4 . Sono stati riportati risultati di tre prove e mezzi indipendenti (± SD).
Supplementare Figura 1: Analisi della regressione non lineare. Produzione rappresentativa di un'analisi di regressione non lineare (modello Logit-Hill) eseguita sui risultati del test. Clicca qui per scaricare questa figura.
Discussion
Questo lavoro descrive una nuova analisi biologica con il batterio V. anguillarum marino che è stato applicato con successo per valutare gli effetti tossici di CuSO 4 , un tossico di riferimento, dimostrando una chiara relazione dose-risposta. Il batterio marino V. anguillarum è stato scelto come organismo modello perché è halotolerante, onnipresente e rappresentativo degli ecosistemi marini.
Il test può essere eseguito in una vasta gamma di valori di salinità (5-40) e può utilizzare soluzioni saline e acque marine sintetiche o naturali come mezzo di esposizione, a patto che i microrganismi possano sopravvivere facilmente per tutta la durata dell'intero test. Ciò consente l'analisi di diversi tipi di campioni, inclusi gli ambienti salmastri e marini.
Durante la fase di esposizione non è richiesto alcun mezzo di crescita, evitando la sua interferenza con i contaminanti 8 e la sua possibile influenza sulla risposta biologica. thIl protocollo è affidabile, veloce, conveniente e relativamente facile. La procedura dei micro-contatori liquidi a piastre 9 offre il vantaggio di utilizzare piccoli volumi (campioni), anche se ciò implica un alto grado di precisione e robustezza. I risultati dei tre trial indipendenti e replicati per ogni trattamento mostrano l'alta ripetibilità di questo metodo. L'uso del batterio come modello biologico, nonché l'adattabilità della tecnica, favoriscono l'importanza ecologica e ambientale di questa procedura. Altri problemi critici tecnici sono l'accuratezza nella preparazione dell'inoculo batterico e della sterilità necessaria in alcuni passaggi della procedura.
Il test proposto è più rapido (6 h) rispetto ad altri esami ecotossicologici marini (24-96 h) e non solleva i problemi etici derivanti dall'utilizzo di organismi superiori. Inoltre, i dati sulla tossicità di riferimento mostrano i valori di LC 50 comparabili a quelli ottenuti con t acuti Est su altre specie marine 10 , 11 , che dimostrano una buona sensibilità. Tra i biomassaggi batterici, il test di inibizione della luminescenza V. fischeri è il più comune e ben standardizzato 12 . Questo biosaggio è molto rapido (15-30 min) e valido per la prova di campioni di fase solida, ma può essere influenzato da campioni colorati e torbidi che interferiscono con le misurazioni della luminescenza. La salinità è un fattore limitante nell'uso del suddetto test, con il 2% di NaCl richiesto 13 . Al contrario , la prova proposta qui con V. anguillarum fornisce risultati economici a una vasta gamma di valori di salinità, non ha limitazioni nei campioni turbosi o colorati e richiede apparecchiature meno costose rispetto agli analizzatori di luminescenza. Un confronto tra i risultati del nostro studio e quelli disponibili in letteratura per V. fisheri 14 ,Ss = "xref"> 15 , 16 mostra valori comparabili EC50, sostenendo ulteriormente l'efficacia di questa biotest.
Questo bioassay valuta la riduzione della coltura batterica, generalmente definita come mortalità, anziché il tasso di crescita della popolazione o l'inibizione dell'attività enzimatica, utilizzati nelle prove attualmente disponibili per i microrganismi. Il calcolo LC 50 consente di confrontare con altri biomassaggi comunemente applicati alla valutazione ecotossicologica degli ambienti marini, che spesso hanno la sopravvivenza / mortalità come endpoint. È urgentemente necessaria un'istruzione di intercalibrazione per valutare / confermare l'affidabilità e la riproducibilità di questo test e per supportarne la standardizzazione e l'uso nei protocolli di regolazione.
L'uso crescente dei nanomateriali e la loro potenziale liberazione nell'ambiente implicano la necessità di una valutazione del rischio 17 . Tuttavia, clasGli approcci tossicologici (eco) tossicologici per questi contaminanti emergenti sembrano non dare risultati economici e potrebbero richiedere alcuni adeguamenti 18 . Le caratteristiche di questa nuova biomassa consentono la sua facile e utile applicazione alla valutazione della tossicità delle nanoparticelle. Infatti, la possibilità di effettuare il dosaggio a diverse salinità darà conto dei comportamenti di nanoparticelle sotto differenti forze ioniche, una variabile di parametri ambientali che può influenzare notevolmente la tossicità 19 . Inoltre, nelle valutazioni di ecotossicità delle nanoparticelle non è particolarmente indicato l'impiego di mezzi di crescita e di sostanze nutritive perché le sostanze organiche possono facilitare il loro assorbimento aumentando gli effetti tossici 20 o possono causare l'aggregazione, riducendo la frazione biodisponibile e quindi la loro tossicità 21 .
In conclusione, il bioassay su Vibrio anguillarum è apStrumento romising per la valutazione dei rischi di contaminanti classici e emergenti, nonché per la valutazione dello stato degli ambienti marini e salmastri.
Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato dal progetto di ricerca: "NanoBioTech ambiente e salute Progetto 2: Ambiente Strumenti e metodi per il monitoraggio ecotossicologico delle nanoparticelle" ( "Nano-BioTechnology: ambiente e salute" Progetto 2: Ambiente Strumenti e metodi per ecotossicologici Monitoraggio delle nanoparticelle " ) concesso a LM dalla Regione Lazio-Consorzio Hypatia. AR è stato finanziato da una borsa post-dottorale dell'Università di Tor Vergata / Regione Lazio-Consorzio Hypatia nell'ambito del progetto citato in precedenza. Un accordo con l'Università ISPRA-Tor Vergata (N. 2015/52857) ha consentito l'uso reciproco delle strutture e lo scambio di ricercatori.
Gli autori sono indebitati del prof. Maria Cristina Thaller, nostro angelo custode per tutte le attività microbiche, per sensibilizzare l'interesse sul mondo microbico e per aiutare fortemente a migliorare la nostra ricerca sul tema. Gli autori riconoscono con gratitudine Andrea Tornambè e EriKa Magaletti per la preziosa collaborazione con l'ISPRA Lab of Phytoplankton ecologia e ecotossicologia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vibrio anguillarum (strain AL 102, serotype O1) | Obtained from the laboratory collection of NOIFMA (Norway) | ||
| Tryptic Soy Agar | Liofilchem | 610052 | Dehydrated Culture Media |
| Tryptic Soy Broth growth medium | Liofilchem | 610053 | Dehydrated Culture Media |
| CuSO4·5H2O | Sigma-Aldrich | 209198 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S-3014 | |
| Name of Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Biosafety Laminar Flow Hood | ESCO | ||
| Incubator | Fratelli Galli | Mod. 2100 | |
| Name of Software | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Benchmark Dose Software | US EPA | Benchmark Dose 2.4.0 | 2012 |
References
- Guidance on information requirements and chemical safety assessment. , ECHA (European CHemicals Agency). Available from: http://guidance.echa.europa.au/docs/guidance document/information (2008).
- Parvez, S., Venkataraman, C., Mukherji, S. A review on advantages of implementing luminescence inhibition test (Vibrio fischeri) for acute toxicity prediction of chemicals. Environm. Internat. 32 (2), 256-268 (2006).
- Rad, M., Shahsavani, D. Isolation and characterization of Vibrio (Listonella) anguillarum from catfish. Turkish J. Veter. Animal. 34 (4), 413-415 (2010).
- Thompson, F., Iida, T., Swings, J. Biodiversity of Vibrios. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 68, 403-431 (2004).
- Austin, B., Austin, D. A. Vibrionaceae representatives: characteristics of the disease. Bacterial Fish Pathogens: Disease of Farmed and Wild Fish. 29-30, Springer-Praxis. Chichester, UK. 108-115 (1999).
- Larsen, J. L., Mellergaard, S. Microbiological and hygienic problems in marine aquaculture: furunculosis and vibriosis in rainbow trout (Salmo gairdneri). L.). Bull. Eur. Assoc. Fish Pathol. 1, 29-31 (1981).
- Oliver, J. D. The viable but nonculturable state in bacteria. J. Microbiol. 43 (1), 93-100 (2005).
- Hsieh, C. -Y., Tsai, M. -H., Ryan, D. K., Pancorbo, O. C. Toxicity of the 13 priority pollutant metals to Vibrio fisheri in the Microtox chronic toxicity test. Sci. Total Environ. 320, 37-50 (2004).
- Migliore, L., Rotini, A., Thaller, M. C. Low doses of Tetracycline trigger the E. coli growth: a case of hormetic response. Dose-Response. 11, 550-557 (2013).
- Adams, M. S., Stauber, J. L. Development of a whole-sediment toxicity test using a benthic marine microalga. Environm. Toxicol. Chem. 23 (8), 1957-1968 (2004).
- Manfra, L., et al. Ecotoxicity of diEthylene Glycol and risk assessment for marine environment. J. Hazard. Mat. 284, 130-135 (2015).
- Microtox® Acute Toxicity Solid-Phase Test. , Azur Environmental. 20 (1995).
- Metodi analitici per le acque. Manuali e Linee Guida (Analytical methods for waters. Manual and Guidelines). Metodi Ecotossicologici (Ecotoxicological methods). 29 (3), APAT IRSA-CNR. 8030 (2003).
- Heinlaan, M., Ivask, A., Blinova, I., Dubourguier, H. -C., Kahru, A. Toxicity of nanosized and bulk ZnO, CuO and TiO2 to bacteria Vibrio fischeri and crustaceans Daphnia magna and Thamnocephalus platyurus. Chemosphere. 71, 1308-1316 (2008).
- Mortimer, M., Kasemets, K., Heinlaan, M., Kurvet, I., Kahru, A. High throughput kinetic Vibrio fischeri bioluminescence inhibition assay for study of toxic effects of nanoparticles. Toxicol. In Vitro. 22 (5), 1412-1417 (2008).
- Bondarenko, O. M., et al. Multilaboratory evaluation of 15 bioassays for (eco) toxicity screening and hazard ranking of engineered nanomaterials: FP7 project NANOVALID. Nanotoxicology. 10 (9), 1229-1242 (2016).
- Matranga, V., Corsi, I. Toxic effects of engineered nanoparticles in the marine environment: model organisms and molecular approaches. Mar. Envir. Res. 76, 32-40 (2012).
- Corsi, I., et al. Common strategies and technologies for the ecosafety assessment and design of nanomaterials entering the marine environment. ACS NANO. 8 (10), 9694-9709 (2014).
- Handy, R. D., von der Kammer, F., Lead, J. R., Hassellöv, M., Owen, R., Crane, M. The ecotoxicology and chemistry of manufactured nanoparticles. Ecotoxicology. 17, 287-314 (2008).
- Kasemets, K., Suppi, S., Kunnis-Beres, K., Kahru, A. Toxicity of CuO nanoparticles to yeast Saccharomyces cerevisiae BY4741 wild-type and its nine isogenic single-gene deletion mutants. Chem. Res. Toxicol. 26, 356-367 (2013).
- Ivask, A., et al. Mechanisms of toxic action of Ag, ZnO and CuO nanoparticles to selected ecotoxicological test organisms and mammalian cells in vitro: A comparative review. Nanotoxicology. 8 (1), 57-71 (2013).
