Summary
I detta arbete beskrivs ett nytt protokoll för att bedöma föroreningarnas ekotoxicitet, inklusive framväxande föroreningar, såsom nanomaterial, med hjälp av den marina bakterien Vibrio anguillarum . Denna metod möjliggör bestämning av LC 50 eller mortalitet, den koncentration som orsakar en 50% minskning av bakteriens kulturbarhet efter en 6 h exponering.
Abstract
Bakterier är en viktig del av ekosystemet, och förändringar i mikrobiella samhällen kan få en signifikant effekt på biogeokemiska cykel- och matbanor. Toxicitetstest baserad på mikroorganismer används allmänt eftersom de är relativt snabba, reproducerbara, billiga och inte förenade med etiska problem. Här beskriver vi en ekotoxikologisk metod för att utvärdera det biologiska svaret hos den marina bakterien Vibrio anguillarum. Denna metod bedömer akut toxicitet hos kemiska föreningar, inklusive nya föroreningar, såsom nanopartiklar, liksom miljöprover. Slutpunkten är minskningen av bakteriell kultivitet ( dvs. förmågan att replikera och bilda kolonier) på grund av exponering för ett giftmedel. Denna minskning kan generellt betecknas som dödlighet. Testet möjliggör bestämning av LC 50 , koncentrationen som orsakar en 50% minskning av bakterier som aktivt replikerar och bildar kolonier, efterEn 6 h exponering. De odlingsbara bakterierna räknas i termer av kolonidannande enheter (CFU), och "dödligheten" utvärderas och jämförs med kontrollen. I detta arbete utvärderades toxiciteten hos kopparsulfat (CuSO 4 ). Ett tydligt förhållande mellan dos och respons observerades, med en genomsnittlig LC 50 på 1,13 mg / l efter tre oberoende tester. Detta protokoll, jämfört med befintliga metoder med mikroorganismer, är tillämpligt i ett bredare salthaltsområde och har inga begränsningar för färgade / grumliga prover. Det använder saltlösning som exponeringsmedium, vilket undviker eventuella interferenser av tillväxtmedium med de undersökta föroreningarna. LC 50- beräkningen underlättar jämförelser med andra bioanalyser som vanligen tillämpas på ekotoxikologiska bedömningar av den marina miljön.
Introduction
Ekotoxikologiska bioanalyser utvärderar toxiciteten hos kemikalier eller miljöprover med vanliga biologiska modeller som integrerar effekterna av fysiska, kemiska och biologiska stressorer på ekosystem. På grund av ekosystemens komplexitet måste ekotoxikologiska riskbedömningar överväga ett batteri av bioanalyser som involverar organismer från olika trofiska nivåer. Toxicitetsanalyser på laboratoriedjur kan vara dyra, tidskrävande och etiskt tvivelaktiga. Drivet att begränsa djurprovning och utveckla alternativa metoder ( t.ex. på bakterier och icke-ryggradsdjur) är nu en avgörande fråga, som rapporterats inom ramen för den nuvarande europeiska lagstiftningen, inklusive EU: s djurskyddsdirektiv, det sjunde ändringsförslaget till EU-kosmetikdirektivet och Reach.
Skaldjur, fisk och alger används till stor del för toxicitetsmätningar i havsmiljön 1 . Bakterier är en viktig komponentT av ekosystemet, och förändringar i mikrobiella samhällen kan få betydande effekter på biogeokemisk cykling och andra kritiska ekosystemtjänster. Toxicitetstest baserad på mikroorganismer ökar popularitet eftersom de är relativt snabba, reproducerbara och billiga och inte ger upphov till etiska problem 2 . Syftet med detta arbete är att beskriva ett ekotoxikologiskt protokoll för att utvärdera svaret på den marina bakterien Vibrio anguillarum ( Listonella anguillarum, Vibrionaceae) vid exponering för miljöföroreningar.
V. anguillarum är en gramnegativ , kort, kurvformad rodbakterie (0,5 x 1,5 μm) med ett polärt flagellum. Det finns vanligen i brack- eller saltvatten, det är halotolerant med en optimal salthalt av ca 20 och en optimal temperatur mellan 25 och 30 ° C 3 . Det har blivit valt som en organismmodell på grund av dess ubiquity och dess viktiga ekologiska roller i oceAns globalt 4 . Vissa serotyper av V. anguillarum är kända att orsaka vibrios i en mängd marina eller bräckliga fiskarter 5 , 6 . För detta kräver vissa steg i försöket standardmikrobiologiska metoder, men ingen speciell säkerhetsutrustning eller försiktighetsåtgärder behövs. Det föreslagna toxicitetsprövningsprotokollet använder bakteriell kulturbarhet ( dvs. förmågan att replikera och bilda kolonier) som slutpunkt och möjliggör bestämning av LC 50 , koncentrationen som orsakar en 50% reduktion av bakterier som aktivt replikerar och bildar kolonier efter En exponering på 6 h. I Vibrio , som i andra mikrober, kan denna reduktion, som vi generellt anger som dödlighet, delvis bero på individer i den livskraftiga men icke-kulturella (VBNC) fasen 7 . I denna studie tillämpade vi denna metod för att mäta de toxiska effekterna av kopparsulfat (CuSO 4), En referens toxicant.
Denna metod utvecklades för att tillhandahålla ett lämpligt, mikroorganismbaserat test för den ekotoxiska bedömningen av föroreningar / kemiska föreningar, inklusive framväxande föroreningar, såsom nanomaterial. Nyheten av detta protokoll jämfört med befintliga metoder som används för mikroorganismer är huvudsakligen relaterat till exponeringsmediet och slutpunkten. I själva verket utförs exponeringen i saltlösning, vilket undviker eventuell störning av tillväxtmediet med de undersökta föroreningarna, vilket kan påverka det biologiska svaret 8 . Slutpunkten är minskningen av bakteriell kultivitet, som lätt kan jämföras med andra akuta ändpunkter som används för ekotoxikologisk screening i marina / bräckliga miljöer, baserat på överlevnad / dödlighet. Vidare använder protokollet tekniken med mikro-räknat vätska-till-platta, som redan användes på E. coli 9 , reducerande volymer och sålunda experimentella effOrt (se steg 3.3 och 3.4 i protokollet för detaljer).
Protocol
1. Framställning av reagenser / material
- Förbered (cirka 300) sterila 1,5 ml rör för seriell utspädning av bakteriella suspensioner, såväl som 15 ml sterila rör som testbehållare märkta med testkoncentrationerna.
- Förbered 2% NaCl-lösning som exponeringsmedium och sterilisera det. Alternativt använd steriliserad syntetisk eller naturlig havsvatten, med salthalt som sträcker sig från 5 till 40.
- Förbered tryptisk soja agar (TSA) tillväxtmedium med 2% NaCl enligt märkningsanvisningarna och med tanke på mängden NaCl som redan finns närvarande i mediet.
- Häll TSA (kall men fortfarande flytande) i 90 mm petriskålarna som tidigare märkts med testkoncentration och exponeringstid, replikatnummer och utspädningsfaktor; 19 mL är en lämplig volym.
- Förbered tryptisk sojabuljong (TSB) tillväxtmedium enligt etikettanvisningarna. Tillsätt lämplig mängd NaCl för att erhålla samma salthalt som exponeringsmediet.
- FörberedaEn CuSO 4 stamlösning med dubbeldestillerat vatten och sterilisera (nödvändig) alikvoten med ett 0,22 μm sprutfilter. Om det gäller miljöprover, beredda ett lämpligt intervall av utspädningar av provet och sterilisera dem med ett 0,2 μm sprutfilter.
- Förbered testlösningarna i 15 ml rören märkta med testkoncentrationerna. Fyll den negativa kontrollen med 5 ml exponeringsmediet (2% NaCl). Fyll de andra rören med lämplig mängd exponeringsmedium och CuSO 4 stamlösning för att erhålla testkoncentrationerna i en 5 ml slutvolym.
2. Bakteriell inokulumberedning
- 12-18 h före provet, bereda en flytande, frisk kultur av Vibrio anguillarum . Använd en steril slinga, välj en enda, isolerad koloni från en övernattningskultur på ett fast medium (TSA). Inokulera ett rör fyllt med 10 ml TSB och inkubera bakteriekulturen vid 25 ° C under 12-18 timmar. Efter 12-18 timmar uppskattar bakteriekoncentrationen av inokulatet spektrofotometriskt. Vortex inokulumet och mäta den optiska densiteten vid 600 nm våglängd, med användning av TSB som blank.
- För att erhålla en känd bakteriekoncentration, späd 2 ml av den virvelade inokulaten genom att tillsätta mängden TSB beräknad med denna formel:
TSB mL = [(OD / 0,14) * 2] - 2. - Kontrollera att den optiska densiteten hos den utspädda ympan är 0,140 (± 0,005), vilket motsvarar 0,5 punkten på McFarlands nephelometriska standard.
- Centrifugera den utspädda ympan i 10 min vid 3000 g . Eliminera supernatanten och suspendera den mikrobiella pelleten i 1 ml 2% NaCl-lösning (exponeringsmedium).
3. Testa exponering
- Tillsätt 150 μl av den återuppslammade bakterieinoculum till varje rör, inklusive kontrollen. Inkubera V. anguillarum- suspensionerna under 6 timmar vid 25 ° C under mörkret och i fortsättningS skakar för att undvika sedimentering.
- Vid början (T 0 ) och slutet (T 6 ) av exponeringstiden, utföra bakteriell räkning i alla de exponerade bakteriella suspensionerna med användning av kolonnbildande enhet (CFU) räkningsmetoder.
- Förbered serieutspädningar av varje exponerad bakteriesuspension i triplicat, applicera en tiofaldig utspädningsfaktor (upp till 10 -5 ). Tillsätt 100 μl av varje bakteriesuspension till motsvarande rör som redan fyllts med 900 μl exponeringsmedium (2% NaCl). Fortsätt med den seriella utspädningen, vortexing vid varje steg för att åter suspendera bakterierna.
- Placera 10 pi av 10 -4 och 10 -5 utspädningarna på TSA Petri-skålar i motsvarande segment. Låt dropparna snabbt glida i en liten cirkel genom att rotera plattan. Inkubera plattorna vid 25 ° C under 48 timmar.
4. CFU Counting
- Efter 48 h, räkna kolonierna som odlas på petriskålarna; Plattor som hyser bMellan 5 och 50 kolonier är optimala för noggrann räkning.
- Beräkna antalet levande bakterier per ml av varje exponerad bakteriesuspension genom att använda följande formler:
10 -4 → CFU / ml = n ° CFU x 100 x 10.000
10 -5 → CFU / ml = n ° CFU x 100 x 100 000 - Använd medelvärdet av de räkningar som erhållits i parallella replikat för att utvärdera mortaliteten jämfört med kontrollen. Beräkna dödligheten i procent med följande formel:
M% = 100 - [(N / C) * 100]
OBS: Där N = antal CFU / mL odlat efter exponeringen för toxicanten; C = antal CFU odlade i kontrollmediet. - Beräkna LC 50 ( dvs koncentrationen av toxicant som minskar antalet aktivt replikerande bakterier med 50% per ml, CFU / mL) med icke-linjär regressionsanalys med hjälp av en lämplig statistisk programvara (se materialtabellen). Kör en enkelriktad analys av varians (ANOVA) follSkyldig i post-hoc parvisa tester för att utvärdera signifikanta skillnader mellan behandlingar.
Representative Results
Resultaten av tre oberoende försök att exponera V. anguillarum i fyra koncentrationer av CuSO 4 visar ett tydligt dosresponsförhållande och en signifikant minskning av bakterier som aktivt replikerar och bildar kolonier med en ökande koncentration av referensgiftigheten ( Figur 1 , ANOVA, F = 20,28, p <0,001). Antalet CFU / mL reduceras signifikant vid 1,25 mg / l (post-hoc Tukey test, p <0,05) jämfört med kontroll (CNTR). Eventuella odlingsbara bakterier detekterades vid den högsta koncentrationen som testades. Inga skillnader i CuSO 4- toxicitet hittades längs exponeringsmediumets brett salthaltområde ( dvs. 5, 20 eller 35 g / liter NaCl, data ej visade). En representativ effekt av den statistiska analysen som visar den icke-linjära regressionen rapporteras i tilläggs figur 1 . LC 50- värdena beräknas för de tre oberoende försöken (<Stark> Tabell 1) framhäva genomförbarheten och reproducerbarheten av denna metod.
Figur 1: Vibrio anguillarum utsatt för CuSO 4. Medelantalet CFU / mL (CFU = kolonidannande enhet) utsatt för olika koncentrationer av CuSO4 i 6 timmar. Värdena representerar medelvärdet (± SD) för tre oberoende försök. Reduktionerna av bakterier som aktivt replikerar och bildar kolonier med avseende på kontrollen (CNTR) rapporteras i de gula rutorna (i procent). Betydande skillnader med kontrollen, baserad på ett Tuhestes test, anges med asterisker (* = p <0,05; ** = p <0,01). Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Tabell 1: Dödlig koncentration (LC 50 ) värden för Vibrio anguillarum utsatt för CuSO 4 . Resultaten av tre oberoende försök och medel (± SD) rapporteras.
Kompletterande Figur 1: Icke-linjär regressionsanalys. Representativ effekt av en icke-linjär regressionsanalys (Logit-Hill-modell) utförd på testresultaten. Vänligen klicka här för att ladda ner den här siffran.
Discussion
I det här arbetet beskrivs en ny bioanalys med den marina bakterien V. anguillarum som framgångsrikt användes för att bedöma de toxiska effekterna av CuSO 4 , en referenstoxicitet, som visar en tydlig dos-respons-relation. Den marina bakterien V. anguillarum valdes som en modellorganisme eftersom den är halotolerant, allestädes närvarande och representativ för marina ekosystem.
Testet kan utföras vid ett brett utbud av salthaltighetsvärden (5-40) och kan använda saltlösningar och syntetiska eller naturliga havsvatten som exponeringsmedium, så länge som mikroorganismer lätt kan överleva under hela testets gång. Detta möjliggör analys av olika slags prov, inklusive bräckliga och marina miljöer.
Inget tillväxtmedium krävs under exponeringsfasen, vilket undviker dess inblandning av föroreningarna 8 och dess möjliga inverkan på det biologiska svaret. thE-protokollet är pålitligt, snabbt, kostnadseffektivt och relativt enkelt. Förfarandet för vätska-till-platta mikro-räkningar 9 ger fördelen att använda små (prov) volymer, även om detta medför en hög grad av noggrannhet och robusthet. Resultaten av de tre oberoende försöken och replikaten för varje behandling visar den höga repeterbarheten av denna metod. Användningen av bakterier som en biologisk modell, liksom teknikkens anpassningsförmåga, gynnar den ekologiska och miljömässiga relevansen av denna procedur. Andra kritiska tekniska problem är noggrannhet vid framställning av det bakteriella inokulatet och den sterilitet som krävs i några steg i förfarandet.
Det föreslagna testet är snabbare (6 h) än andra marina ekotoxikologiska analyser (24-96 h) och ger inte upphov till de etiska problem som följer av användningen av högre organismer. Vidare visar data på referens-toxikanten LC 50- värden som är jämförbara med de som erhållits med akut t Ests på andra marina arter 10 , 11 , som visar en bra känslighet. Bland bakteriella bioassays är V. fischeri luminescensinhiberingstest den vanligaste och väl standardiserade 12 . Denna bioassay är mycket snabb (15-30 min) och gäller för test av fastfasprover, men det kan påverkas av färgade och grumliga prover som stör luminiscensmätningar. Salthalten är en begränsande faktor vid användningen av det ovan nämnda testet, med 2% NaCl som krävs 13 . Tvärtom, det test som föreslås här med V. anguillarum ger överkomliga resultat vid ett brett utbud av salthaltighetsvärden, har inga begränsningar vad gäller grumliga eller färgade prov och kräver billigare utrustning jämfört med luminescensanalysatorerna. En jämförelse mellan resultaten av vår studie och de som finns i litteraturen för V. fisheri 14 ,Ss = "xref"> 15 , 16 visar jämförbara EC 50- värden, ytterligare stödja effektiviteten av denna bioanalys.
Denna bioassay bedömer minskningen av den bakteriella odlingsbarheten, allmänt hänvisad till som mortalitet, i stället för populationstillväxt eller enzymatisk aktivitetshämning, som används i de test som för närvarande finns tillgängliga för mikroorganismer. LC 50- beräkningen möjliggör jämförelse med andra bioanalyser som vanligen tillämpas på den ekotoxikologiska bedömningen av marina miljöer, som ofta har överlevnad / dödlighet som slutpunkt. En interkalibreringsövning är brådskande nödvändig för att utvärdera / bekräfta pålitligheten och reproducerbarheten av detta test och för att stödja dess standardisering och användning i regelprotokoll.
Den ökande användningen av nanomaterial och deras potentiella utsläpp i miljön medför behovet av riskbedömning 17 . Men ClasSical (eco) toxicological approaches för dessa nya föroreningar verkar inte ge överkomliga resultat och kan kräva vissa anpassningar 18 . Egenskaperna hos denna nya bioanalys möjliggör en enkel och användbar tillämpning av toxicitetsbedömningen av nanopartiklar. I själva verket kommer möjligheten att utföra analysen vid olika salthaltigheter att redovisa nanopartikelbeteende under olika jonstyrkor, en miljöparametervariabel som väsentligt kan påverka toxiciteten 19 . Dessutom rekommenderas inte användning av tillväxtmedium och näringsämnen i ekotoxicitetsbedömningarna av nanopartiklar eftersom organiska ämnen kan underlätta deras absorption genom att öka de toxiska effekterna 20 eller kan orsaka aggregering, minska den biotillgängliga fraktionen och därmed deras toxicitet 21 .
Sammanfattningsvis är bioassayen på Vibrio anguillarum apRomiseringsverktyg för riskbedömning av klassiska och nya föroreningar, samt för bedömning av status för marina och bräckliga miljöer.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades av forskningsprojektet: "NanoBioTech ambiente e salute. Progetto 2: Ambiente. Strumenti et metodi per il monitoraggio ecotossicologico delle Nanoparticelle" ( "Nano-BioTechnology: Environment and Health. Project 2: Environment. Verktyg och metoder för ekotoxikologiska Övervakning av nanopartiklar " ) som beviljats LM från Regione Lazio-Consorzio Hypatia. AR finansierades av ett postdoktoralt bidrag från universitetet i Tor Vergata / Regione Lazio-Consorzio Hypatia inom ramen för det tidigare nämnda projektet. Ett avtal med ISPRA-Tor Vergata University (N. 2015/52857) möjliggjorde ömsesidig användning av faciliteter och utbyte av forskare.
Författarna är skyldiga till prof Maria Cristina Thaller, vår skyddsängel för alla mikrobiella aktiviteter, för att höja intresset för den mikrobiella världen och för att starkt bidra till att förbättra vår forskning i frågan. Författarna erkänner tacksamt Andrea Tornambè och EriKa Magaletti för det värdefulla samarbetet med ISPRA Lab of Phytoplankton ekologi och ekotoxikologi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vibrio anguillarum (strain AL 102, serotype O1) | Obtained from the laboratory collection of NOIFMA (Norway) | ||
| Tryptic Soy Agar | Liofilchem | 610052 | Dehydrated Culture Media |
| Tryptic Soy Broth growth medium | Liofilchem | 610053 | Dehydrated Culture Media |
| CuSO4·5H2O | Sigma-Aldrich | 209198 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S-3014 | |
| Name of Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Biosafety Laminar Flow Hood | ESCO | ||
| Incubator | Fratelli Galli | Mod. 2100 | |
| Name of Software | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Benchmark Dose Software | US EPA | Benchmark Dose 2.4.0 | 2012 |
References
- Guidance on information requirements and chemical safety assessment. , ECHA (European CHemicals Agency). Available from: http://guidance.echa.europa.au/docs/guidance document/information (2008).
- Parvez, S., Venkataraman, C., Mukherji, S. A review on advantages of implementing luminescence inhibition test (Vibrio fischeri) for acute toxicity prediction of chemicals. Environm. Internat. 32 (2), 256-268 (2006).
- Rad, M., Shahsavani, D. Isolation and characterization of Vibrio (Listonella) anguillarum from catfish. Turkish J. Veter. Animal. 34 (4), 413-415 (2010).
- Thompson, F., Iida, T., Swings, J. Biodiversity of Vibrios. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 68, 403-431 (2004).
- Austin, B., Austin, D. A. Vibrionaceae representatives: characteristics of the disease. Bacterial Fish Pathogens: Disease of Farmed and Wild Fish. 29-30, Springer-Praxis. Chichester, UK. 108-115 (1999).
- Larsen, J. L., Mellergaard, S. Microbiological and hygienic problems in marine aquaculture: furunculosis and vibriosis in rainbow trout (Salmo gairdneri). L.). Bull. Eur. Assoc. Fish Pathol. 1, 29-31 (1981).
- Oliver, J. D. The viable but nonculturable state in bacteria. J. Microbiol. 43 (1), 93-100 (2005).
- Hsieh, C. -Y., Tsai, M. -H., Ryan, D. K., Pancorbo, O. C. Toxicity of the 13 priority pollutant metals to Vibrio fisheri in the Microtox chronic toxicity test. Sci. Total Environ. 320, 37-50 (2004).
- Migliore, L., Rotini, A., Thaller, M. C. Low doses of Tetracycline trigger the E. coli growth: a case of hormetic response. Dose-Response. 11, 550-557 (2013).
- Adams, M. S., Stauber, J. L. Development of a whole-sediment toxicity test using a benthic marine microalga. Environm. Toxicol. Chem. 23 (8), 1957-1968 (2004).
- Manfra, L., et al. Ecotoxicity of diEthylene Glycol and risk assessment for marine environment. J. Hazard. Mat. 284, 130-135 (2015).
- Microtox® Acute Toxicity Solid-Phase Test. , Azur Environmental. 20 (1995).
- Metodi analitici per le acque. Manuali e Linee Guida (Analytical methods for waters. Manual and Guidelines). Metodi Ecotossicologici (Ecotoxicological methods). 29 (3), APAT IRSA-CNR. 8030 (2003).
- Heinlaan, M., Ivask, A., Blinova, I., Dubourguier, H. -C., Kahru, A. Toxicity of nanosized and bulk ZnO, CuO and TiO2 to bacteria Vibrio fischeri and crustaceans Daphnia magna and Thamnocephalus platyurus. Chemosphere. 71, 1308-1316 (2008).
- Mortimer, M., Kasemets, K., Heinlaan, M., Kurvet, I., Kahru, A. High throughput kinetic Vibrio fischeri bioluminescence inhibition assay for study of toxic effects of nanoparticles. Toxicol. In Vitro. 22 (5), 1412-1417 (2008).
- Bondarenko, O. M., et al. Multilaboratory evaluation of 15 bioassays for (eco) toxicity screening and hazard ranking of engineered nanomaterials: FP7 project NANOVALID. Nanotoxicology. 10 (9), 1229-1242 (2016).
- Matranga, V., Corsi, I. Toxic effects of engineered nanoparticles in the marine environment: model organisms and molecular approaches. Mar. Envir. Res. 76, 32-40 (2012).
- Corsi, I., et al. Common strategies and technologies for the ecosafety assessment and design of nanomaterials entering the marine environment. ACS NANO. 8 (10), 9694-9709 (2014).
- Handy, R. D., von der Kammer, F., Lead, J. R., Hassellöv, M., Owen, R., Crane, M. The ecotoxicology and chemistry of manufactured nanoparticles. Ecotoxicology. 17, 287-314 (2008).
- Kasemets, K., Suppi, S., Kunnis-Beres, K., Kahru, A. Toxicity of CuO nanoparticles to yeast Saccharomyces cerevisiae BY4741 wild-type and its nine isogenic single-gene deletion mutants. Chem. Res. Toxicol. 26, 356-367 (2013).
- Ivask, A., et al. Mechanisms of toxic action of Ag, ZnO and CuO nanoparticles to selected ecotoxicological test organisms and mammalian cells in vitro: A comparative review. Nanotoxicology. 8 (1), 57-71 (2013).
