Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Genetics

Encelliga profilering av genuttryck med FACS och qPCR med interna standarder

doi: 10.3791/55219 Published: February 25, 2017

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Individuella celler i en population kan visa vitt skilda svar på en enhetlig fysiologisk stimulans 1, 2, 3, 4. Den genetiska variationen av celler i en population är en mekanism för denna rad olika svar, men det finns också flera icke-genetiska faktorer som kan öka variationen av svar, även i en klonal population av celler. Till exempel kan halterna av individuella proteiner och andra viktiga signalmolekyler variera för en cell-för-cell-basis, vilket ger upphov till variation i nedströms genuttrycksprofilerna. Dessutom kan genaktivering uppstå i kortvariga skurar av transkript 5, 6 som kan begränsas till ett relativt litet antal utskrifter per skur 7, 8, 9. Sådanstochasticity i genaktivering kan i hög grad bidra till variabilitet i biologiska svar och kan ge en selektiv fördel i mikroorganismer 10 och i däggdjursceller 1, 2 svarar på en fysiologisk stimulans. På grund av både genetiska och icke-genetiska källor till variation, kan genen uttrycksprofilen för en given cell som svar på ett stimulus skiljer sig mycket från den genomsnittliga genuttryck profil som erhålls från mätningen av bulk respons. Om den utsträckning i vilken individuella celler visar variabilitet som svar på ett stimulus kräver tekniker för isolering av enskilda celler, mätning av uttrycksnivåer för transkript av intresse, och den beräkningsmässiga analys av de resulterande expressionsdata.

Det finns flera metoder för att analysera genuttryck i enskilda celler, som täcker ett brett spektrum av kostnader, antal transkript sonde, ochnoggrannhet kvantifiering. Till exempel, erbjuder enkel-cell-RNA-Seq ett brett djup av transkriptet täckning och förmågan att kvantifiera tusentals distinkta transkript för de högst uttryckta gener i individuella celler; dock kan kostnaden i samband med en sådan sekvense djup vara oöverkomliga, även om kostnaderna fortsätter att minska. Omvänt enda molekyl RNA fluorescens in situ hybridisering (smRNA FISH) ger exakt kvantifiering av transkript för ännu låg-uttryckande gener till en rimlig kostnad per gen av intresse; kan emellertid endast ett litet antal av målgener analyseras i en given cell genom detta tillvägagångssätt. Kvantitativa PCR-baserade analyser, som beskrivs i detta protokoll, ge en medelväg mellan dessa tekniker. Dessa analyser utnyttjar en mikroflödesrealtids-PCR maskin för att kvantifiera upp till 96-transkript av intresse i taget i upp till 96 celler. Medan var och en av de ovan nämnda metoder har erforderliga kostnader hårdvara, är kostnaden för varje enskild qPCR analys relativtlåg. Detta protokoll är anpassad från en föreslagits av en tillverkare av en mikroflödesrealtids-PCR maskin (Protokoll ADP 41, Fluidigm). För att möjliggöra en uppskattning av det absoluta antalet av varje transkript i en PCR-baserad metod, har vi utökat protokoll för att använda sig av den interna kontrollen av beredda målgenprodukter amplikoner som kan användas i flera experiment.

Som ett exempel på denna teknik, är kvantifiering av uttrycket av gener som regleras av den tumörundertryckande p53 i MCF-7 humana bröstkarcinomceller beskrivna 11. Cellerna utmanas med ett kemiskt medel som inducerar DNA-dubbelsträngbrott. Tidigare studier har visat att p53-gensvaret till DNA-dubbelsträngbrott uppvisar en hel del heterogenitet i enskilda celler, både i termer av p53 nivåer 12 och i aktiveringen av distinkta målgener 11. Dessutom reglerar p53 uttryck för över 100välkarakteriserade målgener involverade i ett flertal nedströms vägar, inklusive cellcykelstopp, apoptos, och åldrande 13, 14. Eftersom p53-medierat svar i varje cell är både komplex och variabel, analysen av förmånerna från ett synsätt där nästan 100 målgener kan sonderas samtidigt i enskilda celler, såsom den som beskrivs nedan. Med smärre ändringar (såsom alternativa metoder för encelliga isolering och lys) kan protokollet lätt anpassas för att studera ett brett spektrum av däggdjurscelltyper, utskrifter och cellulära svar.

Med rätt förberedelser kan en runda cellsortering och genuttryck mätning utföras enligt detta protokoll under en period av tre dagar. Följande timing föreslås: i förväg, välja utskrifter av intresse, identifiera och validera primerpar som förstärker cDNA från de transcrIPTS, och förbereda de standarder och primer blandningar med hjälp av dessa primers. På dag 1 efter cellbehandling, skörd och sortera cellerna, utföra omvänd transkription och specifik målamplifiering, och behandla proverna med ett exonukleas för att avlägsna ej inkorporerade primrar. På dag 2, utföra kvalitetskontroll på sorterade celler med hjälp av qPCR. Slutligen, på dag tre, mäta genuttryck i de sorterade cellerna med hjälp av mikroflödes qPCR. Figur 1 sammanfattar stegen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. förväg preparering

  1. Välj upp till 96 gener av intresse vars uttryck kommer att mätas.
    OBS: Minst en av dessa gener skulle vara en "housekeepinggen" såsom ACTB eller GAPDH, är det känt för att uttryckas på en relativt hög och konstant nivå under de betingelser som används i experimentet. Denna gen kommer att användas för att identifiera en positiv sorterade brunnar (steg 8,1) och amplifierade prover (steg 10,1).
    OBS: För exemplet experimentet väl karakteriserad, direkta mål för p53 med en mängd kända funktioner 11, 14 och GAPDH som en hushållning kontroll valdes. Vänligen se referens 11 för en komplett lista av målgener och primersekvenser som används i denna studie.
  2. Identifiera potentiella primerpar är specifika för generna av intresse (t.ex., med hjälp av den vetenskapliga litteraturen eller en primer designverktyg såsom Primer-BLAST) 15. Har primerns syntetiseras och bibehålla dem vid en stamkoncentration av 100 pM i nukleasfritt vatten.
    OBS: Dessa primers bör vara 15-25 baser lång; producera ett amplikon 90-130 baspar (bp) lång; span en exon korsningen, om en sådan finns, för att minska risken för att förstärka genom-DNA; har smälttemperaturer av 60 ± 1 ° C; och har minimal sekundär struktur 16. Dessa primrar kommer att användas för att prima omvänd transkription, amplifiera cDNA från transkripten av intresse, och mäta genuttryck i DNA-bindning färgämnesbaserat qPCR.
  3. Validera primrarna.
    1. Först, erhålla cDNA från cellerna av intresse. Skörd RNA från cellerna med hjälp av en RNA-skörd kit enligt tillverkarens instruktioner eller molekylärbiologiska standardmetoder 17. Omvänd-transkribera RNA till cDNA med användning av en omvänd transkription kit med slumpmässiga hexamerer i enlighet med tillverkarens instruktioner eller standard metods 17.
    2. För varje primerpar, som inrättades qPCR med DNA-bindande färgämne Master Mix, framåt och bakåt primers, och cDNA från föregående steg, efter Master Mix tillverkarens rekommendationer för föreslagna reaktionsbetingelser. Kör dessa reaktioner på en realtids-PCR maskin med hjälp av en termisk cykling protokoll som rekommenderas av Master Mix tillverkare som innehåller smältkurva förvärv.
    3. Efter qPCR, kör de amplifierade DNA-prover på en 2% vikt / volym agarosgel och visualisera DNA via en DNA-interkalerande färg efter ett standardprotokoll 17.
    4. Bestämma effektiviteten av primerparet genom att konstruera en standardkurva från seriella spädningar av cDNA (i steg 1.3.1) i enlighet med ett standardprotokoll 16.
      OBS: Ett bra primerpar kommer att ge en smälta kurva med en enda, väldefinierad topp och ett enda band i den förväntade platsen på gelén 16, upp class = "xref"> 17 (Figur 2). Om smältkurvan har flera toppar eller en "skuldra" eller om gelén har flera band eller ett utstryk, är primrarna amplifiera en off-målsekvensen. Omforma de primers som har observerats att förstärka off-target-sekvenser och upprepa de föregående valideringssteg som behövs. En bra primerpar kommer också att ha en effektivitet av 90-110%, med R 2 ≥0.985 för standardkurvan 16; omforma de primers som effektivitet eller R2 faller utanför dessa områden.
  4. Förbered standarder från renade DNA-amplikoner.
    1. För varje validerad primerpar:
      1. Förstärk regionen av intresse från cDNA med hjälp av en high-fidelity DNA-polymeras enligt polymeras tillverkarens rekommendationer för primer och mall DNA-koncentrationer, reaktionsbetingelser, och PCR-cykelförhållanden, eller med hjälp av en standard-PCR-protokoll"xref"> 17.
      2. Kör det amplifierade cDNA: t på en 2% vikt / volym agarosgel och visualisera bandet med en DNA-interkalerande färgämne 17. Skära ut band som representerar den amplikon med en ren rakblad och placera gelstycket i ett mikrocentrifugrör.
      3. Rena amplikon från gelén med användning av en standard-gel extraktionsförfarande, såsom en agaras baserad extraktion 17 eller en spin-kolonn gelextraktionskit, enligt tillverkarens instruktioner.
      4. Mäta koncentrationen av amplikon med användning av en fluorescensbaserad dsDNA kvantifiering kit enligt tillverkarens instruktioner. Dela den uppmätta dsDNA koncentrationen genom den kända molekylvikten av amplikon baserat på amplikonet sekvensen för att erhålla antalet amplikon molekyler per | il.
      5. I en 2,0 ml låg-bindande mikrofugrör, tillsätt 2 pl av renad amplikon till en volym av DNA-suspensionsbuffert, så att den slutliga koncentrationen av ampLicon är 5 x 10 8 molekyler / l.
    2. När alla amplikoner har renats, kombinera 18 ul av varje renad amplikon i en 2,0 ml låg-bindande mikrocentrifugrör. Lägg DNA fjädring buffert för att göra en total volym av 1800 pl; således är koncentrationen av varje amplikon 5 x 10 6 molekyler / | il.
      OBS: Denna blandning, som innehåller cDNA amplikoner från alla gener av intresse i kända ekvimolära mängder, kommer att fungera som en standard i encelliga qPCR.
    3. Vortex detta "5e6" standard ordentligt, snurra i 10 sekunder vid 2000 xg, och dela i 20 pl alikvoter i låg-bindande PCR-rör. Lagra alikvoter vid -80 ° C.
  5. Förbered specifikt mål förstärkning (STA) primer mix (10x).
    1. I en 15 ml koniskt rör, kombinera 25 ul av varje 100 iM lager primer (upp till 192). Lägg DNA fjädring buffert för att göra en total volym på 5000 il.
      OBS!Koncentrationen av varje primer i denna blandning är 500 nM. Varje platta av sorterade celler använder 105,6 il av denna primer mix att prima omvänd transkription och specifikt mål förstärkning. Volymen av tändämnesblandningen ges här är nog att göra 45 plattor för att sortera. Det är lämpligt att göra en tillräckligt stor volym av primer mix så att det endast behöver göras en gång; skala volymer efter behov.
    2. Blanda noggrant genom att vortexa, dela in 110 pl portioner, och lagra alikvoter vid -20 ° C.
  6. Förbereda analysblandningar, en för varje primerpar, för användning i mikroflödeschipsbaserad qPCR.
    1. I varje brunn i en 96-brunnars PCR-platta, kombinera 3,0 | il av 100 | iM framåtriktad primer för en given gen, 3,0 | il av den motsvarande 100 | iM bakåtriktad primer, 24,0 | il av DNA-suspensionsbuffert, och 30,0 | il av 2x analysladdningsreagens .
    2. Vortex denna platta, snurra i 10 sekunder vid 500 xg, och förvara vid -20 ° C.
  7. Skapa två termiska cykelprogram: RTSTA (omvänd transkription och specifikt mål förstärkning, Tabell 1) och EXOI (exonukleas I-behandling, tabell 2).

2. Behandling

  1. Plattan däggdjurscellerna på en vävnadsodlingsskål på så sätt att de kommer att växa till önskad konfluens vid tidpunkten för behandlingen, beroende på villkoren i den experimentella studien. För exemplet som presenteras i denna studie, plattan 4 x 10 5 MCF-7 p53-Venus-celler 18 per 6 cm platta i RPMI med 10% fetalt bovint serum (FBS), 100 U / ml penicillin, 100 mg / ml streptomycin, och 250 ng / ml amfotericin B. Inkubera cellerna under två dagar vid 37 ° C med 5% CO2 tills de når 50% konfluens.
  2. Behandla cellerna för att fastställa tillståndet av intresse baserat på den experimentella studien. För exemplet som presenteras i denna studie, inkubera MCF-7 p53-Venus-celler med 400 ng / ml neocarzinostatin under 3 timmar, 8,5 timmar, 14 timmar eller 24 timmar.

3. Lysis Buffer Förberedelse för cellsortering

OBS: Att göra en enda platta lysbuffert tar ca 1 timme. Det är lämpligt att göra och sortera flera plattor, som cellsortering kan vara ineffektiv och ge många brunnar med ingen detekterbar cell.

  1. Rengör bänken, pipetter, provrörsställ, kalla PCR platthållare, och handskar med DNA saneringslösning som förberedelse för PCR.
  2. Späd RNAse inhibitor till 2,64 U / | il genom tillsats av lager RNAse inhibitor för att nukleasfritt vatten i ett 1,5 ml rör.
    OBS: Detta tillåter RNAse inhibitor som skall tillsättas till den lyseringsbuffert utan pipettering sub-pl volymer.
  3. Göra lysbuffert för cellerna genom att kombinera de komponenter som anges i tabell 3.
  4. Överföra 92,4 ul av lyseringsbuffert för cellerna in i ett separat rör; detta kommer att vara lysbufferten för amplikonet standarder.
  5. med användning av low bindande pipettspetsar och mikrocentrifugrör, förbereda 200 | il och 500 | il av E. coli-DNA späddes till 3,1 pg / pl och 6,2 pg / pl, respektive, med DNA suspensionsbuffert.
  6. Lägga 184.8 pl av 3,1 pg / pl E. coli-DNA till lysbufferten för cellerna.
    OBS: E. coli bärar-DNA tjänar till att bredda ospecifik primer bindande möjligheter och därmed minska sannolikheten för att primer dimerisering kommer att leda till en PCR-produkt.
  7. Förbered standarder.
    1. Märk sex låga bindande mikrocentrifugrör som 5E5, 5E4, ... 5e0.
    2. Lägg 90 pl DNA fjädring buffert till "5E5" rör.
    3. Lägg 90 pl 6,2 pg / pl E. coli-DNA till var och en av de övriga fem rören. Håll alla rören på is.
      OBS: I förening bärar-DNA i de standarder gör den totala massan av DNA i standardbrunnarna jämförbar med den i de en-cellbrunnar; detta minskar probability att koncentrationen av standarder kommer att påverkas av DNA-bindning till rör eller pipettspetsar.
    4. Ta en alikvot av den "5e6" standard (5 x 10 6 molekyler / il av varje amplikon, som framställts i steg 1,4) från lagret. Vortex en kort stund och snurra kort (5 sek vid 500 xg) för att säkerställa att vätskan är i botten av röret.
    5. Med hjälp av en låg-bindande pipettspets, tillsätt 10 pl 5e6 standard till "5E5" rör. Vortex kort, spinn (5 sek vid 500 xg), och sätta röret tillbaka på is.
    6. Pipettera 10 pl från "5E5" röret i "5E4" rör. Vortex kort, spinn (5 sek vid 500 xg), och sätta tillbaka på is.
    7. Upprepa dessa serieutspädningar, med varje rör emot 10 il från föregående röret, tills alla rör har en utspädning av standard.
  8. Förbered en rad av 12 PCR-rör med lock. Fördela 67 pl av "cell" lysbuffert till varje rör. Cap rören och spinn ner kort (5sek vid 500 xg) om det behövs.
  9. Med användning av en 12-kanals pipett, distribuera 9 pl av "cell" lysbuffert från raden av PCR-rör i varje brunn i de första 7 raderna i en PCR-platta (fig 3).
  10. Fördela 7 il "standard" lysbuffert till varje brunn i den sista raden av plattan (Figur 3).
  11. Användning av låga bindande pipettspetsar, tillsätt 2 pl av standard till varje brunn i den undre raden enligt tallriks kartan (fig 3).
    OBS: 2 pl 5 x 10 0 molekyler / l schablonbelopp som 10 molekyler, etc.
  12. Tillsätt 2 pl 3,1 pg / pl E. coli DNA i 10-cell och 100-cellbrunnar; tillsätt 2 pl av 6,2 pg / pl E. coli DNA in i de inga-cellbrunnar.
    OBS: Varje 1-cell, 10-cell, och 100-cell väl har 6,2 pg av E. coli DNA, som närmar massan av genom-DNA i en enda human cell. Varje standard och ingen cell väl har 12,4 pg of E. coli-DNA, cirka två humana celler till ett värde.
  13. Förslut plattan med en steril termisk försegling, snurra i 5 sek vid 500 xg, och förvara vid 4 ° C tills cellerna är redo för sortering.

4. Cell Sorter Setup

  1. Programmera fluorescensaktiverad cellsorterare för att sortera in i en 96-brunnsplatta enligt tallriks kartan (fig 3); inga celler ska sorteras i brunnar H1-H8 eller H11-H12.
  2. Kontrollera att cellsorterare är väl avsedd för sortering i en PCR-platta.
    1. Ställa in vinkeln på sorteringsströmmen till ett minimum; denna inställning ökar chansen att cellerna kommer att sorteras in i botten av brunnarna i stället träffa sidorna.
    2. Att rikta maskinen, täta en tom PCR-platta och använda testströmmen till "sortera" droppar av PBS på sigill tom plåt, enligt instruktionerna i maskinen 19; dropparna bör landa på the yta av tätningen vid en position ovanför centrum av brunnen. För bästa resultat, kontrollera målet över längden och bredden av plattan.
    3. Om dropparna inte landa i rätt läge, torka dem från ytan av tätningen, kalibrera cellsorterare enligt maskintillverkarens anvisningar, och upprepa tills dropparna i sorteringsströmmen deponeras korrekt.

5. Cell Harvest och Sortering

  1. Trypsinize cellerna som är lämpliga för cellinje. Till exempel, för MCF-7-celler, aspirera mediet från cellerna, skölj cellerna med 1 ml av 0,05% trypsin, och inkubera cellerna med 2 ml 0,05% trypsin under 5 minuter vid 37 ° C och 5% CO2 .
  2. Tillsätt 8 ml av cellodlingsmedium till de trypsiniserade cellerna och överför samtliga 10 ml av cellsuspension till ett 15 ml rör. Centrifugera i 4 min vid 400 x g.
  3. Aspirera supernatanten och resuspendera cellpelleten i PBS + 2% FBS. <br /> OBS: En mindre resuspension volym koncentrerar cellerna och underlättar cellsortering; en 500 pl resuspension volym fungerar bra för en 6 cm skål av celler vid 50% konfluens.
  4. Överför cellsuspensionen till en 5 ml flödescytometri rör, pipettering genom ett 40 pm filter för att avlägsna klumpar av celler.
  5. Centrifugera plattan lysbuffert vid 400 xg under 30 sek vid 4 ° C före sortering av cellerna för att se till att den vätska som är på botten av brunnarna.
  6. För in röret med cellsuspensionen in i cellsorterare. Öppna förseglingen på plattan lysbuffert och noga sortera cellerna av intresse in i plattan enligt tallriks karta och efter cellsorterings tillverkarens anvisningar 19. För att säkerställa att enskilda celler sorteras vid maximal renhet, kör maskinen i "single cell" -läge och använda standard flödescytometri grind baserat på framåt och sidospridning 19.
    OBS: Iexempel experiment, gate cellerna baserat på p53-Venus fluorescens för att isolera den ljus 15% av enskilda celler 11.
  7. Förslut plattan med en ny, steril termisk försegling och centrifugera vid 400 xg under 1 min vid 4 ° C. Placera plattan i termocyklern och kör RTSTA programmet (se steg 1,7).
    OBS: Detta utför omvänd transkription på mRNA från de sorterade cellerna och därefter förstärks cDNA av transkripten av intresse.

6. exonukleasbehandling

  1. Blanda utspädd exonukleas I genom att kombinera de komponenter som anges i tabell 4. Förbered en rad av 12 PCR-rör med lock. Fördela 30,5 pl utspädd exonukleas I i varje rör. Cap rören och snurra kort (5 sek vid 500 xg) för att säkerställa att vätskan är i botten av röret.
  2. När RTSTA är klar, snurra provplattan för 5 sek vid 500 x g. Med hjälp av en 12-kanals pipett fördela 3,6 pl utspädd exonukleasI i varje brunn i plattan.
  3. Täta plattan med en steril termisk tätning och snurra kort (5 sek vid 500 xg). Placera plattan i termocyklern och kör EXOI programmet (se steg 1,7).
    OBS: Detta steg försämrar några primers som återstår efter specifikt mål förstärkning så att de inte kommer att störa framtida PCR.

7. Prov Utspädning

  1. När exonukleasbehandling är klar, tillsätt 32,4 | il av TE-buffert till varje brunn i provplattan; detta är en valfri stoppställe, och prover kan lagras vid -20 ° C under flera dagar.

8. Sortera Kvalitetskontroll Använda qPCR

OBS: Eftersom cellsortering är inte helt effektivt, är nödvändigt detta steg för att identifiera vilka brunnar i den sorterade plattan faktiskt fått en cell. Dessa prover kan sedan användas för vidare analys.

  1. Mät hushållning genuttryck i varje prov genom qPCR.
  2. Förbered 900 pl DNA-bindande färgämne qPCR Master Mix för 96 reaktioner enligt polymeras tillverkarens protokoll med användning av primers för en av housekeeping-gener som valts i steg 1,1; de exakta koncentrationerna av reaktionsbuffert, polymeras, primrar, etc. för denna reaktion kommer att bero på den specifika polymeraset som används.
  3. Fördela 9 il huvudblandning till varje brunn i en 96-väl PCR-platta. Tillsätt 1 pl av prov från provplattan till motsvarande brunn i PCR-plattan.
  4. Kör plattan på en realtids-PCR maskin med hjälp av en värmecykelprotokoll föreslagits av Master Mix tillverkaren eller efter ett standardprotokoll 20.
  • Analysera qPCR uppgifter 20; ett exempel på qPCR data från kvalitetskontroll steg sorterings anges nedan visas i figur 4.
    1. Kontrollera att mätningarna från de icke-cellbrunnar visar en låg (bakgrund) nivåav genuttryck eller inget uttryck alls.
    2. Kontrollera att mätningar från en-cellbrunnar delar klart i två grupper: positiva prover med hög genuttryck och negativa prover med bakgrundsnivåer av uttryck eller inget uttryck alls, liknar inga celler brunnar.
      OBS: De prover med höga genuttryck representerar faktiska sorterade celler; de med bakgrunds uttryck bör uteslutas från vidare analys.
    3. Kontrollera att mätningar från 10-cell och 100-cellbrunnar återspeglar högre genuttryck än i de positiva 1-cellbrunnar, vilket möjliggör möjligheten att ineffektiv sortering kan orsaka dessa brunnar för att ha färre celler än önskat.
    4. Kontrollera att mätningar från standard brunnarna är jämnt fördelade i logaritmisk utrymme (det vill säga att C-t-värden är jämnt fördelade).
  • Efter att ha identifierat alla positiva 1-cellprover, göra en "Sample Mixer" platta kartan för att kartlägga positiv 1-cella prover på en ny 96-brunnars platta. Omfatta åtta brunnar för standarder på denna platta kartan. Se figur 5 för ett exempel.
  • 9. Gene Expression mätning med mikroflödes qPCR

    OBS: För varje steg i det här avsnittet, för att pipett endast till det första stoppet minimera bildningen av bubblor i reagenserna.

    1. Öppna en rad med 8 PCR-rör. Om det finns flera plattor av prover, öppna en andra rad av 8 PCR-rör och märka rören 1-8. Denna rad kommer att vara för att samla standarder från flera plattor.
    2. I en 1,5 ml tub, blanda 360 pl DNA-bindande färgämne qPCR huvudblandning med 36 pl DNA-bindande färgämne prov lastning reagens. Vortex kort och snurra i 10 sekunder vid 2000 x g. Dividera denna blandning (396 pl) i den omärkta rad med 8 PCR-rör, placera 48 ul i varje rör.
    3. Med hjälp av en 8-kanals pipett fördela 3,3 pl av Master Mix / prov lastning reagensblandningen i varje brunnav en ny 96-brunnars PCR-platta. Märk denna platta, "Sample blandningar."
    4. För varje PCR-platta med prover:
      1. Vortex plattan i 10 sek och centrifugera under 10 sek vid 500 x g. Ta bort locket och överför 2,7 fil av varje positiv 1-cellprov till dess motsvarande väl på provet Blandar plåten för 1-cellen brunnar som anges på plattan kartan.
      2. Om det endast finns en platta med prover, överför 2,7 fil av varje amplifierad standard till dess motsvarande brunn på Sample Blandar plattan enligt tallriks kartan.
      3. Om det finns flera plattor av prover, överför 2,7 fil av varje amplifierad standard till dess motsvarande position i den märkta raden av PCR-rör. Lägg till standarder från den aktuella plattan prover till alla standarder som redan där. Täta plattan prov när du är klar med hjälp av en tätningsfilm.
    5. Om det finns flera plattor av prover:
      1. Vortexa raden av PCR-rören innehållande standarder för10 sekunder och snurra i 10 sekunder vid 2000 x g. Överföra 2,7 | il från varje rör av blandade standarder i motsvarande brunn på provet Blandar plattan enligt tallriks kartan.
    6. Ladda NTC brunnarna med 2,7 pl nukleasfritt vatten där anges på plattan kartan. Täta Prov Blandar plattan och förvara vid 4 ° C tills det behövs.
    7. Skala dekalen från botten av en ny mikroflödes qPCR chip. Med hjälp av en spruta med styrledning vätska med locket fortfarande på, tryck ner varje ackumulator våren för att lossa den, och injicera varje ackumulator med 150-200 pl styrledning vätska.
    8. Sätt chip i lastmaskinen och köra "Prime" manus. Detta tar ~ 20 min.
    9. När priming sker, virvel och centrifugera ner plattorna i analysblandningar (framställd i steg 1,6) och provblandningar.
    10. Med hjälp av en 8-kanals pipett 4,5 pl av varje analysblandning i den vänstra sidan av mikroflödes qPCR chip enligt diagrammet i g> Figur 6. Pipett mycket försiktigt för att undvika att skapa luftbubblor i botten av brunnarna. När du är klar, försegla plattan analysblandningar och förvara vid -20 ° C för framtida bruk.
    11. Överföra 4,5 pl av varje prov blandningen för att den högra sidan av mikroflödes qPCR Chips enligt figur 6. Sätt chipet i lastmaskinen och köra "Ladda Mix" manus. Detta tar ~ 90 min.
    12. Slå på mikroflödesrealtids-PCR maskin, startar datainsamlingsprogram och slå på lampan för att värma upp. Detta tar ~ 20 min.
    13. När belastningen Mix skriptet är gjort, kontrollera att det inte finns några linjer över spån detta skulle indikera en laddningsproblem. Försiktigt bort eventuella dammpartiklar från chipet med hjälp av tejp eller lab tejp. Sätt i chipet i mikroflödesrealtids-PCR-maskin och köra datainsamlings skriptet. Använda analysprogrammet för att inspektera resultatet och exportera data för vidare analys.
    _title "> 10. Dataanalys

    1. Ta bort mätningarna för vilka qPCR amplifieringskurvor visar dålig kvalitet (dvs där kurvorna inte likna standard sigmoidal amplifieringskurvan) 20.
    2. Ta prover med mer än 30 dålig kvalitet eller noll mätningar eller för vilka hushållning genuttryck (se steg 1,1) är mycket lägre än de flesta andra prover (Figur 7).
    3. För varje gen, uppskatta den korrekta smälttopp plats som medianen av de smälttopp platserna från varje prov. Om en mätning har en smälttopp ligger mer än 1 ° C från medianen, ta bort den mätning från övervägande 20.
    4. För varje gen, skapa en standardkurva för att uppskatta mRNA räknas i varje prov med hjälp av ett kalkylblad eller skriptspråk 20.
      OBS: Standarderna i detta experiment består av 10, 100, 1000, eller 10.000 molekylerav dsDNA som motsvarar varje transkript av intresse. Om omvänd transkription var helt effektiv, skulle de normer motsvara 20, 200, 2000, och 20.000 molekyler av mRNA, eftersom mRNA och cDNA är enkelsträngade. I praktiken är detta inte fallet, så vi uttrycka mätresultat som en uppskattning i enheter av molekyler × E RT, där E RT är effektiviteten av omvänd transkription.
      1. För varje standard brunn, identifiera m, antalet molekyler av ssDNA (dubbelt så många molekyler av dsDNA) innan förstärkning (t.ex., 20 molekyler, 200 molekyler, etc.).
      2. För varje standard brunn, identifiera C t-värdet från qPCR 20.
      3. Med värdena för m och C t, utföra en linjär regression med användning av följande ekvation för att generera en standardkurva med parametrarna a och b för varje gen, och finner värdet R 2 som enn indikator på godhet passar:
        ekvation 1
      4. Från standardkurvan, beräknar PCR effektivitet E för varje gen:
        ekvation 2
        OBS: Värdet E mycket större än 1,0 (t ex E> 1,1) är inte fysiskt realistiskt; värde en R2 för den linjära regressionen mycket mindre än 1,0 (t.ex. R2 <0,985) innebär att de normer som inte fungerar på ett tillförlitligt sätt. Dessa problem visar i allmänhet att den lägsta amplikon standarden faller under en tröskel på tillförlitlig kvantifiering, och därmed den lägsta standarden bör undantas från den linjära regressionen. Om en adekvat linjär regression inte kan tillverkas med användning av åtminstone tre unika standarder, kassera expressions mätningar för genen.
      5. Om den linjära regressionen är tillräcklig, använd den resulterande fit parametrarna a och b </ em> för varje gen att uppskatta antalet mRNA-molekyler m est (i enheter av molekyler × E RT) för motsvarande gen i varje prov encelliga från uppmätta C t-värdet:
        ekvation 3
      6. Utse någon mätning m est <en som m est = 0. Dessutom utse någon mätning utan förstärkning i qPCR och därmed ingen Ct värde m est = 0.
        OBS: Mätningar med en m est mindre än den lägsta eller högre än den högsta standard som används i regressionen hittas genom extrapolering från standardkurvan. Dessa uppskattningar är inte nödvändigtvis ogiltigt utan bör betraktas med försiktighet.
    5. Visualisera genexpressionsdata encelliga.
      1. Gör en beeswarm tomt (Dorn, J. och Holy, T., 2012, http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange / 37105), i vilken varje punkt representerar genuttryck i en särskild cell; ett exempel visas i Figur 8.
      2. Göra en fiol plot (Dorn, J., 2012, http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/23661), i vilken bredden på den "violin" representerar frekvensen av genuttryck mätningar runt en speciell nivå i population av celler som analyserats; ett exempel visas i Figur 8.
        OBS: Mer sofistikerade analyser kan sondera relationerna i uttryck mellan par av gener 21, 22 och kan sluta genuttryck nätverk.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

    En allmän översikt av protokoll visas i fig 1, inklusive steg för cellbehandling, isolering av enskilda celler genom FACS, generering och pre-amplifiering av cDNA-bibliotek från singel-cell-lysat, en bekräftelse av encelliga cDNA-bibliotek i sorterade brunnar och mätning av genuttryck av qPCR.

    Som förberedelse för enkelcellisolering och genuttryck analys är det nödvändigt att först identifiera giltiga oligonukleotidprimerpar för varje målgen av intresse. Figur 2 visar två exempel på kvalitets kontrollmetoder primer. Smältkurvor genereras efter qPCR med primerparet testas. Giltiga primrar resulterar i en smältkurva med en enda topp (Figur 2A, gröna kurvan). Om flera toppar (Figur 2A, blå kurva) eller en kurva med en uttalad skuldra (Figure 2A, röda kurvan) är närvarande, detta indikerar närvaron av flera PCR-produkter, och primers bör omgjorda. Som ett andra kvalitetskontrollmetod kan agarosgelelektrofores användas för att visuellt verifiera att ett enda band av korrekt storlek är närvarande för varje primerpar testades (Figur 2B). Multipla band eller band av fel storlek indikerar att primrarna inte är giltiga (Figur 2B).

    Efter validering primer och generering av bibliotek av qPCR standarder från rätt amplikoner kan utföras cellsortering. Ett exempel sorteringsschema visas i figur 3. Varje sorterade platta bör innehålla brunnar innehållande en utspädningsserie av amplikon standarder, med 10, 100, 1000, eller 10.000 kopior av varje target amplicon. Det rekommenderas också att inkludera brunnar i vilka inga celler, 10 celler, eller 100 celler sorteras, förutom de encelliga brunnar.På grund av att sorterings ineffektivitet, är det ofta nödvändigt att identifiera de brunnar i plattan i vilken enstaka celler har framgångsrikt avsatts. För detta validerings steg efter förfarandet för omvänd transkription och specifikt mål förstärkning bör qPCR utföras för att mäta uttrycket av en housekeepinggen (Figur 4). Brunnarna för amplikonet standarder (Figur 4, svarta kurvor) bör visa jämnt fördelade amplifieringskurvor. Det bör också vara tydlig åtskillnad i kurvorna som motsvarar de "no-cell" brunnar (Figur 4, röda kurvor), "10-cell" brunnar (Figur 4, blå kurvor), och "100-cell" brunnar (Figur 4 , lila kurvor). En tydlig åtskillnad bör också ske för "en-cell" brunnar motsvarar framgångsrik cellavsättning (Figur 4, grön amplifieringskurvor med C t-värden mindre än för kontrollerna inga celler men greater än för kontrollerna 10-cell) kontra misslyckade cellavsättning (Figur 4, gröna kurvor med C t-värden nära de för kontrollerna no-cell). När brunnar med en enda cell lysat har identifierats, kan cDNA från brunnarna (eventuellt från flera plattor) överföras till en mikroflödes qPCR chip, med en enda cellysatet per brunn. Till exempel, figur 5 visar en hypotetisk matris som kombinerar cDNA från enstaka celler från tre olika sorterade 96-brunnars plattor i en enda ny plåt för qPCR analys.

    Att analysera mikroflödes qPCR resultat bör proverna som sannolikt inte fick en cell först tas bort, vilket indikeras av många saknas eller noll genuttryck mätningar (Figur 7, rader indikeras med pilar) eller ovanligt låg hushållning genuttryck. För varje analys, några mätningar med smälttoppar som inte matchar de i den andrasR sampel i samma analys bör också tas bort. Efter avlägsnande dåliga prover och mätningar, kan linjär regression utföras på mätningarna som motsvarar amplikonet standarder för att uppskatta den absoluta räkningen för varje transkript av intresse i varje prov encelliga. Figur 8 visar en visualisering av dessa genuttryck uppskattningar, mätt i enheter av molekyler × omvänd transkription effektivitet, som beeswarm och violin tomter. I detta exempel, obehandlade celler visar ett brett spektrum av CDKN1A expressionsnivåer, med många celler som inte uttrycker CDKN1A alls och med andra som uttrycker genen vid nivåer som spänner över två storleksordningar. Efter behandling med neokarzinostatin (NCS) i 3 timmar, de flesta celler uttrycker CDKN1A på mycket högre nivåer, och variationen minskar till ungefär en enda storleksordning. Som Behandlingstiden ökar den genomsnittliga nivån på CDKN1A uttryck minskar och variationen i uttryck expanderar.

    Figur 1
    Figur 1: Översikt över stegen i encelliga genuttryck profilering. Behandlade cellerna skördas och sorteras via FACS direkt i lysbuffert. mRNA-species av intresse är transkriberades omvänt, och resulterande cDNA: t amplifieras genom PCR. Hushållning genuttryck i varje prov mäts med qPCR att avgöra vilka prover faktiskt fått en cell. I prover som passerar denna kvalitetskontrolltestet, är ett uttryck för upp till 96 gener mäts med hjälp av mikroflödes qPCR. Denna siffra har ändrats från en tidigare publikation 11. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    19 / 55219fig2.jpg "/>
    Figur 2: Exempel på resultat av primer testning. (A) Smält kurvor från qPCR. Den blå smälta kurva (TNFRSF10D) har flera toppar och den röda smältkurvan (TRIM22) har en "skuldra", som uppgår till en andra topp nära den första toppen. Dessa visar att de primrar som används i dessa reaktioner förstärker flera mål och behöver göras om. Den gröna smälta kurva (SCN3B) har en enda topp, som överensstämmer med primers som förstärker ett enda mål. (B) Amplified DNA kördes på en agarosgel. Banorna för SCN3B, TRIM22 och TRPM2 innehålla flera band; primers som används för att göra dessa DNA-amplikoner förstärker flera mål och behöver göras om. Körfältet för TNFRSF10D har ett enda band, som överensstämmer med primrar som amplifierar ett enda mål. Det är värt att notera att de primers för SCN3B passera smältkurvan testet men misslyckas gelen testet, medan de för TNFRSF10D passera gel testet men misslyckas smältkurvantesta; Dessa två metoder för primer validering kompletterar varandra. I det här exemplet kan man dra slutsatsen att alla fyra primeruppsättningar måste göras om. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    Figur 3
    Figur 3: Plate kartan för cellsortering. Denna platta karta innehåller en-cellbrunnar (röd), 10- och 100-cellbrunnar (mörkare röd), standarder (grön), och inga celler brunnar (vit). Inklusive två replikat av varje standard på varje platta bidrar till att kompensera för variationer i standarder. Inklusive 10-cell och 100-cellbrunnar är användbart som en sanity check för genuttryck. No-cellbrunnar fungera som en negativ kontroll. Klicka här för att se en större version av thans gestalt.

    figur 4
    Figur 4: Exempel på qPCR amplifieringskurvor från sorterings kvalitetskontroll mätning GAPDH uttryck. Inga-cellprover (röda) visar en bakgrundsuttrycksnivå. 1-cellprover (grön) delas in i två olika grupper, en med hög expression och en med lågt uttryck liknar inga-cellprover. Den höga expressionsprov troligen fått en verklig cell under sortering; låg-uttrycks prover gjorde troligen inte. 10-cell (blå) och 100-cell (lila) prover visar högre uttryck än en-cellprover; 10-cellprover är nära den högsta-uttryckande en-cellprover på grund av sorterings ineffektivitet. Standarder (svart) är jämnt fördelade, som förväntat. Klicka här för att se en större version av denna siffra. </ P>

    figur 5
    Figur 5: Exempel på prov Blandar platta karta. Denna platta karta innehåller en-cellprover från tre olika plattor (rader AG), standarder blandas från alla tre plattor (H1-H8), no-cellkontroller (H9-H10), och ingen mall kontroller för qPCR (H11-H12 ). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    figur 6
    Figur 6: Diagram över mikroflödes qPCR chip med ordningen för lastning (1, 2, 3 ...). Skåran (A1) är det övre vänstra hörnet av plattan. Klicka här för att se en större version av this siffra.

    figur 7
    Figur 7: Värme karta över qPCR resultat. Varje rad representerar ett prov 1-cell, standard, eller kontroll; varje kolumn representerar en uppmätt transkript. Rader med ett ovanligt antal svarta rutor eller Xs (pilar) visar sannolikt prover som inte fick en verklig cell. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    Figur 8
    Figur 8: Beeswarm och violin tomter. I en beeswarm plot (blå punkter), representerar varje punkt genuttryck i en särskild cell. I en violin plot (grå form), bredden på "violin" representerar frekvensen av genuttryck measurements runt en speciell nivå i populationen av celler som analyserats. Ljusblå staplar representerar den lägsta standarden. Mätningar ovanför blå staplar interpoleras mellan standarder, medan mätningar inom blå staplar extrapoleras. De data som visas här är mätningar av CDKN1A uttryck i MCF-7-celler som uttrycker Venus-märkt p53 behandlas med neokarzinostatin (NCS) för de angivna tiderna för att inducera DNA-dubbelsträngbrott. Denna siffra har ändrats från föregående publicering 11. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    Skick Temperatur Tid
    Håll 50 ° C 15 min
    Håll 95 ° C 2 min
    20 cykler 95 ° C 15 sek
    60 ° C 4 min
    Håll 4 ° C

    Tabell 1: Omvänd transkription och specifikt mål förstärkning (RTSTA) termisk cykling program.

    Skick Temperatur Tid
    Håll 37 ° C 30 minuter
    Håll 80 ° C 15 min
    Håll 4 ° C

    Tabell 2: exonukleas I behandling (EXOI) termisk cykling program.

    Komponent Volym / brunn (l) 96 volymer w / 10% överskott (il)
    2x reaktionsblandning 5,00 528,00
    Omvänt transkriptas / polymerasblandning 0,20 21,12
    10x STA primermix 1,00 105,60
    2,64 U / ^ il (utspädd) RNAs hämmare 0,02 2,00
    Nukleasfritt vatten 0,78 82,48
    Total 7,00 739,20

    Tabell 3: Komponenter i lyseringsbuffert för cellerna.

    Komponent Volym / brunn (l) 96 volymer w / 10% överskott (il)
    Nukleasfritt vatten 2,52 266,00
    Exonukleas I Reaction Buffer (10x) 0,36 38,00
    Exonukleas I (20 U / | il) 0,72 76,00
    Total 3,60 380,00

    Tabell 4: Komponenter i exonukleas blanda för att behandla de förstärkta cDNA proverna.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

    Vi har presenterat en metod för att isolera enskilda däggdjursceller från en population av vidhäftande celler odlas i kultur och för att analysera uttrycket av cirka 96 gener i varje cell. Bra förberedelser är avgörande för denna metod för att fungera bra. I synnerhet utforma och testa primerpar är specifika för utskrifter av intresse (steg från 1,2 till 1,3) är tidskrävande men viktiga steg, som primers bestämma kvaliteten på mätningarna encelliga. När tillförlitliga primerpar har erhållits, används de för att förstärka cDNA från transkripten av intresse; amplikonema kombineras sedan tillsammans i ekvimolära mängder för att göra standarder (steg 1,4). Detta steg är kritisk, eftersom normerna krävs för att uppskatta absoluta transkript räknas; standarder bör göras en gång, alikvoterades och används för alla efterföljande omgångar av cellsortering och genuttryck mätningar. Likaså, på dagen att cellerna är sorterade, är det särskilt important att späda standarder försiktigt med låg bindnings pipettspetsar och mikrocentrifugrör när du gör plattor av lysbuffert (steg 3,7 och 3,11). Sikta cellsorterare (steg 4,2) är en annan viktig steg; detta måste göras mycket noggrant för att cellerna att framgångsrikt nå målet av 9 ^ il lysbuffert i en PCR-platta.

    Det finns flera ändringar i protokollet som kan göras för att anpassa den till en mängd olika forskningsbehov. Här har vi fokuserat på en DNA-bindande färgämnesbaserat qPCR strategi, vilket ger en relativt prisvärd metod för att kvantifiera genuttryck. Emellertid har denna metod den potential för att skapa en hög bakgrundssignal, eftersom varje amplifierat DNA, och med den hos ej åsyftade sekvenser, resulterar i en fluorescerande signal. En sådan bakgrund kan minimeras genom att säkerställa att primerparet användes för att amplifiera ett specifikt mål ger en smältkurva med en enda topp och en enda PCR-produkt av korrekt storlek (Figur 2). Om bakgrunden är fortfarande ett bekymmer efter att ha använt sådana kvalitetskontroll metoder, kan en sondbaserad qPCR strategi för att minimera off-target upptäckt, om än i en större kostnad för reagens. Ett annat alternativ skulle vara en kapslad PCR metod, i vilken en uppsättning av primers används i RTSTA steget omvänd transkribera och amplifiera en stor region av transkriptet och en andra uppsättning av primers, som förstärker en mindre region som ingår i den stora regionen , används för att mäta genuttrycket qPCR. Denna metod har visat sig förbättra specificiteten hos DNA-bindande färgämnesbaserat qPCR 23.

    Flera metoder finns tillgängliga för att isolera enskilda celler för genuttryck analys. Valet av cellisoleringsmetoden beror på flera faktorer, bland annat tillgängligheten av utrustning (såsom en fluorescensaktiverad cellsorterare), källan till de celler som skall utvärderas (såsom etablerade cellinjer kontra primära celler från en vävnad), ellerden hastighet med vilken cellerna måste isoleras. I exemplet som presenteras i detta protokoll använde vi FACS av en cellinje som uttrycker en tydligt detekterbar fluorescerande-märkta proteinet. FACS har fördelarna av sällsynta celldetektionskapacitet och relativt snabb cellisolering. En utmaning med metoden är att avsättningen av cellerna av intresse i den erforderliga liten volym lyseringsbuffert i en 96-brunnars PCR-platta kan vara ineffektiv och kan kräva optimering av cellsortering geometri för att säkerställa en lyckad isolering. Alternativa metoder som kan leda till större precision i cellisolering vid lägre hastigheter och / eller högre kostnader inkluderar micropipetting av enskilda celler, laser capture microdissection av specifika celler från en tumör prov, eller användning av mikroflödessystem (t.ex., den Fluidigm C1 systemet).

    En stor fördel med det protokoll som beskrivs här är att den interna kontrollen, en utspädningsserie av renade PCR-amplikoner, e Nable uppskattningen av det absoluta antalet av varje transkript i varje cell. Utan dessa normer, kan endast relativa nivåer av genuttryck kan erhållas baserat på beräkningar som härrör från C-t-värden. Men med dessa normer, absoluta transkript räknas kan uppskattas, helst genom interpolering inom intervallet exakt kvantifierade amplikon standarder (Figur 8). Som med alla PCR-baserad metod för genuttryck kvantifiering, kräver noggrann absolut kvantifiering kunskap av effektiviteten hos varje process, inklusive omvänd transkription.

    En aktuell utmaning att kvantifiera transkriptnivåer i enstaka celler är att detektionsgränsen för många metoder uppskattas till 10-100 mRNA per cell 24, förhindrar tillförlitlig kvantifiering av en betydande andel av den transkriptom. Som ett alternativt tillvägagångssätt, kan en använda smRNA FISH att kvantifiera mål av särskilt intresseass = "xref"> 25, 26, inklusive de med mycket få transkript. Framsteg inom smRNA FISH har utökat antalet olika transkript som kan detekteras på en gång 27 och antalet celler som kan profilerade på en gång 28, med tanke på lämplig utrustning. Även smRNA FISH har sina egna begränsningar (potentiella falskt positiva och falskt negativa avskrift upptäckt, begränsningar av endast ett fåtal målgener per cell, kostnaden för utrustning och reagenser), kan det ge en kraftfull metod för att komplettera och validera resultaten från en qPCR-baserad analys av en delmängd av målgener av intresse.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Acknowledgments

    Vi vill tacka V. Kapoor i CCR ETIB Flow Cytometry Kärna för hennes stöd för att utföra cellsortering under utvecklingen av detta protokoll. Vi vill också tacka M. Raffeld och enheten CCR LP molekylär diagnostik och J. Zhu och NHLBI DNA-sekvensering och Genomics Kärna för deras stöd att utföra qPCR under utvecklingen av detta protokoll. Denna forskning stöddes av Intramural Program för NIH.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    RNeasy Plus Mini Kit Qiagen 74134
    High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor ThermoFisher 4374966
    Phusion High-Fidelity DNA Polymerase New England BioLabs M0530S
    QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704
    Quant-iT High-Sensitivity dsDNA Assay Kit ThermoFisher Q33120 
    2.0 ml low adhesion microcentrifuge tubes USA Scientific 1420-2600
    DNA Suspension Buffer Teknova T0221
    Axygen 0.2 ml Maxymum Recovery Thin Wall PCR Tubes Corning PCR-02-L-C
    GE 96.96 Dynamic Array DNA Binding Dye Sample & Assay Loading Reagent Kit Fluidigm 100-3415
    HyClone RPMI 1640 media GE Healthcare Life Sciences SH30027.01
    Fetal Bovine Serum, Certified (US) ThermoFisher 16000-044
    Antibiotic-Antimycotic Solution Corning 30-004-CI
    Neocarzinostatin Sigma N9162
    ELIMINase Decon Labs 1101
    SUPERase-In ThermoFisher AM2696
    CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit ThermoFisher 11753500
    E. coli DNA Affymetrix 14380 10 MG
    ThermalSeal Sealing Film, Sterile Excel Scientific STR-THER-PLT
    BD FACSAria IIu BD Biosciences
    HyClone Trypsin 0.05% GE Healthcare Life Sciences SH30236.01
    PBS, 1x Corning 21-040-CV
    Falcon 40 µm Cell Strainer Corning 352340
    Exonuclease I New England BioLabs M0293S
    SsoFast EvaGreen Supermix with Low ROX Bio-Rad 172-5210
    96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression (microfluidic qPCR chip) Fluidigm BMK-M-96.96
    IFC Controller HX (loading machine) Fluidigm
    BioMark or BioMark HD (microfluidic qPCR machine) Fluidigm
    Real-Time PCR Analysis software  Fluidigm
    MATLAB software MathWorks

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Feinerman, O., Veiga, J., Dorfman, J. R., Germain, R. N., Altan-Bonnet, G. Variability and Robustness in T Cell Activation from Regulated Heterogeneity in Protein Levels. Science. 321, (5892), 1081-1084 (2008).
    2. Spencer, S. L., Gaudet, S., Albeck, J. G., Burke, J. M., Sorger, P. K. Non-genetic origins of cell-to-cell variability in TRAIL-induced apoptosis. Nature. 459, (7245), 428-432 (2009).
    3. Geva-Zatorsky, N., Rosenfeld, N., et al. Oscillations and variability in the p53 system. Mol. Syst. Biol. 2, (1), (2006).
    4. Colman-Lerner, A., Gordon, A., et al. Regulated cell-to-cell variation in a cell-fate decision system. Nature. 437, (7059), 699-706 (2005).
    5. Chong, S., Chen, C., Ge, H., Xie, X. S. Mechanism of Transcriptional Bursting in Bacteria. Cell. 158, (2), 314-326 (2014).
    6. Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. Stochastic mRNA Synthesis in Mammalian Cells. PLoS Biol. 4, (10), e309+ (2006).
    7. Senecal, A., Munsky, B., et al. Transcription Factors Modulate c-Fos Transcriptional Bursts. Cell Rep. 8, (1), 75-83 (2014).
    8. Dey, S. S., Foley, J. E., Limsirichai, P., Schaffer, D. V., Arkin, A. P. Orthogonal control of expression mean and variance by epigenetic features at different genomic loci. Mol. Syst. Biol. 11, (5), 806+ (2015).
    9. Dar, R. D., Razooky, B. S., et al. Transcriptional burst frequency and burst size are equally modulated across the human genome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, (43), 17454-17459 (2012).
    10. Thattai, M., van Oudenaarden, A. Stochastic gene expression in fluctuating environments. Genetics. 167, (1), 523-530 (2004).
    11. Porter, J. R., Fisher, B. E., Batchelor, E. p53 Pulses Diversify Target Gene Expression Dynamics in an mRNA Half-Life-Dependent Manner and Delineate Co-regulated Target Gene Subnetworks. Cell Syst. 2, (4), 272-282 (2016).
    12. Lahav, G., Rosenfeld, N., et al. Dynamics of the p53-Mdm2 feedback loop in individual cells. Nat. Genet. 36, (2), 147-150 (2004).
    13. Levine, A. J., Oren, M. The first 30 years of p53: growing ever more complex. Nat. Rev. Cancer. 9, (10), 749-758 (2009).
    14. Riley, T., Sontag, E., Chen, P., Levine, A. Transcriptional control of human p53-regulated genes. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, (5), 402-412 (2008).
    15. Ye, J., Coulouris, G., Zaretskaya, I., Cutcutache, I., Rozen, S., Madden, T. L. Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinf. 13, (1), 134 (2012).
    16. PCR Technologies: A Technical Guide. Sigma-Aldrich. St. Louis, MO. (2014).
    17. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2001).
    18. Batchelor, E., Mock, C. S., Bhan, I., Loewer, A., Lahav, G. Recurrent initiation: a mechanism for triggering p53 pulses in response to DNA damage. Mol. Cell. 30, (3), 277-289 (2008).
    19. Flow Cytometry: Principles and Applications. Humana Press. Totowa, NJ. (2007).
    20. Real-time PCR. Taylor & Francis. (2006).
    21. Song, L., Langfelder, P., Horvath, S. Comparison of co-expression measures: mutual information, correlation, and model based indices. BMC Bioinf. 13, (1), 328 (2012).
    22. Margolin, A. A., Nemenman, I., et al. ARACNE: An Algorithm for the Reconstruction of Gene Regulatory Networks in a Mammalian Cellular Context. BMC Bioinf. 7, (Suppl 1), (2006).
    23. Haff, L. A. Improved quantitative PCR using nested primers. PCR Methods Appl. 3, (6), 332-337 (1994).
    24. Hashimshony, T., Senderovich, N., et al. CEL-Seq2: sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq. Genome Biol. 17, 77 (2016).
    25. Ronander, E., Bengtsson, D. C., Joergensen, L., Jensen, A. T. R., Arnot, D. E. Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH). J. Vis. Exp. (68), e4073 (2012).
    26. Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat. Methods. 5, (10), 877-879 (2008).
    27. Lubeck, E., Cai, L. Single-cell systems biology by super-resolution imaging and combinatorial labeling. Nat. Methods. 9, (7), 743-748 (2012).
    28. Battich, N., Stoeger, T., Pelkmans, L. Image-based transcriptomics in thousands of single human cells at single-molecule resolution. Nat. Methods. 10, (11), 1127-1133 (2013).
    Encelliga profilering av genuttryck med FACS och qPCR med interna standarder
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Porter, J. R., Telford, W. G., Batchelor, E. Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards. J. Vis. Exp. (120), e55219, doi:10.3791/55219 (2017).More

    Porter, J. R., Telford, W. G., Batchelor, E. Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards. J. Vis. Exp. (120), e55219, doi:10.3791/55219 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter