Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Genetics

وحيدة الخلية التعبير الجيني التنميط عن طريق نظام مراقبة الأصول الميدانية وQPCR مع المعايير الداخلية

doi: 10.3791/55219 Published: February 25, 2017

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

الخلايا الفردية في عدد السكان يمكن أن تظهر استجابات متباينة على نطاق واسع لحافز موحد الفسيولوجية 4. التباين الوراثي للخلايا في عدد السكان هو آلية واحدة لهذا التنوع من الردود، ولكن هناك أيضا العديد من العوامل غير الوراثية التي يمكن أن تزيد من تنوع الاستجابات، حتى في عدد السكان نسيلي من الخلايا. على سبيل المثال، يمكن للمستويات البروتينات الفردية وغيرها من الجزيئات يشير مهمة تختلف على أساس خلية من خلايا، مما أدى إلى اختلاف في ملامح التعبير الجيني المصب. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يحدث تنشيط الجينات في رشقات نارية قصيرة المدة من النصوص 6 يمكن أن تقتصر على عدد قليل نسبيا من النصوص في انفجار 9. هذهstochasticity في تفعيل الجينات يمكن أن يساهم إلى حد كبير في التغير في الاستجابات البيولوجية ويمكن أن توفر ميزة انتقائية في الكائنات الحية الدقيقة 10 وفي خلايا الثدييات 2 الاستجابة لحافز الفسيولوجية. بسبب كل من المصادر الوراثية وغير الوراثية من الاختلاف، والوضع التعبير الجيني في أي خلية معينة في استجابة لحافز قد تختلف كثيرا عن متوسط ​​الشخصي التعبير الجيني تم الحصول عليها من قياس استجابة كبيرة. تحديد المدى الذي تظهر الخلايا الفردية التباين في استجابة لحافز يتطلب تقنيات لعزل الخلايا الفردية، وقياس مستويات التعبير عن نسخ من الفائدة، والتحليل الحسابي للبيانات التعبير الناتجة عن ذلك.

هناك عدة طرق لمعايرة التعبير الجيني في الخلايا واحد، وتغطي مجموعة واسعة من التكاليف، وعدد من النصوص سبر، ودقة القياس الكمي. على سبيل المثال، وحيدة الخلية RNA تسلسل يقدم عمق واسعة من تغطية نص والقدرة على تحديد الآلاف من النصوص المتميزة للجينات أكثر أعرب للغاية في الخلايا الفردية. ومع ذلك، فإن التكاليف المرتبطة بهذا العمق التسلسل يمكن أن تكون باهظة، على الرغم من أن تكاليف تستمر في الانخفاض. على العكس من ذلك، واحد جزيء RNA مضان في الموقع التهجين (smRNA FISH) يقدم الكمي الدقيق للنصوص حتى لأدنى مستوى في التعبير عن الجينات بتكلفة معقولة في الجينات في المصالح. ومع ذلك، سوى عدد قليل من الجينات المستهدفة يمكن يعاير في خلية معينة من قبل هذا النهج. الكمية المقايسات PCR القائم، وصفت في هذا البروتوكول، وتوفر حلا وسطا بين هذه التقنيات. هذه المقايسات توظف في الوقت الحقيقي PCR آلة الموائع الدقيقة لقياس ما يصل إلى 96 نسخ من الفائدة في وقت ما يصل الى 96 الخلايا. في حين أن كل الطرق المذكورة أعلاه لديها تكاليف الأجهزة المطلوبة، فإن تكلفة أي فحص QPCR الفردية هي نسبيامنخفض. ويتم تكييف هذا البروتوكول من واحد اقترح من قبل الشركة المصنعة للفي الوقت الحقيقي آلة PCR الموائع الدقيقة (بروتوكول ADP 41، Fluidigm). لتمكين تقدير العدد المطلق للكل نص في النهج القائم على PCR، قمنا بتوسيع بروتوكول للاستفادة من الضوابط الداخلية للamplicons الجين المستهدف مستعدة التي يمكن استخدامها عبر تجارب متعددة.

وكمثال على هذا الأسلوب، يتم وصف الكمي للتعبير عن الجينات التي تنظمها القامع البروتين p53 ورم في قدم مكعبة-7 خلايا سرطان الثدي البشرية 11. وتحدى الخلايا مع وكيل الكيميائية التي يدفع الحمض النووي فواصل مزدوج الجديلة. وقد أظهرت دراسات سابقة أن الاستجابة البروتين p53 على الحمض النووي فواصل مزدوج الجديلة يسلك قدرا كبيرا من عدم التجانس في الخلايا الفردية، سواء من حيث مستويات البروتين p53 12 و في تفعيل الجينات المستهدفة متميزة (11). وعلاوة على ذلك، البروتين p53 ينظم التعبير عن أكثر من 100تتميز جيدا الجينات المستهدفة المشاركة في العديد من مسارات المصب، بما في ذلك الاعتقال دورة الخلية، موت الخلايا المبرمج، والشيخوخة 13 و 14. لأن استجابة بوساطة البروتين p53 في كل خلية على حد سواء معقدة ومتغيرة، وتحليل فوائد النظام من توجه فيه ما يقرب من 100 الجينات المستهدفة يمكن سبر في وقت واحد في الخلايا الفردية، مثل تلك التي وصفها أدناه. مع تعديلات طفيفة (مثل طرق بديلة لعزل وحيدة الخلية وتحلل)، وبروتوكول يمكن تكييفه بسهولة لدراسة مجموعة واسعة من أنواع الثدييات الخلية، والنصوص، والاستجابات الخلوية.

مع الإعداد المسبق السليم، ويمكن إجراء جولة من فرز الخلايا وقياس التعبير الجيني وفقا لهذا البروتوكول على مدى ثلاثة أيام. ويقترح توقيت التالية: مقدما، حدد نسخ من الفائدة، وتحديد والتحقق من صحة أزواج التمهيدي أن تضخيم [كدنا من تلك transcrIPTS، وإعداد المعايير ويمزج التمهيدي باستخدام تلك الاشعال. في يوم 1 بعد العلاج بالخلايا، والحصاد وفرز الخلايا، نفذ عكس النسخ ومحددة التضخيم الهدف، ومعالجة العينات مع نوكلياز خارجية لإزالة الاشعال الفردية. في يوم 2، نفذ مراقبة الجودة على خلايا فرز باستخدام QPCR. وأخيرا، في يوم 3، وقياس التعبير الجيني في الخلايا مرتبة باستخدام ميكروفلويديك QPCR. ويلخص الشكل 1 الخطوات المتبعة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RNeasy Plus Mini Kit Qiagen 74134
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor ThermoFisher 4374966
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase New England BioLabs M0530S
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704
Quant-iT High-Sensitivity dsDNA Assay Kit ThermoFisher Q33120 
2.0 ml low adhesion microcentrifuge tubes USA Scientific 1420-2600
DNA Suspension Buffer Teknova T0221
Axygen 0.2 ml Maxymum Recovery Thin Wall PCR Tubes Corning PCR-02-L-C
GE 96.96 Dynamic Array DNA Binding Dye Sample & Assay Loading Reagent Kit Fluidigm 100-3415
HyClone RPMI 1640 media GE Healthcare Life Sciences SH30027.01
Fetal Bovine Serum, Certified (US) ThermoFisher 16000-044
Antibiotic-Antimycotic Solution Corning 30-004-CI
Neocarzinostatin Sigma N9162
ELIMINase Decon Labs 1101
SUPERase-In ThermoFisher AM2696
CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit ThermoFisher 11753500
E. coli DNA Affymetrix 14380 10 MG
ThermalSeal Sealing Film, Sterile Excel Scientific STR-THER-PLT
BD FACSAria IIu BD Biosciences
HyClone Trypsin 0.05% GE Healthcare Life Sciences SH30236.01
PBS, 1x Corning 21-040-CV
Falcon 40 µm Cell Strainer Corning 352340
Exonuclease I New England BioLabs M0293S
SsoFast EvaGreen Supermix with Low ROX Bio-Rad 172-5210
96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression (microfluidic qPCR chip) Fluidigm BMK-M-96.96
IFC Controller HX (loading machine) Fluidigm
BioMark or BioMark HD (microfluidic qPCR machine) Fluidigm
Real-Time PCR Analysis software  Fluidigm
MATLAB software MathWorks

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Feinerman, O., Veiga, J., Dorfman, J. R., Germain, R. N., Altan-Bonnet, G. Variability and Robustness in T Cell Activation from Regulated Heterogeneity in Protein Levels. Science. 321, (5892), 1081-1084 (2008).
  2. Spencer, S. L., Gaudet, S., Albeck, J. G., Burke, J. M., Sorger, P. K. Non-genetic origins of cell-to-cell variability in TRAIL-induced apoptosis. Nature. 459, (7245), 428-432 (2009).
  3. Geva-Zatorsky, N., Rosenfeld, N., et al. Oscillations and variability in the p53 system. Mol. Syst. Biol. 2, (1), (2006).
  4. Colman-Lerner, A., Gordon, A., et al. Regulated cell-to-cell variation in a cell-fate decision system. Nature. 437, (7059), 699-706 (2005).
  5. Chong, S., Chen, C., Ge, H., Xie, X. S. Mechanism of Transcriptional Bursting in Bacteria. Cell. 158, (2), 314-326 (2014).
  6. Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. Stochastic mRNA Synthesis in Mammalian Cells. PLoS Biol. 4, (10), e309+ (2006).
  7. Senecal, A., Munsky, B., et al. Transcription Factors Modulate c-Fos Transcriptional Bursts. Cell Rep. 8, (1), 75-83 (2014).
  8. Dey, S. S., Foley, J. E., Limsirichai, P., Schaffer, D. V., Arkin, A. P. Orthogonal control of expression mean and variance by epigenetic features at different genomic loci. Mol. Syst. Biol. 11, (5), 806+ (2015).
  9. Dar, R. D., Razooky, B. S., et al. Transcriptional burst frequency and burst size are equally modulated across the human genome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, (43), 17454-17459 (2012).
  10. Thattai, M., van Oudenaarden, A. Stochastic gene expression in fluctuating environments. Genetics. 167, (1), 523-530 (2004).
  11. Porter, J. R., Fisher, B. E., Batchelor, E. p53 Pulses Diversify Target Gene Expression Dynamics in an mRNA Half-Life-Dependent Manner and Delineate Co-regulated Target Gene Subnetworks. Cell Syst. 2, (4), 272-282 (2016).
  12. Lahav, G., Rosenfeld, N., et al. Dynamics of the p53-Mdm2 feedback loop in individual cells. Nat. Genet. 36, (2), 147-150 (2004).
  13. Levine, A. J., Oren, M. The first 30 years of p53: growing ever more complex. Nat. Rev. Cancer. 9, (10), 749-758 (2009).
  14. Riley, T., Sontag, E., Chen, P., Levine, A. Transcriptional control of human p53-regulated genes. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, (5), 402-412 (2008).
  15. Ye, J., Coulouris, G., Zaretskaya, I., Cutcutache, I., Rozen, S., Madden, T. L. Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinf. 13, (1), 134 (2012).
  16. PCR Technologies: A Technical Guide. Sigma-Aldrich. St. Louis, MO. (2014).
  17. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2001).
  18. Batchelor, E., Mock, C. S., Bhan, I., Loewer, A., Lahav, G. Recurrent initiation: a mechanism for triggering p53 pulses in response to DNA damage. Mol. Cell. 30, (3), 277-289 (2008).
  19. Flow Cytometry: Principles and Applications. Humana Press. Totowa, NJ. (2007).
  20. Real-time PCR. Taylor & Francis. (2006).
  21. Song, L., Langfelder, P., Horvath, S. Comparison of co-expression measures: mutual information, correlation, and model based indices. BMC Bioinf. 13, (1), 328 (2012).
  22. Margolin, A. A., Nemenman, I., et al. ARACNE: An Algorithm for the Reconstruction of Gene Regulatory Networks in a Mammalian Cellular Context. BMC Bioinf. 7, (Suppl 1), (2006).
  23. Haff, L. A. Improved quantitative PCR using nested primers. PCR Methods Appl. 3, (6), 332-337 (1994).
  24. Hashimshony, T., Senderovich, N., et al. CEL-Seq2: sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq. Genome Biol. 17, 77 (2016).
  25. Ronander, E., Bengtsson, D. C., Joergensen, L., Jensen, A. T. R., Arnot, D. E. Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH). J. Vis. Exp. (68), e4073 (2012).
  26. Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat. Methods. 5, (10), 877-879 (2008).
  27. Lubeck, E., Cai, L. Single-cell systems biology by super-resolution imaging and combinatorial labeling. Nat. Methods. 9, (7), 743-748 (2012).
  28. Battich, N., Stoeger, T., Pelkmans, L. Image-based transcriptomics in thousands of single human cells at single-molecule resolution. Nat. Methods. 10, (11), 1127-1133 (2013).
وحيدة الخلية التعبير الجيني التنميط عن طريق نظام مراقبة الأصول الميدانية وQPCR مع المعايير الداخلية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Porter, J. R., Telford, W. G., Batchelor, E. Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards. J. Vis. Exp. (120), e55219, doi:10.3791/55219 (2017).More

Porter, J. R., Telford, W. G., Batchelor, E. Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards. J. Vis. Exp. (120), e55219, doi:10.3791/55219 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter