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Genetics

Unicelular perfil de expressão de genes utilizando FACS e qPCR com as Normas Internas

doi: 10.3791/55219 Published: February 25, 2017

Introduction

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As células individuais em uma população pode mostrar respostas muito diferentes a um estímulo uniforme fisiológico 1, 2, 3, 4. A variação genética de células numa população é um mecanismo para essa variedade de respostas, mas também existem vários factores não genéticos que podem aumentar a variabilidade das respostas, mesmo numa população clonal de células. Por exemplo, os níveis de proteínas individuais e outras moléculas de sinalização importantes pode variar numa base de célula-por-célula, dando origem a variações nos perfis de expressão de gene a jusante. Além disso, a activação do gene pode ocorrer em rajadas de curta duração de transcritos de 5, 6, que pode ser limitada a um número relativamente pequeno de transcritos por explosão 7, 8, 9. Talestocasticidade em activação do gene pode contribuir grandemente para a variabilidade na resposta biológica e pode proporcionar uma vantagem selectiva em microorganismos e 10 em células de mamífero 1, 2 respondendo a um estímulo fisiológico. Devido às duas fontes genéticos e não genéticos de variação, o perfil de qualquer célula em resposta a um estímulo a expressão do gene pode ser muito diferente da média do perfil de expressão do gene obtido a partir da medição da resposta grandes quantidades. Determinação da extensão à qual as células individuais mostram a variabilidade em resposta a um estímulo requer técnicas para o isolamento de células individuais, a medição dos níveis de expressão de transcritos de interesse, e a análise computacional de dados de expressão resultantes.

Existem várias abordagens para ensaiar a expressão do gene em células individuais, que cobrem uma vasta gama de custos, número de transcritos sondado, eprecisão da quantificação. Por exemplo, uma única célula de RNA-Seq oferece uma grande profundidade de cobertura de transcrição e a capacidade de quantificar milhares de transcritos distintos para os genes mais altamente expresso em células individuais; No entanto, o custo associado com tal profundidade de sequenciação pode ser proibitivo, embora os custos de continuar a diminuir. Por outro lado, uma única molécula de RNA hibridização fluorescente in situ (FISH smRNA) oferece uma quantificação precisa de transcrições, mesmo para baixo expressar genes a um custo razoável por gene de interesse; No entanto, apenas um pequeno número de genes alvo podem ser ensaiados numa dada célula por esta abordagem. Quantitativas ensaios baseados em PCR, descritos neste protocolo, fornecer um meio termo entre essas técnicas. Estes ensaios empregam um real-time PCR máquina microfluídico para quantificar até 96 transcrições de interesse em um momento em até 96 células. Enquanto cada um dos métodos acima mencionados tem custos de hardware requeridas, o custo de qualquer ensaio qPCR indivíduo é relativamentebaixo. Este protocolo é adaptado de um sugerido pelo fabricante de um real-time PCR máquina microfluídico (Protocolo ADP 41, Fluidigm). Para habilitar a estimativa do número absoluto de cada transcrito em uma abordagem baseada em PCR, nós expandimos o protocolo para fazer uso dos controles internos de amplicons do gene alvo preparados que podem ser usados ​​em vários experimentos.

Como um exemplo desta técnica, a quantificação da expressão de genes regulados por o supressor de tumor p53 em células MCF-7 de carcinoma da mama humano está descrito 11. As células são desafiadas com um agente químico que induz quebras de ADN de cadeia dupla. Estudos anteriores demonstraram que a resposta da p53 a ADN quebras de cadeia dupla apresenta uma grande quantidade de heterogeneidade em células individuais, quer em termos de níveis de p53 e 12 na activação de genes alvo distintas 11. Além disso, a p53 regula a expressão de mais de 100bem caracterizado genes alvo envolvidas em numerosas vias a jusante, incluindo a paragem do ciclo celular, a apoptose, senescência e 13, 14. Uma vez que a resposta mediada por p53 em cada célula é complexa e variável, a análise dos benefícios do sistema a partir de uma abordagem em que cerca de 100 genes alvo podem ser sondados simultaneamente em células individuais, tais como os descritos abaixo. Com ligeiras modificações (tais como métodos alternativos para o isolamento de uma única célula e de lise), o protocolo pode ser facilmente adaptado para estudar uma ampla gama de tipos de células de mamíferos, transcrições e respostas celulares.

Com preparação prévia adequada, uma rodada de separação de células e medição expressão do gene pode ser realizada de acordo com este protocolo durante um período de três dias. O seguinte calendário é sugerido: com antecedência, selecione as transcrições de interesse, identificar e validar os pares de primers que amplificam o cDNA daqueles transcrIPTS, e preparar as normas e misturas de iniciadores que utilizam esses iniciadores. No dia 1, após o tratamento de células, e colheita classificar as células, realizar a transcrição reversa e a amplificação do alvo específico, e tratar as amostras com uma exonuclease para remover os iniciadores não incorporados. No dia 2, realizar o controle de qualidade sobre células classificadas usando qPCR. Finalmente, no dia 3, medir a expressão genética nas células classificadas usando microfluídico qPCR. A Figura 1 resume as etapas envolvidas.

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Protocol

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1. Preparação Prévia

  1. Escolha até 96 genes de interesse cuja expressão será medido.
    NOTA: Pelo menos um destes genes deve ser um "gene housekeeping", tais como ACTB ou GAPDH, que é conhecido por ser expresso a um relativamente elevado nível constante e sob as condições utilizadas na experiência. Este gene irá ser utilizada para identificar poços ordenadas positivamente (passo 8.1) e amostras amplificadas (passo 10.1).
    NOTA: Para o exemplo experimento, bem caracterizado, alvos diretos de p53 com uma variedade de funções conhecidas 11, 14 e GAPDH como foram selecionados um controle de limpeza. Por favor ver a referência 11 para a lista completa dos genes alvo e sequências iniciadoras usadas neste estudo.
  2. Identificar pares de iniciadores potenciais específicos para os genes de interesse (por exemplo, usando a literatura científica ou de uma ferramenta de desenho de primers tais como Primer-BLAST) 15. Tem o primeré sintetizada e mantê-las numa concentração estoque de 100 mM em água livre de nuclease.
    NOTA: Estes primers deve ser 15-25 bases de comprimento; produzir um fragmento amplificado 90-130 pares de bases (pb) de comprimento; abranger uma junção de exões, se existir, para reduzir a possibilidade de amplificação de ADN genómico; têm temperaturas de fusão de 60 ± 1 ° C; e tem estrutura secundária mínima 16. Estes iniciadores serão utilizados para transcrição reversa privilegiada, amplificar ADNc a partir dos transcritos de interesse, e medir a expressão de genes no DNA qPCR ligação à base de corantes.
  3. Validar os primers.
    1. Em primeiro lugar, obter ADNc a partir das células de interesse. Colheita de ARN a partir das células utilizando um estojo de colheita de ARN de acordo com as instruções do fabricante ou métodos de biologia molecular padrão 17. Reverse-transcrever o ARN em ADNc utilizando um kit de transcrição reversa com hexâmeros aleatórios de acordo com as instruções do fabricante ou meto padrãods 17.
    2. Para cada par de iniciadores, configurar qPCR com corante de ligação a ADN mistura principal, iniciadores directos e inversos, e o ADNc a partir do passo anterior, seguindo as recomendações do fabricante da mistura mestre para as condições de reacção propostas. Executar estas reacções de uma máquina de PCR em tempo real, utilizando um protocolo de ciclos térmicos recomendado pelo fabricante mistura principal que inclui aquisição curva de fusão.
    3. Após a qPCR, executar as amostras de DNA amplificado num W 2% de gel de agarose / v e visualizar o DNA através de um corante intercalante de ADN, seguindo um protocolo padrão 17.
    4. Determinar a eficiência do par de iniciadores com a construção de uma curva padrão a partir de diluições em série de ADNc (fabricado no passo 1.3.1) de acordo com um protocolo padrão 16.
      NOTA: Um bom par iniciador irão gerar uma curva de fusão com uma única, pico bem definido e uma única banda na localização esperada sobre o gel 16, -se class = "xref"> 17 (Figura 2). Se a curva de fusão tem vários picos ou um "ombro", ou se o gel tem múltiplas bandas ou um esfregaço, os iniciadores são amplificar uma sequência fora do alvo. Redesenhar quaisquer iniciadores que têm sido observados para amplificar sequências fora do alvo e repetir os passos anteriores de validação, conforme necessário. Um bom par de iniciadores também terão uma eficiência de 90-110%, com R2 ≥0.985 para a curva padrão de 16; redesenhar quaisquer iniciadores para o qual a eficiência ou R2 queda fora destas gamas.
  4. Prepare os padrões de amplicons DNA purificado.
    1. Para cada par de primers validado:
      1. Amplificar a região de interesse a partir de ADNc, utilizando uma ADN polimerase de alta fidelidade de acordo com as recomendações do fabricante para a polimerase de concentração de iniciador e molde de ADN, condições de reacção e as condições dos ciclos de PCR, ou utilizando um protocolo de PCR convencional"xref"> 17.
      2. Executar o ADNc amplificado num W 2% de gel de agarose / v e visualizar a banda com um corante intercalante de ADN 17. EXCISE a banda que representa o fragmento amplificado utilizando uma lâmina de barbear limpo e colocar a peça de gel num tubo de microcentrífuga.
      3. Purifica-se o fragmento amplificado a partir do gel utilizando um procedimento padrão de extracção de gel, tal como uma extracção à base de agarase 17 ou um kit de extracção de gel de spin-coluna, de acordo com as instruções do fabricante.
      4. Medir a concentração do fragmento amplificado usando um kit de quantificação dsDNA à base de fluorescência de acordo com as instruções do fabricante. Dividir a concentração dsDNA medido pelo peso molecular conhecido do fragmento amplificado com base na sequência amplicão para obter o número de moléculas de amplicon por ul.
      5. Em um tubo de 2,0 mL de microcentrífuga de ligação baixa, adicionar 2 ul do fragmento amplificado purificada até um volume de tampão de suspensão de ADN de tal forma que a concentração final do amplificadorLicon é de 5 x 10 8 moléculas / ul.
    2. Quando todos os produtos de amplificação foram purificados, combinar 18 ul de cada fragmento amplificado purificada num tubo de 2,0 ml de ligação a partir de microcentrífuga. Adicionar tampão de suspensão de ADN para fazer um volume total de 1800 mL; Assim, a concentração de cada fragmento amplificado é de 5 x 10 6 moléculas / ul.
      NOTA: esta mistura, que contém produtos de amplificação de cDNA a partir de todos os genes de interesse em quantidades equimolares conhecidos, irá servir como um padrão em unicelular qPCR.
    3. Vortex este "5E6" padrão completamente, rotação durante 10 segundos a 2.000 xg, e dividir em 20 mL alíquotas em tubos de ligação baixa de PCR. Armazenar as alíquotas a -80 ° C.
  5. Preparar a mistura de amplificação do alvo específico (STA) primário (10x).
    1. Num tubo de 15 ml, combinar 25 ul de 100 uM de cada iniciador de estoque (até 192). Adicionar tampão de suspensão de ADN para fazer um volume total de 5000 ul.
      Note oconcentração de cada iniciador nesta mistura é de 500 nM. Cada placa de células classificadas usará 105,6 ul desta mistura de iniciadores para iniciar a transcrição reversa e amplificação do alvo específico. O volume de mistura de iniciadores dado aqui é o suficiente para fazer 45 placas para classificar. É aconselhável fazer um volume suficientemente grande de mistura de iniciador de modo que ele apenas necessita de ser feita uma vez; dimensionar os volumes conforme necessário.
    2. Misturar bem num vórtice, e dividem-se em 110 mL alíquotas, e armazenar as alíquotas a -20 ° C.
  6. Preparar misturas de ensaio, um para cada par de iniciadores, para uso em qPCR baseado em chip de microfluidos.
    1. Em cada poço de uma placa com 96 poços de PCR, combinar 3,0 ul de iniciador para a frente 100 uM para um dado gene, 3,0 ul de 100 uM iniciador inverso correspondente, 24,0 ul de tampão de suspensão de ADN e 30,0 ul de 2x reagente de ensaio de carregamento .
    2. Vortex esta placa, rotação durante 10 segundos a 500 xg, e armazenar a -20 ° C.
  7. Criar dois programas de ciclos térmicos: RTSTA (transcrição e a amplificação do alvo específico reversa; Tabela 1) e ExoI (exonuclease I tratamento; Tabela 2).

2. Tratamento

  1. Placa as células de mamífero em uma placa de cultura de tecido de tal forma que eles irão crescer até à confluência desejada no momento do tratamento, dependendo das condições do estudo experimental. Para o exemplo apresentado neste estudo, placa de 4 x 10 5 células MCF-7 p53-Vénus 18 por disco de 6 cm em meio RPMI com soro a 10% de bovino fetal (FBS), 100 U / ml de penicilina, 100 mg / mL de estreptomicina, e 250 ng / mL de anfotericina B. Incubar as células durante dois dias a 37 ° C com 5% de CO2 até atingirem 50% de confluência.
  2. Tratar as células para estabelecer a condição de interesse com base no estudo experimental. Para o exemplo apresentado neste estudo, incubar células p53-Vénus MCF-7 com 400 ng / ml neocarzinoestatina durante 3 horas, 8,5 horas, 14 horas ou 24 horas.

3. Tampão de Lise Preparação para a Seleção celular

NOTA: Fazendo uma única placa de lise leva cerca de 1 hora. É aconselhável fazer e tipo múltipla placas, como separação de células pode ser ineficiente e render muitos poços com nenhuma célula detectável.

  1. Limpe o banco, pipetas, suporte de tubos, suportes para pratos de PCR frias, e as luvas com uma solução de DNA de descontaminação em preparação para a PCR.
  2. Dilui-se o inibidor de RNase a 2,64 U / mL por adição de inibidor da ARNase para nuclease isenta de água em um tubo de 1,5 ml.
    NOTA: Este permite inibidor de RNase para ser adicionado ao tampão de lise sem pipetagem de volumes de sub-ul.
  3. Adicione tampão de lise para as células através da combinação dos componentes listados na Tabela 3.
  4. Transferir 92,4 mL do tampão de lise para as células para um tubo separado; este vai ser o tampão de lise para os padrões amplicon.
  5. usando loW de ligação a pontas de pipetas e tubos de microcentrífuga, preparar 200 ul e 500 ul de ADN de E. coli diluídos para 3,1 ug / uL e 6,2 pg / mL, respectivamente, com o tampão de suspensão de ADN.
  6. Adicionar 184.8 ul de / ul ADN de E. coli 3,1 pg E. ao tampão de lise para as células.
    NOTA: O ADN de E. coli portadora serve para alargar o âmbito de possibilidades de ligação não específica do iniciador e, assim, reduzir a probabilidade de que a dimerização iniciador irá levar a um produto de PCR.
  7. Prepare padrões.
    1. Rotular seis tubos de ligação baixa de microcentrífuga como 5e5, 5E4, ... 5e0.
    2. Adicionar 90 ul de tampão de suspensão de ADN para o tubo "5e5".
    3. Adicionar 90 ul de / ul de ADN de 6,2 pg coli E. a cada um dos outros cinco tubos. Mantenha todos os tubos em gelo.
      NOTA: A incorporação de ADN transportador para as normas torna a massa total de ADN nos poços de padrão comparáveis ​​aos que nos poços 1-celulares; isto reduz a probability que a concentração de normas será afectado pela ligação de ADN para tubos ou pontas de pipeta.
    4. Tomar uma aliquota do padrão "5E6" (5 x 10 6 moléculas / uL de cada fragmento amplificado, preparado no passo 1.4) de armazenagem. Vortex brevemente e girar rapidamente (5 seg a 500 xg) para assegurar que o líquido está no fundo do tubo.
    5. Usando uma ponta de ligação de baixo pipeta, adicionar 10 ul de padrão 5E6 ao tubo "5e5". Vortex brevemente, rotação (5 seg a 500 xg), e colocar o tubo de volta no gelo.
    6. Pipetar 10 ul do "5e5" tubo no "5E4" tubo. Vortex brevemente, rotação (5 seg a 500 xg), e colocar de volta no gelo.
    7. Repita essas diluições em série, com cada tubo 10 ul de receber o tubo anterior, até que todos os tubos têm uma diluição do padrão.
  8. Prepare uma fileira de 12 tubos de PCR com tampas. Distribuir 67 ul de tampão de lise "célula" a cada tubo. Tampe os tubos e girar rapidamente (5seg a 500 xg), se necessário.
  9. Utilizando uma pipeta de 12 canais, distribuir 9 ul de tampão de lise "célula" a partir da linha de tubos de PCR em cada cavidade das primeiras linhas 7 de uma placa de PCR (Figura 3).
  10. Distribuir 7 ul de tampão de lise "padrão" para cada uma das cavidades da última fila da placa (Figura 3).
  11. Usando pontas de pipetas de ligação baixa, adicionar 2 ul de padrão para cada poço da linha inferior de acordo com o mapa da placa (Figura 3).
    NOTA: 2 ul de 5 x 10 0 moléculas / valores ul padrão para 10 moléculas, etc.
  12. Adicionar 2 mL de / ul ADN de E. coli 3,1 pg E. nas cavidades 10 e de células de 100 células; adicionar 2 mL de / ul de ADN de 6,2 pg coli E. nas cavidades não-celulares.
    Nota: cada, 10-célula 1-célula e célula-100 tem também 6,2 pg de ADN de E. coli, de uma aproximação da massa de ADN genómico de uma única célula humana. Cada poço padrão e não-célula tem 12,4 pg of E. coli DNA, no valor de cerca de duas células humanas '.
  13. Selar a placa com um selo térmico estéril, centrifugação durante 5 seg a 500 xg, e armazenar a 4 ° C até as células estão prontas para classificação.

Setup Sorter 4. celular

  1. Programar o separador de células activado por fluorescência para classificar em uma placa de 96 cavidades de acordo com o mapa da placa (Figura 3); nenhuma célula devem ser classificados em poços H1-H8 ou H11-H12.
  2. Verifique se o classificador de células é bem voltado para a classificação em uma placa de PCR.
    1. Defina o ângulo do fluxo de tipo ao mínimo possível; Essa configuração aumenta a chance de que as células serão classificados no fundo dos poços, em vez de bater os lados.
    2. Para objectivo da máquina, vedar uma placa de PCR vazio e utilizar o fluxo de teste para "sort" gotas de PBS para a vedação da placa vazia, de acordo com as instruções da máquina 19; as gotículas deveria pousar em the a superfície da vedação numa posição acima do centro do poço. Para obter os melhores resultados, o objectivo verificar a todo o comprimento e largura da placa.
    3. Se as gotículas não pousar na posição correta, limpe-os para fora da superfície do selo, recalibrar o classificador de células de acordo com as instruções do fabricante da máquina, e repetir até que as gotas no fluxo tipo são depositados corretamente.

5. celular colheita e classificação

  1. Trypsinize as células como apropriados para a linha celular. Por exemplo, para as células MCF-7, aspirar o meio a partir das células, lavar as células com 1 ml de tripsina a 0,05%, e incuba-se as células com 2 ml de 0,05% de tripsina durante 5 min a 37 ° C e 5% de CO 2 .
  2. Adicionar 8 mL de meio de cultura de células para as células tratadas com tripsina e transferir todos os 10 mL de suspensão de células para um tubo de 15 ml. Centrifugar durante 4 minutos a 400 x g.
  3. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em PBS + 2% FBS. <br /> NOTA: Um volume de ressuspensão menor concentra as células e facilita a separação de células; um volume de ressuspensão 500 ul funciona bem para uma disco de 6 cm de células a 50% de confluência.
  4. Transferir a suspensão de células para 5 ml de uma tubo de citometria de fluxo, de pipetagem através de um filtro de 40 um para remover aglomerados de células.
  5. Centrifuga-se o prato de tampão de lise a 400 xg durante 30 seg a 4 ° C antes da separação das células para assegurar que o líquido está no fundo dos poços.
  6. Inserir o tubo com a suspensão de células no separador de células. Abra o vedante na placa de tampão de lise e classificar cuidadosamente as células de interesse para a placa de acordo com o mapa da placa e seguindo as instruções do fabricante do classificador de células 19. Para garantir que as células individuais são classificadas com a pureza máxima, executar a máquina em modo "única célula" e usar citometria de fluxo padrão gating com base na dispersão frontal e lateral 19.
    NOTA: Noexemplo experimento, porta as células com base na p53-Venus fluorescência para isolar o mais brilhante de 15% das células individuais 11.
  7. Selar a placa com um novo selo estéril térmica e centrifugar a 400 xg durante 1 min a 4 ° C. Coloque a placa no termociclador e executar o programa RTSTA (veja o passo 1.7).
    NOTA: Este realiza transcrição reversa no ARNm das células classificadas e amplifica-o cDNA das transcrições de interesse.

6. Tratamento com exonuclease

  1. Misture diluído exonuclease I, combinando os componentes indicados no Quadro 4. Prepare uma fileira de 12 tubos de PCR com tampas. Distribuir 30,5 ul de exonuclease I diluída em cada tubo. Tapar os tubos e girar rapidamente (5 seg a 500 xg) para assegurar que o líquido está no fundo do tubo.
  2. Quando o RTSTA estiver concluído, girar a placa de amostra para 5 seg a 500 x g. Utilizando uma pipeta de 12 canais, distribuir 3,6 ul de exonuclease diluídoI em cada poço da placa.
  3. Selar a placa com uma vedação térmica estéril e brevemente rotação (5 seg a 500 xg). Coloque a placa no termociclador e executar o programa ExoI (veja o passo 1.7).
    Nota: Esta etapa degrada quaisquer iniciadores remanescentes após a amplificação do alvo específico para que eles não vão interferir com o futuro PCR.

Diluição 7. Amostra

  1. Quando o tratamento com exonuclease for concluída, adicionar 32,4 mL de tampão TE a cada poço da placa de amostra; este é um ponto de paragem opcional, e as amostras podem ser armazenadas a -20 ° C durante vários dias.

8. Organizar controlo de qualidade utilizando qPCR

Observação: Como separação de células não é perfeitamente eficaz, este passo é necessário identificar quais os alvéolos da placa ordenada efectivamente recebido uma célula. Essas amostras podem então ser utilizadas para análise posterior.

  1. Medir a expressão de gene de manutenção em cada amostra por qPCR.
  2. Preparar 900 ul de ADN de ligação de corante de qPCR Master Mix para 96 ​​reacções de acordo com os iniciadores de protocolo do fabricante utilizando a polimerase para um dos genes de manutenção seleccionadas no passo 1.1; as concentrações exactas de tampão de reacção, polimerase, iniciadores, etc, para esta reacção dependerão da polimerase específico a ser utilizado.
  3. Distribuir 9 ul de mistura principal para cada poço de uma placa de 96 poços de PCR. Adicionar 1 ml de amostra da placa de amostra para o correspondente poço da placa de PCR.
  4. Executar a placa em uma máquina PCR em tempo real utilizando um protocolo de ciclos térmicos sugerido pelo fabricante ou mestre mistura seguindo um protocolo padrão 20.
  • Analisar os dados qPCR 20; um exemplo de dados a partir de qPCR os passos de controlo de qualidade de classificação listadas abaixo é mostrado na Figura 4.
    1. Verifique se as medições dos poços sem células mostram um nível baixo (ao fundo)da expressão do gene ou nenhuma expressão em todos os.
    2. Verificar que as medições de poços 1-celulares claramente dividir em dois grupos: as amostras positivas com elevada expressão de genes e as amostras negativas com os níveis de base de expressão ou nenhuma expressão em todos os semelhantes, para os poços não-celulares.
      NOTA: As amostras com alta expressão de gene representam células classificadas reais; aqueles com expressão fundo devem ser excluídos da análise posterior.
    3. Verificar que as medições dos poços 10 e 100 células de célula reflectem uma maior expressão de genes do que nos poços 1-célula positiva, permitindo a possibilidade de que poderia causar triagem ineficiente esses poços ter menos células do que o desejado.
    4. Verificar que as medições a partir dos poços de padrão estão uniformemente distribuídas no espaço logarítmica (isto é, que os valores de C T estão uniformemente distribuídos).
  • Depois de identificar todas as amostras 1 de células positivas, fazer um mapa da placa "Sample Mixes" para mapear positiva 1-cell amostras para uma nova placa de 96 poços. Incluem oito poços para padrões neste mapa prato. Ver Figura 5, para um exemplo.
  • Medição Expressão 9. Gene Usando Microfluidic qPCR

    NOTA: Para cada passo nesta secção, pipeta apenas para o primeiro batente para minimizar a formação de bolhas nos reagentes.

    1. Abra uma linha de 8 tubos de PCR. Se houver várias placas de amostras, abrir uma segunda linha de 8 tubos de PCR e rotular os tubos 1-8. Esta linha será para pooling padrões de várias placas.
    2. Em um tubo de 1,5 mL, misturar 360 ul de ADN de ligação de corante de qPCR Master Mix com 36 ul de amostra de ADN de ligação de corante de carga de reagente. Vortex brevemente e girar para 10 segundos a 2.000 x g. Divide-se esta mistura (396 ul) para a linha não marcada de 8 tubos de PCR, colocando 48 ul em cada tubo.
    3. Usando uma pipeta de 8 canais, distribuir 3,3 ul da mistura de reagentes de carregamento mestre / mistura de amostra em cada poçode uma nova placa de 96 poços de PCR. Rotular esta placa, "Sample Mixes".
    4. Para cada placa de PCR de amostras:
      1. Vortex a placa durante 10 segundos e girar para 10 segundos a 500 x g. Remover a tampa e transferir 2,7 uL de cada amostra de 1-célula positiva para o correspondente poço na placa de amostra para a Mistura 1-célula poços indicados no mapa da placa.
      2. Se houver apenas uma placa de amostras, transferir 2,7 uL de cada padrão amplificado a sua cavidade correspondente na amostra Mistura placa de acordo com o mapa da placa.
      3. Se houver várias placas de amostras, transferir 2,7 uL de cada padrão amplificado para a sua posição correspondente na linha rotulada de tubos PCR. Adicionar padrões da placa atual de amostras a todos os padrões já estão lá. Selar a placa de amostras quando feito usando um filme de vedação.
    5. Se houver várias placas de amostras:
      1. Vortex da fileira de tubos de PCR contendo normas para10 seg e girar para 10 segundos a 2.000 x g. Transferir 2,7 ul de cada tubo de padrões mistos para o correspondente poço na placa de amostra Mistura de acordo com o mapa da placa.
    6. Coloque os poços NTC com 2,7 mL de água livre de nuclease, onde indicadas no mapa da placa. Selar a Amostra Mistura placa e armazenar a 4 ° C até ser necessário.
    7. Retire o autocolante da parte inferior de um novo chip microfluídico qPCR. Usando uma seringa de fluido da linha de comando com a tampa ainda, empurre para baixo a cada primavera acumulador para soltá-lo, e injetar cada acumulador com 150-200 mL de fluido da linha de controle.
    8. Inserir o chip na máquina de carregamento e executar o script de "Prime". Isso leva ~ 20 min.
    9. Ao preparar o sistema é feito, de vórtice e girar as placas de misturas de ensaio (preparado no passo 1.6) e misturas de amostra.
    10. Usando uma pipeta de 8 canais, transferir 4,5 uL de cada mistura de ensaio para o lado esquerdo do chip qPCR de microfluidos de acordo com o esquema mencionado G> A Figura 6. Pipeta com muito cuidado para evitar a criação de bolhas de ar no fundo dos poços. Quando terminar, selar a placa de misturas de ensaio e armazenar a -20 ° C para uso futuro.
    11. Transferir 4,5 ul de cada mistura de amostra para o lado direito do chip qPCR de microfluidos de acordo com a Figura 6. Inserir o chip na máquina de carregamento e executar o script "Carregar Mix". Isto leva ~ 90 min.
    12. Ligue o real-time PCR máquina de microfluidos, inicie o software de coleta de dados, e acender a luz para aquecê-la. Isso leva ~ 20 min.
    13. Quando o script de carga Mix é feito, verifique se não existem linhas em todo o chip isso indicaria um problema de carregamento. Remova cuidadosamente as partículas de poeira a partir do chip usando fita adesiva Scotch ou fita laboratório. Insira o chip no real-time PCR máquina de microfluidos e executar o script de coleta de dados. Use o software de análise para inspecionar os resultados e exportar os dados para análise posterior.
    _title "> 10. Análise de Dados

    1. Retirar as medições para as quais as curvas de amplificação qPCR mostram uma fraca qualidade (isto é, para os quais as curvas não se assemelham a curva sigmoidal de amplificação padrão) 20.
    2. Retirar amostras com mais de 30 de baixa qualidade ou de zero ou medições para as quais a expressão do gene de arrumação (ver passo 1.1) é muito mais baixa do que a maioria das outras amostras (Figura 7).
    3. Para cada gene, estimar a localização de pico de fusão correcta como a mediana dos locais pico de fusão a partir de cada amostra. Se uma medição tem um pico de fusão localizada a mais de 1 ° C a partir da mediana, remova que a medição da consideração 20.
    4. Para cada gene, criar uma curva padrão para estimar a contagem de mRNA em cada amostra usando uma planilha ou linguagem de script 20.
      NOTA: As normas deste experimento consistem de 10, 100, 1.000, ou 10.000 moléculasde ADNcd correspondente a cada transcrito de interesse. Se a transcrição reversa foram perfeitamente eficaz, os padrões que corresponderia a 20, 200, 2000 e 20000 moléculas de mRNA, uma vez que o ARNm e ADNc são de cadeia simples. Na prática, isto não é o caso, por isso, expressa como uma estimativa medições em unidades de moléculas × e RT, onde RT E é a eficiência da transcrição reversa.
      1. Para cada poço padrão, identificar m, o número de moléculas de ADNcs (duas vezes o número de moléculas de dsDNA) antes da amplificação (por exemplo, 20 a 200 moléculas, moléculas, etc.).
      2. Para cada poço padrão, identificar o valor t C de qPCR 20.
      3. Com os valores para m e C t, executar uma regressão linear usando a seguinte equação para gerar uma curva padrão com os parâmetros a e b para cada gene, e encontrar o valor de R 2 como umIndicador de n da bondade de ajuste:
        equação 1
      4. A partir da curva padrão, calcular a eficiência da PCR para cada gene de E:
        equação 2
        NOTA: o valor de E muito superiores a 1,0 (por exemplo, E> 1,1) não é fisicamente realista; um valor de R 2 para a regressão linear muito menos do que 1.0 (por exemplo, R 2 <0,985) significa que os padrões não estão a funcionar de forma fiável. Estes problemas geralmente indicam que o padrão mais baixo amplicão desce abaixo de um limite de quantificação fiável, e, assim, o padrão mais baixo deve ser excluída da regressão linear. Se uma regressão linear adequada não pode ser feita usando pelo menos três padrões únicos, descartar as medições de expressão para o gene.
      5. Se a regressão linear é adequada, usar os parâmetros de ajuste resultante a e b </ em> para cada gene para estimar o número de moléculas de mRNA est m (em unidades de moléculas × e RT) para o gene correspondente em cada amostra de célula única do valor medido de C T:
        equação 3
      6. Designar qualquer medição m est <1 como m est = 0. Além disso, designar qualquer medida sem amplificação na qPCR e, portanto, nenhum valor t C como m est = 0.
        NOTA: Medições com um m est inferior ao menor ou maior do que o padrão mais elevado utilizado na regressão são encontrados, por extrapolação a partir da curva padrão. Estas estimativas não são necessariamente inválida, mas deve ser considerada com cautela.
    5. Visualize os dados de expressão de genes de uma única célula.
      1. Faça um gráfico beeswarm (Dorn, J. e Santo, T., 2012, http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange / 37105), no qual cada ponto representa a expressão génica em uma célula em particular; um exemplo é mostrado na Figura 8.
      2. Fazer um lote violino (Dorn, J., 2012, http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/23661) em que a largura do "violino" representa a frequência das medições de expressão de genes em torno de um determinado nível no população de células analisadas; um exemplo é mostrado na Figura 8.
        NOTA: análises mais sofisticadas podem sondar os relacionamentos na expressão entre os pares de genes 21, 22 e pode-se inferir redes de expressão gênica.

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    Representative Results

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    Uma visão geral do protocolo é demonstrado na Figura 1, incluindo os passos para o tratamento de células, o isolamento de células isoladas por FACS, a geração e a pré-amplificação de bibliotecas de ADNc a partir de lisados de célula única, a confirmação de bibliotecas de cDNA de uma única célula em poços classificadas, e a medição da expressão gênica por qPCR.

    Na preparação para o isolamento de uma única célula e análise de expressão de genes, é necessário primeiro identificar pares de primers oligonucleotídicos válidos para cada gene alvo de interesse. A Figura 2 mostra dois exemplos de métodos de controlo de qualidade de iniciadores. Derreter curvas são gerados seguinte qPCR com o par de primers sendo testados. Iniciadores válidos resultar em uma curva de fusão com um pico único (Figura 2A, a curva verde). Se vários picos (Figura 2A, a curva azul) ou uma curva com um ombro pronunciada (Figure 2A, a curva vermelha) estão presentes, isso indica a presença de múltiplos produtos de PCR e os iniciadores devem ser redesenhada. Como um segundo método de controlo de qualidade, electroforese em gel de agarose pode ser usado para verificar visualmente se uma única banda do tamanho correcto está presente para cada par de iniciadores testados (Figura 2B). Várias bandas ou bandas do tamanho errado indicam que os iniciadores não são válidos (Figura 2B).

    Após a validação do iniciador e a geração de bibliotecas de padrões de qPCR de correcção dos amplicões, separação de células pode ser realizada. Um esquema de classificação exemplo é indicada na Figura 3. Cada placa classificados deve incluir poços contendo uma série de diluições de padrões de amplicon, com 10, 100, 1000, ou 10.000 cópias de cada fragmento amplificado alvo. Recomenda-se também a incluir poços em que não há células, 10 células, ou células 100 são ordenadas, em adição aos poços de uma única célula.Devido à ineficiência triagem, é frequentemente necessário identificar as cavidades da placa, em que as células individuais foram depositados com sucesso. Para este passo de validação, seguindo o procedimento para a transcrição reversa e a amplificação do alvo específico, qPCR deve ser realizado para medir a expressão de um gene de manutenção (Figura 4). Os poços das normas de amplicon (Figura 4, as curvas de preto) deve mostrar curvas de amplificação, uniformemente espaçadas. Também deve haver uma separação clara nas curvas correspondentes aos poços "no-celulares" (Figura 4; curvas vermelhos), "10-cell" poços (Figura 4; curvas azul), e poços "100-célula" (Figura 4 ; curvas roxo). Uma separação nítida também deve ocorrer para os poços de células "1" correspondente a uma deposição de células bem sucedida (Figura 4; curvas de amplificação verdes, com valores de C T mais barato do que os dos controlos não-celulares, mas greater do que aqueles para os controlos de células 10) contra a deposição de células mal sucedida (Figura 4; curvas verdes, com valores de T C próximos daqueles para os controlos não-celulares). Depois de os poços com um único ligado celular ter sido identificado, o ADNc a partir dos poços (potencialmente a partir de várias placas) podem ser transferidos para um chip de microfluidos qPCR, com um lisado de uma única célula por poço. Por exemplo, a Figura 5 mostra uma matriz hipotética que combina de ADNc a partir de células individuais a partir de três diferentes escolhidas placas de 96 poços numa única nova placa para análise qPCR.

    Para analisar os resultados qPCR microfluídicos, as amostras que provavelmente não receberam uma célula deve primeiro ser removido, como indicado por diversas medições em falta ou gene de zero de expressão (Figura 7, linhas indicadas pelas setas) ou anormalmente baixa expressão do gene housekeeping. Para cada ensaio, quaisquer medidas com picos de fusão que não coincidem com os do other amostras no mesmo ensaio também devem ser removidos. Depois de retirar amostras e medições más, regressão linear pode ser realizada sobre as medições correspondentes aos padrões amplicon para estimar a contagem absoluta de cada transcrito de interesse em cada amostra de célula única. A Figura 8 mostra uma visualização de estas estimativas de expressão de genes, medidos em unidades de moléculas × eficiência da transcrição reversa, como beeswarm e violino parcelas. Neste exemplo, as células não tratadas apresentam uma ampla gama de níveis de expressão CDKN1A, com muitas células não expressando CDKN1A em tudo com os outros e que expressam o gene a níveis que abrangem duas ordens de grandeza. Após o tratamento com neocarzinostatina (NCS), durante 3 horas, a maioria das células expressam CDKN1A em níveis muito mais elevados, ea variabilidade diminui para cerca de uma única ordem de grandeza. À medida que a duração de tratamento aumenta, o nível médio de expressão CDKN1A diminui e a variabilidade na expressão se expande.

    figura 1
    Figura 1: Visão geral das etapas de uma única célula perfil de expressão gênica. As células tratadas são colhidas e classificadas através de FACS directamente em tampão de lise. espécies de ARNm de interesse são sujeitos a transcrição reversa e o cDNA resultante é amplificado por PCR. a expressão do gene arrumação em cada amostra é medido por qPCR para determinar quais as amostras que receberam efectivamente uma célula. Em amostras que passam este teste de controlo de qualidade, a expressão de genes de até 96 é medida utilizando microfluidos qPCR. Este valor foi modificado a partir de uma publicação anterior 11. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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    Figura 2: Exemplo Resultados de testes iniciador. (A) Derreta curvas de qPCR. A curva de fusão azul (TNFRSF10D) tem vários picos ea curva de fusão vermelha (TRIM22) tem um "ombro", o que equivale a um segundo pico perto do primeiro pico. Estes dados indicam que os iniciadores utilizados nestas reacções amplificar alvos múltiplos e precisam de ser redesenhada. A curva de fusão verde (SCN3B) tem um único pico, consistente com os iniciadores que amplificam um único alvo. (B) Amplified prazo DNA em gel de agarose. As pistas para SCN3B, TRIM22 e TRPM2 conter várias bandas; os primers usados ​​para fazer esses fragmentos amplificados de DNA amplificar alvos múltiplos e precisam ser redesenhados. A pista para TNFRSF10D tem uma única banda, consistente com os iniciadores que amplificam um único alvo. Vale a pena notar que os primers para SCN3B passar no teste de curva de fusão, mas falhar no teste em gel, enquanto aqueles para TNFRSF10D passar no teste gel mas não a curva de fusãoteste; estes dois métodos de validação primário são complementares. Neste exemplo, pode-se concluir que todos os quatro conjuntos de iniciadores têm de ser redesenhada. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

    Figura 3
    Figura 3: Mapa de placa de separação de células. Este mapa da placa inclui poços 1-célula (vermelho), 10- e poços 100 células (vermelho mais escuro), normas (verde), e poços não-celulares (branco). Incluindo duas repetições de cada série em cada placa ajuda a compensar a variação nos padrões. Incluindo poços 10 e 100 células de células é útil como uma verificação de sanidade para a expressão do gene. Os poços sem células servir como um controlo negativo. Por favor clique aqui para ver uma versão ampliada da tsua figura.

    Figura 4
    Figura 4: Exemplo de curvas de amplificação qPCR de controle de qualidade tipo de medição expressão GAPDH. amostras não-celulares (vermelho) mostram um nível de expressão de fundo. 1-célula amostras (verde) se dividem em dois grupos distintos, com uma expressão elevada e uma com baixa expressão semelhante para as amostras não-celulares. As amostras de alta expressão mais provável recebeu uma célula real, durante a classificação; as amostras de baixa expressão muito provavelmente não o fez. 10-célula (azul) e 100-célula (roxo) amostras mostram a expressão mais elevada do que as amostras 1 de células; as amostras de 10 células estão perto de uma das amostras de células que expressam mais alta devido à ineficiência tipo. Standards (preto) estão uniformemente distribuídas, conforme o esperado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. </ P>

    Figura 5
    Figura 5: Exemplo de Amostra Mistura mapa da placa. Este mapa da placa inclui amostras 1 de células de três placas diferentes (linhas AG), padrões mistos de todas as três placas (H1-H8), controles de não-celulares (H9-H10) e controles de não-modelo para qPCR (H11-H12 ). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

    Figura 6
    Figura 6: Diagrama de chip de qPCR de microfluidos com a ordem de carregamento (1, 2, 3 ...). O entalhe (A1) é o canto superior esquerdo da placa. Por favor clique aqui para ver uma versão maior do this figura.

    Figura 7
    Figura 7: Mapa de Calor dos resultados qPCR. Cada linha representa uma amostra de 1-célula, padrão, ou controlo; cada coluna representa um transcrito medido. Linhas com um número incomum de quadrados pretos ou Xs (setas) indicam provável amostras que não receberam uma célula real. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

    Figura 8
    Figura 8: Beeswarm e violino parcelas. Em uma trama beeswarm (pontos azuis), cada ponto representa a expressão do gene numa célula particular. Em um terreno de violino (forma cinza), a largura do "violino" representa a frequência da expressão gênica measuexigên- em torno de um nível particular na população de células analisadas. Luz barras azuis representam o padrão mais baixo. Medições acima das barras azuis são interpoladas entre as normas, enquanto as medições dentro das barras azuis são extrapolados. Os dados aqui apresentados são medições de expressão CDKN1A em células MCF-7 que expressam p53 Venus-marcado tratado com neocarzinostatina (NCS) para os tempos indicados, a fim de induzir o ADN quebras de cadeia dupla. Esta figura foi modificado a partir da publicação anterior 11. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

    Condição Temperatura Tempo
    Aguarde 50 ° C 15 min
    Aguarde 95 ° C 2 minutos
    20 ciclos 95 ° C 15 seg
    60 ° C 4 min
    Aguarde 4 ° C

    Tabela 1: A transcrição reversa e amplificação alvo específico (RTSTA) térmica programa de ciclos.

    Condição Temperatura Tempo
    Aguarde 37 ° C 30 minutos
    Aguarde 80 ° C 15 min
    Aguarde 4 ° C

    Tabela 2: exonuclease I tratamento (ExoI) térmica programa de ciclos.

    Componente Volume / poço (ul) 96 volumes w / 10% de sobrecarga (ul)
    2x mistura reaccional 5.00 528,00
    transcriptase reversa / mix polimerase 0.20 21.12
    10x Mix Primer STA 1.00 105.60
    2,64 U / uL (diluída) de RNAse inibidor 0,02 2,00
    água livre de nuclease 0,78 82,48
    Total 7.00 739,20

    Tabela 3: Componentes do tampão de lise para as células.

    Componente Volume / poço (ul) 96 volumes w / 10% de sobrecarga (ul)
    água livre de nuclease 2.52 266,00
    Exonuclease I Tampão de reacção (10x) 0,36 38,00
    Exonuclease I (20 U / ul) 0,72 76.00
    Total 3,60 380,00

    Tabela 4: Componentes do exonuclease misturar para tratar as amostras de ADNc amplificados.

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    Discussion

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    Nós apresentamos um método para o isolamento de células de mamíferos individuais a partir de uma população de células aderentes cultivadas em cultura e para ensaiar a expressão de genes de aproximadamente 96 em cada célula. Bom preparação prévia é crítico para este método funcione bem. Em particular, concepção e teste de iniciadores específicos para os pares de transcritos de interesse (passos 1,2-1,3) são demorados passos importantes, mas, como os iniciadores de determinar a qualidade das medições de uma única célula. Uma vez que os pares de iniciadores fiáveis ​​tenham sido obtidos, eles são utilizados para amplificar ADNc a partir dos transcritos de interesse; os produtos de amplificação são então combinados em conjunto em quantidades equimolares para fazer padrões (passo 1.4). Esta etapa é fundamental, pois são necessários os padrões para estimar a contagem de transcrição absolutos; normas devem ser feitas uma vez, dividido em alíquotas, e usado para todas as rodadas subseqüentes de separação de células e expressão gênica medições. Do mesmo modo, no dia em que as células são classificadas, é especialmente important para diluir os padrões, usando cuidadosamente dicas de baixa ligação pipetas e tubos de microcentrífuga ao fazer pratos de tampão de lise (passos 3.7 e 3.11). Visando o classificador de células (passo 4.2) é mais um passo crítico; este tem de ser feito muito cuidadosamente para que as células a atingir com sucesso o alvo de 9 ul de tampão de lise de uma placa de PCR.

    Há várias modificações ao protocolo que pode ser feito para se adaptar a uma variedade de necessidades de investigação. Aqui, nós nos concentramos em um DNA de ligação à base de corantes abordagem qPCR, que fornece um método relativamente acessível para quantificar a expressão do gene. No entanto, este método tem o potencial para criar um sinal de fundo elevado, uma vez que qualquer ADN amplificado, mesmo que as sequências de fora do alvo, resulta em um sinal fluorescente. Tal fundo pode ser minimizado garantindo que o par de iniciadores utilizados para amplificar um alvo específico originando uma curva de fusão com um pico único e um único produto de PCR do tamanho correcto (Figura 2). Se o fundo é ainda uma preocupação após o uso de tais métodos de controlo de qualidade, uma abordagem baseada qPCR-sonda pode ser utilizada para minimizar a detecção fora do alvo, embora a um maior custo de reagentes. Outra opção seria uma abordagem de PCR aninhada, em que um conjunto de iniciadores é usado no passo RTSTA para inverter-transcrição e amplificar uma grande região do transcrito e um segundo conjunto de iniciadores, que amplifica uma região mais pequena contida dentro dessa região grande , é utilizado para medir a expressão do gene por qPCR. Esta abordagem tem sido mostrado para melhorar a especificidade de ligação de ADN com base em corantes qPCR 23.

    Vários métodos estão disponíveis para o isolamento de células individuais para análise da expressão do gene. A escolha do método de isolamento de células depende de vários factores, incluindo a disponibilidade de equipamento (tal como um separador de células activado por fluorescência), a fonte das células a ser avaliado (tais como as linhas de células estabelecidas em comparação com as células primárias a partir de um tecido), oua velocidade com a qual as células têm de ser isolado. No exemplo apresentado neste protocolo, foram utilizados FACS de uma linha celular que expressa uma proteína fluorescente marcada com claramente detectável. FACS tem os benefícios de recursos de detecção de células raras e isolamento de células relativamente rápida. Um desafio do método é que a deposição das células de interesse para o pequeno volume requerido de tampão de lise de uma placa de PCR de 96 poços pode ser ineficiente e pode exigir a optimização da geometria de separação de células para garantir um isolamento bem sucedido. Abordagens alternativas que podem levar a uma maior precisão no isolamento de células a velocidades mais baixas e / ou maiores custos incluem a micropipetas de células individuais, a microdissecação de captura de laser de células específicas a partir de uma amostra de tumor, ou a utilização de sistemas de microfluido (por exemplo, o Fluidigm C1 sistema).

    Um dos principais benefícios do protocolo descrito aqui é que os controles internos, uma série de diluições de amplicons de PCR purificados, e NABLE a estimativa do número absoluto de cada transcrição em cada célula. Sem esses padrões, apenas os níveis relativos de expressão de genes pode ser obtida com base em cálculos derivados a partir dos valores de C T. No entanto, com estas normas, as contagens absolutas de transcrição pode ser estimada, de preferência através de interpolação dentro da gama de padrões amplicon quantificados precisamente (Figura 8). Como com qualquer método baseado em PCR de quantificação a expressão do gene, a quantificação absoluta precisa requer o conhecimento da eficiência de cada processo, incluindo a transcrição reversa.

    Um desafio actual para quantificar os níveis de transcritos nas células individuais que é o limite de detecção para muitos métodos é estimada em 10-100 mRNAs por célula 24, impedindo a quantificação fiável de uma percentagem significativa do transcriptoma. Como uma abordagem alternativa, pode-se utilizar smRNA peixe para quantificar alvos de particular interesseAss = "refex"> 25, 26, incluindo aqueles com muito poucos transcritos. Advances in smRNA PEIXES expandiram o número de transcritos diferentes que podem ser detectadas ao mesmo tempo 27 e o número de células que podem ser perfilados de uma só vez 28, dado o equipamento apropriado. Embora smRNA FISH tem suas próprias limitações (detecção de transcrição falso-positivos e falso-negativos, restrições a apenas alguns genes alvo por célula, o custo de equipamentos e reagentes), pode fornecer um método poderoso para complementar e validar os resultados de um análise baseada-qPCR de um subconjunto de genes alvo de interesse.

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    Acknowledgments

    Nós gostaríamos de agradecer a V. Kapoor na CCR ETIB Citometria de Fluxo do núcleo para sua ajuda na realização da separação de células durante o desenvolvimento deste protocolo. Agradecemos também a M. Raffeld ea Unidade de CCR LP Diagnóstico Molecular e J. Zhu eo NHLBI DNA Sequencing and Genomics núcleo por sua ajuda na realização do qPCR durante o desenvolvimento deste protocolo. Esta pesquisa foi apoiada pelo Programa Intramural do NIH.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    RNeasy Plus Mini Kit Qiagen 74134
    High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor ThermoFisher 4374966
    Phusion High-Fidelity DNA Polymerase New England BioLabs M0530S
    QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704
    Quant-iT High-Sensitivity dsDNA Assay Kit ThermoFisher Q33120 
    2.0 ml low adhesion microcentrifuge tubes USA Scientific 1420-2600
    DNA Suspension Buffer Teknova T0221
    Axygen 0.2 ml Maxymum Recovery Thin Wall PCR Tubes Corning PCR-02-L-C
    GE 96.96 Dynamic Array DNA Binding Dye Sample & Assay Loading Reagent Kit Fluidigm 100-3415
    HyClone RPMI 1640 media GE Healthcare Life Sciences SH30027.01
    Fetal Bovine Serum, Certified (US) ThermoFisher 16000-044
    Antibiotic-Antimycotic Solution Corning 30-004-CI
    Neocarzinostatin Sigma N9162
    ELIMINase Decon Labs 1101
    SUPERase-In ThermoFisher AM2696
    CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit ThermoFisher 11753500
    E. coli DNA Affymetrix 14380 10 MG
    ThermalSeal Sealing Film, Sterile Excel Scientific STR-THER-PLT
    BD FACSAria IIu BD Biosciences
    HyClone Trypsin 0.05% GE Healthcare Life Sciences SH30236.01
    PBS, 1x Corning 21-040-CV
    Falcon 40 µm Cell Strainer Corning 352340
    Exonuclease I New England BioLabs M0293S
    SsoFast EvaGreen Supermix with Low ROX Bio-Rad 172-5210
    96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression (microfluidic qPCR chip) Fluidigm BMK-M-96.96
    IFC Controller HX (loading machine) Fluidigm
    BioMark or BioMark HD (microfluidic qPCR machine) Fluidigm
    Real-Time PCR Analysis software  Fluidigm
    MATLAB software MathWorks

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    References

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    Unicelular perfil de expressão de genes utilizando FACS e qPCR com as Normas Internas
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    Porter, J. R., Telford, W. G., Batchelor, E. Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards. J. Vis. Exp. (120), e55219, doi:10.3791/55219 (2017).More

    Porter, J. R., Telford, W. G., Batchelor, E. Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards. J. Vis. Exp. (120), e55219, doi:10.3791/55219 (2017).

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