Summary
Condrogénesis de células madre requiere un ajuste fino de las condiciones de cultivo. A continuación, presentamos un enfoque magnético para la condensación de las células, un paso esencial para iniciar la condrogénesis. Además, mostramos que la maduración dinámica en un biorreactor se aplica estimulación mecánica a las construcciones celulares y mejora la producción de la matriz extracelular cartilaginosa.
Abstract
Ingeniería de cartílago sigue siendo un desafío debido a las dificultades en la creación de un implante funcional in vitro similar al tejido nativo. Un enfoque poco explorado para el desarrollo de reemplazos autólogas implica la diferenciación de células madre en condrocitos. Para iniciar este condrogénesis, un grado de compactación de las células madre se requiere; por lo tanto, hemos demostrado la viabilidad de las células magnéticamente de condensación, tanto dentro de los andamios de espesor y libre de andamio, utilizando fuentes de campo magnético miniaturizados como atractores de células. Este enfoque magnético también se utiliza para guiar fusión agregada y para construir libre de andamio, organizado, en tres dimensiones (3D) tejidos de varios milímetros de tamaño. Además de tener un tamaño mejorada, el tejido formado por la fusión magnético impulsado presentó un aumento significativo en la expresión de colágeno II, y se observó una tendencia similar para la expresión de agrecano. A medida que el cartílago nativo fue sometido a fuerzas tsombrero influenciado su estructura en 3D, también se llevó a cabo la maduración dinámica. Un biorreactor que proporciona estímulos mecánicos se utilizó para la cultura de los andamios magnéticamente sembradas durante un período de 21 días. maduración Bioreactor mejoró en gran medida la condrogénesis en los armazones cellularized; la matriz extracelular obtenido bajo estas condiciones era rico en colágeno II y agrecano. Este trabajo describe el potencial innovador de condensación magnética de las células madre etiquetados y maduración dinámica en un biorreactor para mejorar la diferenciación condrogénica, tanto andamios de polisacárido libre de andamio y dentro.
Introduction
Las nanopartículas magnéticas se utilizan ya en la clínica como agentes de contraste para formación de imágenes por resonancia magnética (MRI), y sus aplicaciones terapéuticas mantienen en expansión. Por ejemplo, recientemente se ha demostrado que las células marcadas pueden ser manipuladas in vivo utilizando un campo magnético externo y pueden ser dirigidas y / o mantenidas en un sitio definido de implantación 1, 2, 3. En la medicina regenerativa, que pueden ser utilizados para diseñar tejidos organizados in vitro 4, incluyendo el tejido vascular 5, 6, 7, 8 de hueso y cartílago 9.
El cartílago articular está inmerso en un entorno avascular, hacer reparaciones de los componentes de la matriz extracelular muy limitados cuando se producen daños. Por esta razón, research se centra actualmente en la ingeniería de sustitutos cartílago hialino que se pueden implantar en el sitio del defecto. Con el fin de producir un reemplazo autólogo, algunos grupos de investigación están explorando el uso de condrocitos autólogos como una fuente de células 10, 11, mientras que otros hacen hincapié en la capacidad de las células madre mesenquimales (MSC) para diferenciarse en condrocitos 12, 13. En estudios anteriores aquí se ha resumido, se seleccionaron MSC, ya que su toma de muestras de médula ósea es bastante sencillo y no requiere el sacrificio de los condrocitos sanos, que corren el riesgo de perder su fenotipo 14.
Un primer paso esencial para iniciar la diferenciación condrogénica de las células madre es su condensación. Los agregados celulares se forman comúnmente usando centrifugación o cultivo en micromasa 15; sin embargo, estos métodos de condensación neither presentar el potencial de crear grupos de células dentro de los andamios de espesor ni el potencial de controlar la fusión de agregados. En este trabajo se describe un enfoque innovador para condensar las células madre utilizando MSC marcaje magnético y la atracción magnética. Esta técnica se ha demostrado para formar constructos 3D libre de andamio a través de la fusión de los agregados entre sí para obtener un tejido cartilaginoso a escala milimétrica 9. siembra magnética de andamios gruesas y grandes también ha permitido la posibilidad de aumentar el tamaño de la ingeniería tisular, el diseño de una forma más fácilmente útil para la implantación, y diversificar el potencial para aplicaciones clínicas en la reparación del cartílago. Aquí, nos detalle el protocolo para la siembra magnético de MSC en andamios porosos compuestas de polisacáridos naturales, pululano y dextrano, andamios utilizado anteriormente para confinar las células madre 16, 17. diferenciación condrogénica era finally lleva a cabo en un biorreactor para asegurar continuos de los nutrientes y la difusión de gas en el núcleo de matriz de los andamios sembradas con una alta densidad de células. Además de proporcionar nutrientes, factores de crecimiento condrogénicas, y gas a las células, el biorreactor ofreció la estimulación mecánica. En general, la tecnología magnética se utiliza para confinar las células madre, combinado con la maduración dinámica en un biorreactor, puede mejorar notablemente la diferenciación condrogénica.
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Protocol
1. Construcción de los dispositivos magnéticos
NOTA: Los dispositivos utilizados para la siembra de células varían dependiendo de la aplicación (Figura 1). Para formar agregados, el número de células está limitado a 2,5 × 10 5 / agregado, por lo que las puntas magnéticas deben ser muy delgada (750 micras de diámetro). Para sembrar los andamios de 1,8 cm 2/7 mm de espesor, los imanes deben ser más grande (3 mm de diámetro) y se asegurará de la migración de células a través de los poros de la andamio.
- Construcción de un dispositivo con micro-imanes para la formación de agregados (Figura 1A)
- Hacer micro-orificios con una broca de 0,8 mm a través de placas de aluminio (3 cm de diámetro y 6 mm de espesor).
- Inserte una punta magnética (750 m de diámetro) en cada orificio de la placa.
- Coloca este disco en un imán de neodimio permanente, lo que asegura la magnetización a la saturación.
- Construcción de un dispositivo para la siembra andamio (
- Cortar poliestireno duro en 2,4 cm 2 casillas.
- Inserción 9 imanes pequeños (3 mm de diámetro, 6 mm de largo) a la misma distancia sobre un área superficial de 1,6 cm 2.
- Colocar este dispositivo a través de un imán de neodimio permanente.
Etiquetado Cell 2. Stem
NOTA: células madre fueron etiquetados con nanopartículas magnéticas 0,1 mM durante 30 min (2,6 ± 0,2 pg de hierro / célula) para formar agregados, mientras que se marcaron con nanopartículas magnéticas 0,2 mM durante 30 minutos (5 ± 0,4 pg de hierro / célula) a la semilla andamios. Estas concentraciones de nanopartículas y tiempos de incubación se han utilizado anteriormente y publicado para MSC y otras células 18, 19, y se ha determinado que las nanopartículas afectados ni la viabilidad celular ni capacidad de diferenciación MSC. La masa de hierro incorporada por las células madre se midió a través de un solo cell magnetoforesis 19, 20.
- Células de cultivo humanos madre mesenquimales (MSC) en medio de crecimiento de células madre mesenquimales completa (MSCGM) a 37 ° C y 5% de CO 2 hasta cerca de la confluencia (~ 90%).
- Preparar la solución de marcaje magnético mediante la mezcla de 0,1 o 0,2 mM maghemita óxido de hierro citrato recubierto (γFe 2 O 3; núcleo: 8 nm de diámetro) en medio 5A de McCoy exento de suero modificado en Roswell Park Memorial Institute (RPMI) sin glutamina y que contiene 5 citrato de sodio mM.
- Desechar el medio, lavar las células con medio RPMI libre de suero sin glutamina, y añadir 10 ml de disolución de nanopartículas de hierro óxido por 150 cm 2 frasco de cultivo, el volumen mínimo requerido para cubrir todas las células.
- Incubar durante 30 min a 37 ° C y CO 2 al 5% y luego desechar la solución de nanopartículas. Enjuague durante 5 min con medio RPMI libre de suero sin glutamina para internalizar el nanoparticles todavía unido a la membrana plasmática.
- Descartar el medio RPMI y añadir 25 ml de medio MSCGM completa por matraz. Incubar durante la noche a 37 ° C y 5% de CO2.
3. La siembra de células magnéticas
- Recién preparar el medio condrogénica usando medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) alto contenido de glucosa con L-glutamina mediante la adición de 50? M de ácido L-ascórbico 2-fosfato, 0,1 M de dexametasona, piruvato de sodio 1 mM, 0,35 mM de L-prolina, cultura universal 1% suplemento que contiene insulina, transferrina humana y ácido selenioso (ITS-Premix), y 10 ng / mL factor de crecimiento transformante beta 3 (TGF-β3).
- Desprender las células magnéticas utilizando 8 ml de 0,05% de tripsina-EDTA por 150 cm 2 matraz de cultivo y centrifugar las células disociadas a 260 x g durante 5 min. Aspirar el medio y contar las células resuspendidas.
- Coloque un plato Petri de cultivo celular con fondo de vidrio (35 mm) en la parte superior de ambos dispositivos magnéticos.
- para magnetically formar agregados, añadir 3 ml de medio de condrogénica a la placa de Petri y suavemente depositar el volumen más pequeño posible (no más de 8 l) que contiene 2,5 × 10 5 células marcadas por agregado (hasta 16 agregados puede ser depositado). Deja la placa de Petri durante 20-30 min sin moverlo, permitiendo que se forman esferoides, y luego colocar el dispositivo completo, incluyendo la placa de Petri que contiene los 16 agregados, en la incubadora a 37 ° C y 5% de CO2.
- agregados control de formulario siguiendo el mismo protocolo y reemplazar el medio completo con medio condrogénica sin TGF-β3.
- Para generar el constructo agregado 3D, coloque 2 agregados en contacto en el día 8 para formar 8 dobletes e iniciar la fusión. En el día 11, combinar 2 dobletes para formar 4 cuatrillizos. Por último, fusionar las 4 cuatrillizos en el día 15 para obtener la estructura final.
- Al mismo tiempo, formar agregados por centrifugación 2,5 × 10 5 células madre marcaron en los 26015; g durante 5 min en 15 mL tubos con 1,5 ml de medio de condrogénica con o sin TGF-β3 (para la muestra y el control, respectivamente).
- Para magnéticamente andamios de semillas, colocar cada andamio se secó en una placa de Petri. Utilice polisacáridos andamios porosos hechos de pululano / dextrano 21. Para cada andamio, diluir 2 × 10 6 células madre marcadas en 350 l de medio de condrogénica sin TGF-β3 y cuidadosamente pipetear las células sobre el andamio.
- Incubar durante 5 min a 37 ° C para permitir la penetración de células completo dentro del andamio y luego agregar suavemente 3 ml de medio de condrogénica con o sin TGF-β3 (para la muestra o control, respectivamente) para la placa de Petri.
- Incubar el andamio cellularized en su dispositivo magnético a 37 ° C y 5% de CO2 durante 4 días para permitir la migración celular a través de los poros de andamio y confinamiento.
- Al mismo tiempo, la semilla de andamios con 2 × 10 6
4. La diferenciación en condrocitos
NOTA: Después de 4 días de incubación, retirar los imanes y continuar la maduración condrogénica ya sea en una placa de Petri (condiciones estáticas) o en un biorreactor (condiciones dinámicas). muestras de control negativas se maduraron en condiciones estáticas con medio condrogénica sin TGF-β3.
- En condiciones estáticas, mantener a los andamios cellularized o agregados en la misma placa de Petri. Cambiar el medio condrogénica dos veces por semana durante 21 días.
- En condiciones dinámicas, preparar el biorreactor.
- Cortar tubo de silicona a la longitud apropiada de acuerdo con el protocolo del fabricante.
- Autoclave todos los materiales: 500-ml cámara de cultivo, la tubería, de 2 vías volteadoras, y jaulas.
- Colocar las piezas de biorreactor en un microbio estérilestación de seguridad lógica. Conecte el tubo a las 2 vías rotadores y de la cámara de cultivo siguiendo las instrucciones del fabricante.
- transferir con cuidado los andamios cellularized en jaulas esterilizadas utilizando una espátula estéril. Coloque 2 andamios por jaula. Cuando las jaulas están listos, insertarlos en las agujas de la tapa para evitar que se muevan durante la rotación adicional. Llenar la cámara de cultivo con medio condrogénica y cerrarla con la tapa que contiene las jaulas.
- A su vez en la bomba peristáltica para llenar el tubo con medio condrogénico y para eliminar las burbujas de aire.
- Coloque y asegure la cámara llena en el motor del biorreactor y encienda el ordenador, que controla las rotaciones tanto del brazo y de la cámara.
- Aplicar una velocidad de rotación de 5 revoluciones por min (rpm) en el brazo y la cámara. Ajuste de la bomba peristáltica a un caudal de 10 rpm para la alimentación continua de los andamios cellularized.
NOTA: Antes de la extracción de ARN, a digerir los andamios con una solución enzimática.
- Preparar 1 ml de solución enzimática mediante la adición de 100 l de pululanasa (40 U / ml) y 50 l de dextranasa (60 mg / ml) a 850 ml de medio DMEM libre de suero.
- Enjuague los andamios dos veces con medio DMEM libre de suero, desechar el medio, y añadir 800 l de la solución enzimática por andamio. Incubar durante 15-30 min a 37 ° C bajo agitación suave.
- Cuando el andamio está completamente disuelto, la transferencia de la solución que contiene las células a un tubo de 1,5 ml, centrifugar a 300 xg durante 10 min, aspirar cuidadosamente el medio, lavar dos veces con solución salina estéril 1 × tamponada con fosfato (PBS), centrifugar a 300 × g durante 10 min, y volver a suspender las células en la solución de aislamiento de ARN.
- Para extraer el ARN a partir de los agregados, coloque los esferoides en la solución de aislamiento de ARN yaplastarlos completamente utilizando un homogeneizador antes de realizar la extracción de RNA.
- Aislar el RNA utilizando un kit para la extracción de ARN total de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Sintetizar ADN complementaria a partir de 400 ng de ARN total usando la transcriptasa inversa de acuerdo con las instrucciones del fabricante, utilizando 250-ng cebadores aleatorios, 1 l de mezcla de dNTP (10 mM cada uno), y 40 U / ml de RNasa inhibidor; el volumen final de reacción es de 20 l. Al final de la reacción, añadir 80 l de agua destilada para obtener un volumen final de 100! L.
- Para la reacción en cadena de polimerasa cuantitativa (PCR), utilizar una mezcla de PCR que contiene un reactivo fluorescente para cuantificar la expresión relativa de los genes de interés, tales como agrecano (AGC) y el colágeno II (Col II), con 10 × cDNA diluido. Normalizar los niveles de expresión génica con la proteína ribosómica gen de referencia, Grande, P0 (RPLP0). Realizar los cálculos con el 2 - fórmula ΔΔCT, Donde ΔΔCT =? Ct de la condición diferenciada - significa? Ct de condición de control, y cada uno? Ct representa el CT del gen de interés - la CT del gen de referencia (RPLP0).
- Determinar mediciones estadísticas como los valores medios ± el error estándar de la media (SEM). Efectuar el análisis con n ≥ 2 experimentos independientes. Utilice la prueba t de Student para analizar las diferencias estadísticas entre los gránulos centrifugó y fusiones magnéticos (* p <0,05). Determinar la significación con una prueba de Kruskal-Wallis (ANOVA de una vía no paramétrico) para analizar las diferencias estadísticas entre los andamios diferenciados y con el andamio de control (* p <0,05).
6. Análisis histológico
- Enjuague los andamios cellularized o agregados con estéril 1 × PBS, fijarlos en solución de formalina al 10% durante 1 h a temperatura ambiente, y enjuague con 1 × PBS.
- Retire el PBS, incrustar las muestras en cuttin óptimag compuesto temperatura (OCT), y congelarlos en un baño de isopentano sumergido en nitrógeno líquido. Almacenar la muestra a -20 ° C. Cortar las muestras con un criostato para obtener criosecciones de 8 micras para los agregados o 12-m para los andamios cellularized.
- Tinción de las secciones criogénicas con solución de azul de toluidina al 0,5% durante 2 minutos, enjuague con agua del grifo, deshidratar con etanol al 100%, aclarar con tolueno, y montar los portaobjetos con un medio de montaje para microscopía de luz.
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Representative Results
En primer lugar, los agregados se pueden formar individualmente utilizando micro-imanes depositando 2,5 × 10 5 células madre marcadas (Figura 2A). Estos agregados individuales (~ 0,8 mm de tamaño) pueden entonces ser fusionados en estructuras más grandes gracias a la fusión secuencial, inducida magnéticamente. Por ejemplo, en el día 8 de la maduración condrogénica, los agregados se colocaron en contacto en pares para formar dobletes; cuadrúpedos se ensamblaron en el día 11 mediante la fusión de 2 dobletes; y finalmente, el día 15, los 4 quadruplets se fusionaron para formar una construcción 3D que contiene 16 de los agregados formados inicialmente, con un total de 4 × 10 6 células (~ 4 mm de tamaño) (Figura 2B). En segundo lugar, la misma técnica de atracción magnética se ha utilizado para formar agregados de células dentro de andamios. Los andamios se sembraron sobre el dispositivo magnético y mostró células densamente condensadas dentro de los poros del andamio, en las localizaciones exactas micro-imán (Figura 2C). Por el contrario, cuando se sembraron las células dentro de un andamio sin atracción magnética (siembra pasivo), que se encontraron para ser distribuida de manera uniforme. Andamios Cellularized se insertaron entonces en jaulas (Figura 3A) unido a la cámara de biorreactor para realizar el proceso condrogénica en condiciones de maduración dinámicos (Figura 3B). un biorreactor Tal mejora el intercambio de nutrientes y gas y proporciona la estimulación mecánica por transducción. La velocidad de rotación de ambos el brazo y la cámara se ajustó a 5 rpm, según lo recomendado por el constructor para la regeneración de tejido 3D suave. Una bomba peristáltica que proporciona un suministro continuo de medio se fijó en 10 rpm.
Para todas las condiciones de la organización de células (agregados fusionados y siembra dentro de andamios) y la maduración del tejido (dentro o fuera de un biorreactor), la expresión génica se analizó en el día 25. El tejido formado por la fusión magnética mostró una signiaumento sig- en la expresión de colágeno II en comparación con el sedimento obtenido por centrifugación (Figura 4A), junto con un aumento de la tendencia de la expresión de aggrecan. Para andamios cellularized, obtuvimos un aumento en aggrecan y colágeno II-II, cuando se utilizó la expresión significativa para el colágeno siembra magnética, en comparación con los andamios sembraron sin fuerzas magnéticas. Además, la expresión de ambos genes fue mucho mayor (significativo para Col II) cuando la siembra magnético se combinó con la diferenciación dinámico (Figura 4B).
También se realizaron análisis histológicos, por ejemplo usando una tinción con azul de toluidina para revelar los glicosaminoglicanos (GAG). La fusión magnética secuencial de 16 agregados exhibió abundante deposición de GAG, como se evidencia por el color azul-púrpura (Figura 5A). Para los andamios, sólo aquellos magnéticamente sembradas se tiñeron con azul de toluidina. conten GAGt fue mayor cuando los andamios se diferenciaron en un biorreactor (Figura 5B) en lugar de forma estática (Figura 5C). Tomados en conjunto, estos resultados demuestran el potencial de agregación magnética y la siembra magnético dentro de andamios para mejorar la condrogénesis. También indica que las condiciones de maduración dinámicos dentro del biorreactor son mucho más favorables para la diferenciación eficiente.
Figura 1. Construcción de los dispositivos magnéticos. (A) Ejemplo de un dispositivo magnético para la formación de agregados: la placa de aluminio fue perforado (0,8 agujeros mu m de diámetro) y consejos se insertaron en cada agujero y luego se coloca en un imán de neodimio permanente, que aseguró magnetización a la saturación. (B) Dispositivo magnético para sembrar el andamio: poliestireno duro (24 mm 2) con 9 orificios realizados manualmente fuecolocado en un imán de neodimio permanente, que aseguró magnetización a la saturación. Los pequeños imanes (3 mm de diámetro) se insertaron entonces en cada agujero para formar el dispositivo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. marcaje magnético de células madre y la siembra. (A) Las células madre se marcaron con nanopartículas de óxido de hierro durante 30 min a 37 ° C. (B) esferoides se forman a partir de células marcadas atraídos por una red de 16 micro-imanes. Los agregados se fusionaron en quadruplets en el día 11 por la fusión de los dobletes formadas 3 días antes. Los cuatrillizos se fusionaron después en el día 15 para construir la ingeniería tisular final. (C) Un andamio, se colocaron en un plato con fondo de vidrio, se sembró con o confuerzas magnéticas hacia fuera. En el día 4, se observaron manchas de células madre compactados en el andamio magnéticamente sin semillas, mientras que las células aparecían uniformemente distribuidos en el andamio sembrado sin un imán. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Dinámica de maduración de los andamios cellularized. (A) Después de la siembra magnético o pasivo, andamios cellularized se pusieron en jaulas para evitar la interrupción. Jaulas (B), fijos utilizando las agujas de la tapa, se colocaron en el recipiente del biorreactor llena con medio condrogénica. El biorreactor aplica rotación biaxial con una velocidad controlada de forma independiente (1-12 rpm y 1-35 rpm para el brazo y la cámara, respectivamente). Una bomba peristáltica proporcionado continuamente medium. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Expresión de genes específicos en condrogénicas día 25. (A) La fusión inducida magnéticamente de esferoides MSC mostró un aumento significativo en el colágeno II en comparación con el sedimento formado por centrifugación. * Indica una diferencia estadística mediante la prueba t de Student (p-valor <0,05). (B) La expresión de aggrecan y colágeno II fueron claramente aumentó en andamios diferenciadas con una combinación de siembra magnético y la maduración dinámico en un biorreactor. La expresión génica se normalizó a RPLP0 mRNA y se expresa en unidades arbitrarias en relación al control (~ 1 ± SEM). Los resultados se presentan como medias ± SEM de dos a cuatro experimentos independientes. * denoTes una diferencia estadística con la prueba de Kruskal-Wallis (ANOVA de una vía prueba no paramétrica) (valor de p <0.05). (-): siembra sin imán; (+): Siembra con fuerzas magnéticas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. histológico tinción de glicosaminoglicanos en el día 25. glicosaminoglicano (GAG) los depósitos se ponen de manifiesto por la coloración azul-púrpura. (A) Se observó una tinción de azul de toluidina positiva en las criosecciones 8-M de la estructura cartilaginosa final obtenido de la fusión secuencial de 16 agregados. Las criosecciones de 12 M de andamios magnéticamente sembradas después estático (B) o condiciones dinámicas (C) claramente mostraronque el contenido de GAG fue mayor en los andamios diferenciados en un biorreactor. Las flechas indican los agregados de células diferenciadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En primer lugar, porque las técnicas que aquí se presentan se basan en la internalización de nanopartículas magnéticas, una cuestión importante es el resultado de las nanopartículas una vez que se localizan dentro de las células. Es cierto que las nanopartículas de hierro pueden desencadenar toxicidad potencial o alteración de la capacidad de diferenciación en función de su tamaño, de revestimiento, y tiempo de exposición 19, 22. Sin embargo, varios estudios han demostrado ningún impacto en la fisiología celular cuando se utilizaron nanopartículas de hierro encapsuladas 23 en forma de magnetoferritina, una nanopartícula magnética biológica 24, o se utilizaron con un simple revestimiento de citrato y concentraciones adecuadas 18. Además, cuando se utilizaron nanopartículas de óxido de hierro en condiciones similares a las descritas en este documento (con MSC y para la condrogénesis), recientemente hemos demostrado que una degradación rápida y casi total de la nanopartiCiclos se produce dentro de los endosomas en unos 10 días después de la incorporación celular y la formación de esferoides MSC. Curiosamente, esta degradación masiva se asoció con el almacenamiento eficiente del hierro libre dentro de la proteína ferritina y resultó en un impacto muy limitado sobre el metabolismo celular de hierro, un buen presagio para futuras aplicaciones clínicas 25.
Otro punto crítico es el requisito de compactación celular para iniciar la condrogénesis. Por lo general, la condensación de las células se logra mediante centrifugación; sin embargo, este método está limitado por un bajo número de células (no más de 2,5 × 10 5 células). Pasado este número, los nutrientes y gas no pueden difundirse al centro de los agregados, lo que provocó necrosis celular. Aquí, la condensación magnética de las células madre marcadas en agregados aparece como un método importante para formar 3D construye para la regeneración de tejido cartilaginoso. Tal procedimiento magnético ha sido utilizado por otros autores aconstruir esferoides 3D: por levitación magnética con un imán colocado en la parte superior de la placa después de la disociación de las células 23 o con espigas de hierro para localizar el campo magnético 26. Sin embargo, no parece ser adecuado para otras etapas de fusión agregada levitación magnética. Por el contrario, con el método magnético propone aquí, podemos controlar todos los pasos de fusión para obtener una construcción de tejido de cartílago paso-a-paso. En resumen, este proceso de múltiples pasos comienza con el confinamiento de las células madre en bloques de construcción de agregado y es seguido por la fusión de estos bloques en una estructura más grande. Los pasos críticos de este vástago procedimiento de agregación celular libre de andamio son los siguientes: primero, uno debe formar cada agregado con un volumen tan pequeño de células como sea posible y segunda, hay que controlar los pasos de fusión para evitar la formación de una única, gran agregar. El tejido obtenido aquí era rico en colágeno II y agrecano. También presentó el advantages de tener geometría y el tamaño flexible y de ser libre de andamio.
El enfoque magnético también se utiliza para guiar las células madre dentro de andamios gruesas y grandes; otra alternativa para el diseño de diversas formas y tamaños. El paso crítico aquí es sembrar los andamios con un volumen apropiado de células: ni demasiado poco para tener una distribución homogénea total de las células, ni demasiado para evitar cualquier pérdida de células. Las fuerzas magnéticas fueron utilizados previamente para atraer y retener a las células dentro de los andamios y para mejorar la siembra de células 27, 28. Aquí, suficiente condensación de células dentro de los poros de los armazones de polisacáridos llevó a condrogénesis éxito. La producción de la matriz extracelular se mejoró notablemente cuando los andamios magnéticamente cellularized fueron sometidos a los estímulos de estrés / cizallamiento de transducción proporcionadas por el biorreactor gracias a su rotación bi-axial. Se ha demostrado en otros estudios que Mulcondiciones de carga ti-axiales mejoraron la calidad de los tejidos formados a partir de condrocitos 29. Este concepto novedoso biorreactor presenta una ganancia real en comparación con las técnicas existentes, donde se aplican sólo fuerzas de compresión 30, 31, 32.
En conclusión, para la diferenciación condrogénica, el uso de confinamiento magnético de células madre marcado para formar y manipular los agregados, así como a las semillas andamios permitidos para la creación de construcciones celulares milímetros de tamaño de cartílago. Además, la combinación de la siembra de células magnético con diferenciación dinámica proporciona una nueva herramienta valiosa para aplicaciones de la medicina regenerativa.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores desean reconocer QuinXell Tecnologías y CellD, particularmente Lothar Grannemann y Dominique Ghozlan por su ayuda en el biorreactor. Agradecemos a Catherine Le Visage, que nos proporcionó con los andamios de pululano / polisacárido dextrano. Este trabajo fue apoyado por la Unión Europea (proyecto de ERC-2014-cog Matisse 648 779) y por el AgenceNationalede la Investigación (ANR), Francia (proyecto MagStem ANR-11 SVSE5).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Iron oxide (maghemite) nanoparticules (γ-Fe2O3) | PHENIX - University Paris 6 | Made and given by C. Ménager | Mean diameter of 8.1 nm and negative surface charge |
| Polysaccharide Pullulan/Dextran scaffolds | LIOAD - University Nantes | Made and given by C. Le Visage | Prepared from a 75:25 mixture of pullulan/dextran in alkaline conditions (10 M NaOH). Porosity: 185-205 µm; Thickness: 7 mm; Surface area: 1.8 cm2. |
| TisXell Regeneration System | QuinXell Technologies | QX900-002 | Biaxial bioreactor with 500 mL culture chamber |
| Cage for scaffolds: Histosette II M492 | VWR | 720-0909 | |
| Mesenchymal Stem Cell (MSC) | Lonza | PT-2501 | Three independant batches have been used |
| MSCGM BulletKit medium | Lonza | PT-3001 | For the complete medium, add the provided BulletKit (containing serum, glutamine and antibiotics) to the MSCGM medium |
| DMEM with Glutamax I | Life Technologies | 31966-021 | No sodium pyruvate, no HEPES |
| RPMI medium 1640, no Glutamine | Life Technologies | 31870-025 | No sodium pyruvate, no HEPES |
| PBS w/o CaCl2 w/o MgCl2 | Life Technologies | 14190-094 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 25300-054 | |
| Penicillin (10,000 U/mL) / Streptomycin (10,000 µg/mL) | Life Technologies | 15140-122 | |
| ITS Premix Universal Culture Supplement (20x) | Corning | 354352 | |
| Sodium pyruvate solution 100 mM | Sigma | S8636 | |
| L-Ascorbic Acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | Prepare the concentrated solution (25 mM) in distilled water extemporaneously |
| L-Proline | Sigma | P5607 | Prepare the 175 mM stock solution diluted in distilled water and store at 4 °C |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | Prepare the 1 mM stock solution diluted in Ethanol 100% and store at -20 °C |
| TGF-beta 3 protein 10 µg | Interchim | 30R-AT028 | |
| Tri-sodium citrate | VWR | 33615.268 | Prepare the 1 M stock solution diluted in distilled water and store at 4 °C |
| Pullulanase from Bacillus acidopullulyticus | Sigma | P2986 | |
| Dextranase from Chaetomium erraticum | Sigma | D0443 | |
| NucleoSpin RNA Extraction Kit | Macherey-Nagel | 740955.5 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Life Technologies | 18064-014 | |
| Random Primer - Hexamer | Promega | C1181 | 500 µg/mL: Use diluted 1/2 and put 1 µL per sample |
| Recombinant RNAs in ribonuclease inhibitor | Promega | N2511 | 40 U/µL: put 1 µL per sample |
| PCR nucleotide dNTP mix (10 mM each) | Roche | 10842321 | |
| SyBr Green PCR Master Mix | Life Technologies | 4368708 | |
| Step One Plus Real-Time PCR System | Life Technologies | 4381792 | |
| Formalin solution 10% neutral buffered | Sigma | HT5012 | |
| OCT solution | VWR | 361603E | |
| Isopentane | Sigma | M32631 | |
| Toluidine blue O | VWR | 1.15930.0025 | |
| Ethanol absolute | VWR | 20821.310 | |
| Toluene | VWR | 1.08323.1000 | |
| Mounting medium Pertex | Histolab | 840 | |
| RPLP0 Primer for qPCR | Eurogentec | 5'-TGCATCAGTAC CCCATTCTATCAT-3'; 5'-AAGGTGTAATC CGTCTCCACAGA-3' |
|
| Aggrecan Primer for qPCR | Eurogentec | 5'-TCTACCGCTGCGAGGTGAT-3'; 3'-TGTAATGGAACACGATGCCTTT-5' | |
| Collagen II Primer for qPCR | Eurogentec | 5'-ACTGGATTGACCCCAACCAA-3'; 3'-TCCATGTTGCAGAAAACCTTCA-5' |
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