3D Stem magnetica cellulare Aggregazione e bioreattore maturazione per la cartilagine Regeneration
Summary
Condrogenesi da cellule staminali richiede la messa a punto delle condizioni di coltura. Qui vi presentiamo un approccio magnetico per condensare le cellule, un passo essenziale per iniziare condrogenesi. Inoltre, mostriamo che la maturazione dinamico in un bioreattore applica stimolazione meccanica ai costrutti cellulari e aumenta la produzione di matrice extracellulare cartilaginea.
Abstract
Ingegneria cartilagine rimane una sfida a causa delle difficoltà nel creare un impianto funzionale in vitro simile al tessuto nativo. Un approccio recentemente esplorato per lo sviluppo delle sostituzioni autologhe comporta la differenziazione delle cellule staminali in condrociti. Per avviare questo condrogenesi, un grado di compattazione delle cellule staminali è richiesta; quindi, abbiamo dimostrato la fattibilità di cellule magneticamente condensazione, sia all'interno scaffold spessi e privo di scaffold, utilizzando miniaturizzati sorgenti di campo magnetico come attrattori cellulari. Questo approccio magnetico è stato utilizzato anche per guidare fusione aggregato e costruire privo di impalcatura, organizzato, tridimensionale (3D) i tessuti diversi millimetri di dimensione. Oltre ad avere una dimensione maggiore, il tessuto formato da fusione magnetica guidato presentato un significativo aumento dell'espressione di collagene II, ed una tendenza simile è stato osservato per l'espressione aggrecan. Come la cartilagine nativa è stato sottoposto a forze tcappello influenzato la sua struttura 3D, la maturazione dinamica è stata effettuata anche. Un bioreattore che fornisce stimoli meccanici stato usato per cultura scaffold magneticamente seminate su un periodo di 21 giorni. Bioreattore maturazione in gran parte migliorato chondrogenesis nelle impalcature cellularized; la matrice extracellulare ottenuto in queste condizioni era ricca di collagene II e aggrecano. Questo lavoro illustra il potenziale innovativo di condensazione magnetica delle cellule staminali etichettati e maturazione dinamica in un bioreattore per una migliore differenziazione condrogenica, sia-impalcatura libero e all'interno polisaccaridi ponteggi.
Introduction
nanoparticelle magnetiche sono già utilizzati in clinica, come agenti di contrasto per la risonanza magnetica (MRI), e le loro applicazioni terapeutiche tenere in espansione. Ad esempio, è stato recentemente dimostrato che le cellule marcate possono essere manipolati in vivo usando un campo magnetico esterno e possono essere orientati e / o mantenuti in un sito definito di impianto 1, 2, 3. In medicina rigenerativa, possono essere utilizzati per ingegnerizzare tessuti organizzati in vitro 4, tra tessuto vascolare 5, 6, 7, 8 osso, cartilagine e 9.
La cartilagine articolare è immersa in un ambiente avascolare, le riparazioni dei componenti della matrice extracellulare molto limitati quando si verificano danni. Per questo motivo, research è attualmente focalizzata sulla progettazione di sostituzioni cartilagine ialina che possono essere impiantati nel sito del difetto. Per produrre una sostituzione autologo, alcuni gruppi di ricerca stanno studiando l'utilizzo di condrociti autologhi come fonte cella 10, 11, mentre altri sottolineano la capacità delle cellule staminali mesenchimali (MSC) a differenziarsi in condrociti 12, 13. In studi precedenti ricapitolato qui, abbiamo scelto MSC, come il loro campionamento del midollo osseo è abbastanza semplice e non richiede il sacrificio di condrociti sani, che rischiano di perdere il loro fenotipo 14.
Un primo passo essenziale per iniziare la differenziazione condrogenica delle cellule staminali è il loro condensazione. Aggregati cellulari sono comunemente formate utilizzando centrifugazione o cultura Micromass 15; Tuttavia, questi metodi di condensazione Neither presentare il potenziale per creare raggruppamenti cellulari all'interno scaffold spessa né la possibilità di controllare la fusione degli aggregati. In questo documento, si descrive un approccio innovativo alla condensazione cellule staminali utilizzando marcatura magnetica MSC e l'attrazione magnetica. Questa tecnica è stata dimostrata per formare costrutti 3D-free scaffold attraverso la fusione di aggregati tra loro per ottenere un millimetro scala tessuto cartilagineo 9. semina magnetico di scaffold spessi e grandi ha anche permesso la possibilità di aumentare la dimensione della ingegneria tessutale, realizzazione di una forma più facilmente utile per l'impianto, e diversificare il potenziale per applicazioni cliniche di riparazione della cartilagine. Qui, si dettaglio il protocollo per la semina magnetico di MSC nella scaffold porosi costituiti da polisaccaridi naturali, pullulano, e destrano, scaffold precedentemente utilizzato per confinare cellule staminali 16, 17. differenziazione condrogenico era finally eseguita in un bioreattore per garantire continue dei nutrienti e diffusione del gas nel nucleo matrice degli scaffold seminati con un'alta densità di cellule. Oltre a fornire le sostanze nutrienti, fattori di crescita condrogeniche e gas alle cellule, il bioreattore offerto stimolazione meccanica. Nel complesso, la tecnologia magnetica utilizzata per confinare le cellule staminali, in combinazione con la maturazione dinamica in un bioreattore, può notevolmente migliorare la differenziazione condrogenico.
Protocol
Representative Results
Discussion
In primo luogo, perché le tecniche qui presentate si basano su l'internalizzazione delle nanoparticelle magnetiche, una questione importante è il risultato delle nanoparticelle, una volta che localizzano all'interno delle cellule. È vero che le nanoparticelle di ferro possono scatenare tossicità potenziale o capacità di differenziazione ridotta seconda delle loro dimensioni, rivestimento, e il tempo di esposizione 19, 22. Tuttavia, numerosi studi ha…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori vorrebbero riconoscere QuinXell Technologies e CellD, in particolare Lothar Grannemann e Dominique Ghozlan per il loro aiuto con il bioreattore. Ringraziamo Catherine Le Visage, che ci ha fornito i pullulano / ponteggi polisaccaride destrano. Questo lavoro è stato sostenuto dall'Unione Europea (progetto ERC-2014-Cog Matisse 648.779) e dalla AgenceNationalede la Recherche (ANR), la Francia (progetto MagStem ANR-11 SVSE5).
Materials
| Iron oxide (maghemite) nanoparticules ( γ-Fe2O3) | PHENIX – University Paris 6 | Made and given by C. Ménager | Mean diameter of 8.1 nm and negative surface charge |
| Polysaccharide Pullulan/Dextran scaffolds | LIOAD – University Nantes | Made and given by C. Le Visage | Prepared from a 75:25 mixture of pullulan/dextran in alkaline conditions (10M NaOH). Porosity: 185-205µm; Thickness: 7mm; Surface area: 1.8cm2. |
| TisXell Regeneration System | QuinXell Technologies | QX900-002 | Biaxial bioreactor with 500 mL culture chamber |
| Cage for scaffolds: Histosette II M492 | VWR | 720-0909 | |
| Mesenchymal Stem Cell (MSC) | Lonza | PT-2501 | Three independant batches have been used |
| MSCGM BulletKit medium | Lonza | PT-3001 | For the complete medium, add the provided BulletKit (containing serum, glutamine and antibiotics) to the MSCGM medium |
| DMEM with Glutamax I | Life Technologies | 31966-021 | No sodium pyruvate, no HEPES |
| RPMI medium 1640, no Glutamine | Life Technologies | 31870-025 | No sodium pyruvate, no HEPES |
| PBS w/o CaCl2 w/o MgCl2 | Life Technologies | 14190-094 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 25300-054 | |
| Penicillin (10.000U/mL)/Streptomicin (10.000µg/mL) | Life Technologies | 15140-122 | |
| ITS Premix Universal Culture Supplement (20x) | Corning | 354352 | |
| Sodium pyruvate solution 100mM | Sigma | S8636 | |
| L-Ascorbic Acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | Prepare the concentrated solution (25 mM) in distilled water extemporaneously |
| L-Proline | Sigma | P5607 | Prepare the 175 mM stock solution diluted in distilled water and store at 4°C |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | Prepare the 1 mM stock solution diluted in Ethanol 100% and store at -20°C |
| TGF-beta 3 protein 10µg | Interchim | 30R-AT028 | |
| Tri-sodium citrate | VWR | 33615.268 | Prepare the 1M stock solution diluted in distilled water and store at 4°C |
| Pullulanase from Bacillus acidopullulyticus | Sigma | P2986 | |
| Dextranase from Chaetomium erraticum | Sigma | D0443 | |
| NucleoSpin RNA Extraction Kit | Macherey-Nagel | 740955.5 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Life Technologies | 18064-014 | |
| Random Primer – Hexamer | Promega | C1181 | 500 µg/mL: Use diluted 1/2 and put 1 µL per sample |
| Recombinant RNAsin ribonuclease inhibitor | Promega | N2511 | 40 U/µL: put 1 µL per sample |
| PCR nucleotide dNTP mix (10mM each) | Roche | 10842321 | |
| SyBr Green PCR Master Mix | Life Technologies | 4368708 | |
| Step One Plus Real-Time PCR System | Life Technologies | 4381792 | |
| Formalin solution 10% neutral buffered | Sigma | HT5012 | |
| OCT solution | VWR | 361603E | |
| Isopentane | Sigma | M32631 | |
| Toluidine blue O | VWR | 1.15930.0025 | |
| Ethanol absolute | VWR | 20821.310 | |
| Toluene | VWR | 1.08323.1000 | |
| Mounting medium Pertex | Histolab | 840 | |
| RPLP0 Primer for qPCR | Eurogentec | 5'-TGCATCAGTAC CCCATTCTATCAT-3' ; 5'-AAGGTGTAATC CGTCTCCACAGA-3' |
|
| Aggrecan Primer for qPCR | Eurogentec | 5'-TCTACCGCTGCGAGGTGAT-3' ; 3'-TGTAATGGAACACGATGCCTTT-5' | |
| Collagen II Primer for qPCR | Eurogentec | 5'-ACTGGATTGACCCCAACCAA-3' ; 3'-TCCATGTTGCAGAAAACCTTCA-5' |
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