Summary

3D Stem magnetica cellulare Aggregazione e bioreattore maturazione per la cartilagine Regeneration

Published: April 27, 2017
doi:

Summary

Condrogenesi da cellule staminali richiede la messa a punto delle condizioni di coltura. Qui vi presentiamo un approccio magnetico per condensare le cellule, un passo essenziale per iniziare condrogenesi. Inoltre, mostriamo che la maturazione dinamico in un bioreattore applica stimolazione meccanica ai costrutti cellulari e aumenta la produzione di matrice extracellulare cartilaginea.

Abstract

Ingegneria cartilagine rimane una sfida a causa delle difficoltà nel creare un impianto funzionale in vitro simile al tessuto nativo. Un approccio recentemente esplorato per lo sviluppo delle sostituzioni autologhe comporta la differenziazione delle cellule staminali in condrociti. Per avviare questo condrogenesi, un grado di compattazione delle cellule staminali è richiesta; quindi, abbiamo dimostrato la fattibilità di cellule magneticamente condensazione, sia all'interno scaffold spessi e privo di scaffold, utilizzando miniaturizzati sorgenti di campo magnetico come attrattori cellulari. Questo approccio magnetico è stato utilizzato anche per guidare fusione aggregato e costruire privo di impalcatura, organizzato, tridimensionale (3D) i tessuti diversi millimetri di dimensione. Oltre ad avere una dimensione maggiore, il tessuto formato da fusione magnetica guidato presentato un significativo aumento dell'espressione di collagene II, ed una tendenza simile è stato osservato per l'espressione aggrecan. Come la cartilagine nativa è stato sottoposto a forze tcappello influenzato la sua struttura 3D, la maturazione dinamica è stata effettuata anche. Un bioreattore che fornisce stimoli meccanici stato usato per cultura scaffold magneticamente seminate su un periodo di 21 giorni. Bioreattore maturazione in gran parte migliorato chondrogenesis nelle impalcature cellularized; la matrice extracellulare ottenuto in queste condizioni era ricca di collagene II e aggrecano. Questo lavoro illustra il potenziale innovativo di condensazione magnetica delle cellule staminali etichettati e maturazione dinamica in un bioreattore per una migliore differenziazione condrogenica, sia-impalcatura libero e all'interno polisaccaridi ponteggi.

Introduction

nanoparticelle magnetiche sono già utilizzati in clinica, come agenti di contrasto per la risonanza magnetica (MRI), e le loro applicazioni terapeutiche tenere in espansione. Ad esempio, è stato recentemente dimostrato che le cellule marcate possono essere manipolati in vivo usando un campo magnetico esterno e possono essere orientati e / o mantenuti in un sito definito di impianto 1, 2, 3. In medicina rigenerativa, possono essere utilizzati per ingegnerizzare tessuti organizzati in vitro 4, tra tessuto vascolare 5, 6, 7, 8 osso, cartilagine e 9.

La cartilagine articolare è immersa in un ambiente avascolare, le riparazioni dei componenti della matrice extracellulare molto limitati quando si verificano danni. Per questo motivo, research è attualmente focalizzata sulla progettazione di sostituzioni cartilagine ialina che possono essere impiantati nel sito del difetto. Per produrre una sostituzione autologo, alcuni gruppi di ricerca stanno studiando l'utilizzo di condrociti autologhi come fonte cella 10, 11, mentre altri sottolineano la capacità delle cellule staminali mesenchimali (MSC) a differenziarsi in condrociti 12, 13. In studi precedenti ricapitolato qui, abbiamo scelto MSC, come il loro campionamento del midollo osseo è abbastanza semplice e non richiede il sacrificio di condrociti sani, che rischiano di perdere il loro fenotipo 14.

Un primo passo essenziale per iniziare la differenziazione condrogenica delle cellule staminali è il loro condensazione. Aggregati cellulari sono comunemente formate utilizzando centrifugazione o cultura Micromass 15; Tuttavia, questi metodi di condensazione Neither presentare il potenziale per creare raggruppamenti cellulari all'interno scaffold spessa né la possibilità di controllare la fusione degli aggregati. In questo documento, si descrive un approccio innovativo alla condensazione cellule staminali utilizzando marcatura magnetica MSC e l'attrazione magnetica. Questa tecnica è stata dimostrata per formare costrutti 3D-free scaffold attraverso la fusione di aggregati tra loro per ottenere un millimetro scala tessuto cartilagineo 9. semina magnetico di scaffold spessi e grandi ha anche permesso la possibilità di aumentare la dimensione della ingegneria tessutale, realizzazione di una forma più facilmente utile per l'impianto, e diversificare il potenziale per applicazioni cliniche di riparazione della cartilagine. Qui, si dettaglio il protocollo per la semina magnetico di MSC nella scaffold porosi costituiti da polisaccaridi naturali, pullulano, e destrano, scaffold precedentemente utilizzato per confinare cellule staminali 16, 17. differenziazione condrogenico era finally eseguita in un bioreattore per garantire continue dei nutrienti e diffusione del gas nel nucleo matrice degli scaffold seminati con un'alta densità di cellule. Oltre a fornire le sostanze nutrienti, fattori di crescita condrogeniche e gas alle cellule, il bioreattore offerto stimolazione meccanica. Nel complesso, la tecnologia magnetica utilizzata per confinare le cellule staminali, in combinazione con la maturazione dinamica in un bioreattore, può notevolmente migliorare la differenziazione condrogenico.

Protocol

1. la costruzione dei dispositivi magnetici NOTA: I dispositivi utilizzati per semina delle cellule variano a seconda dell'applicazione (Figura 1). A formare aggregati, il numero delle cellule è limitato a 2,5 × 10 5 / aggregato, così le punte magnetiche devono essere molto sottili (750 micron di diametro). Seminare i ponteggi 1,8 centimetri 2/7 mm di spessore, i magneti devono essere più grandi (3 mm di diametro) e garantiranno migrazione cellula…

Representative Results

In primo luogo, gli aggregati possono essere formati individualmente tramite microorganismi magneti depositando 2,5 x 10 5 cellule staminali marcate (Figura 2A). Questi singoli aggregati (~ 0,8 mm di dimensione) possono essere fusi in strutture più grandi grazie sequenziale, fusione indotta magneticamente. Per esempio, il giorno 8 di maturazione condrogenica, aggregati sono stati posti in contatto in coppia per formare doppietti; quartine sono state assemblat…

Discussion

In primo luogo, perché le tecniche qui presentate si basano su l'internalizzazione delle nanoparticelle magnetiche, una questione importante è il risultato delle nanoparticelle, una volta che localizzano all'interno delle cellule. È vero che le nanoparticelle di ferro possono scatenare tossicità potenziale o capacità di differenziazione ridotta seconda delle loro dimensioni, rivestimento, e il tempo di esposizione 19, 22. Tuttavia, numerosi studi ha…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori vorrebbero riconoscere QuinXell Technologies e CellD, in particolare Lothar Grannemann e Dominique Ghozlan per il loro aiuto con il bioreattore. Ringraziamo Catherine Le Visage, che ci ha fornito i pullulano / ponteggi polisaccaride destrano. Questo lavoro è stato sostenuto dall'Unione Europea (progetto ERC-2014-Cog Matisse 648.779) e dalla AgenceNationalede la Recherche (ANR), la Francia (progetto MagStem ANR-11 SVSE5).

Materials

Iron  oxide (maghemite) nanoparticules ( γ-Fe2O3) PHENIX – University Paris 6 Made and given by C. Ménager Mean diameter of 8.1 nm and negative surface charge
Polysaccharide Pullulan/Dextran scaffolds LIOAD – University Nantes Made and given by C. Le Visage Prepared from a 75:25 mixture of pullulan/dextran in alkaline conditions (10M NaOH). Porosity: 185-205µm; Thickness: 7mm; Surface area: 1.8cm2.
TisXell Regeneration System QuinXell Technologies QX900-002 Biaxial bioreactor with 500 mL culture chamber 
Cage for scaffolds: Histosette II M492  VWR 720-0909
Mesenchymal Stem Cell (MSC) Lonza PT-2501 Three independant batches have been used
MSCGM BulletKit medium Lonza PT-3001 For the complete medium, add the provided BulletKit (containing serum, glutamine and antibiotics) to the MSCGM medium
DMEM with Glutamax I Life Technologies 31966-021 No sodium pyruvate, no HEPES
RPMI medium 1640, no Glutamine Life Technologies 31870-025 No sodium pyruvate, no HEPES
PBS w/o CaCl2 w/o MgCl2 Life Technologies 14190-094
0.05% Trypsin-EDTA (1x) Life Technologies 25300-054
Penicillin (10.000U/mL)/Streptomicin (10.000µg/mL) Life Technologies 15140-122
ITS Premix Universal Culture Supplement (20x) Corning 354352
Sodium pyruvate solution 100mM Sigma S8636
L-Ascorbic Acid 2-phosphate Sigma A8960 Prepare the concentrated solution (25 mM) in distilled water extemporaneously
L-Proline Sigma P5607 Prepare the 175 mM stock solution diluted in distilled water and store at 4°C
Dexamethasone Sigma D4902 Prepare the 1 mM stock solution diluted in Ethanol 100% and store at -20°C
TGF-beta 3 protein 10µg Interchim 30R-AT028
Tri-sodium citrate VWR 33615.268 Prepare the 1M stock solution diluted in distilled water and store at 4°C
Pullulanase from Bacillus acidopullulyticus Sigma P2986
Dextranase from Chaetomium erraticum Sigma D0443
NucleoSpin RNA Extraction Kit Macherey-Nagel 740955.5
SuperScript II Reverse Transcriptase Life Technologies 18064-014
Random Primer – Hexamer  Promega C1181 500 µg/mL: Use diluted 1/2 and put 1 µL per sample
Recombinant RNAsin ribonuclease inhibitor Promega N2511 40 U/µL: put 1 µL per sample
PCR nucleotide dNTP mix (10mM each) Roche 10842321
SyBr Green PCR Master Mix Life Technologies 4368708
Step One Plus Real-Time PCR System Life Technologies 4381792
Formalin solution 10% neutral buffered Sigma HT5012
OCT solution VWR 361603E
Isopentane Sigma M32631
Toluidine blue O VWR 1.15930.0025
Ethanol absolute VWR 20821.310
Toluene VWR 1.08323.1000
Mounting medium Pertex Histolab 840
RPLP0 Primer for qPCR Eurogentec 5'-TGCATCAGTAC
CCCATTCTATCAT-3' ;
5'-AAGGTGTAATC
CGTCTCCACAGA-3'
Aggrecan Primer for qPCR Eurogentec 5'-TCTACCGCTGCGAGGTGAT-3' ; 3'-TGTAATGGAACACGATGCCTTT-5'
Collagen II Primer for qPCR Eurogentec 5'-ACTGGATTGACCCCAACCAA-3' ; 3'-TCCATGTTGCAGAAAACCTTCA-5'

References

  1. Naumova, A. V., Modo, M., Moore, A., Murry, C. E., Frank, J. A. Clinical imaging in regenerative medicine. Nat Biotechnol. 32 (8), 804-818 (2014).
  2. Edmundson, M., Thanh, N. T., Song, B. Nanoparticles based stem cell tracking in regenerative medicine. Theranostics. 3 (8), 573-582 (2013).
  3. Di Corato, R., et al. High-resolution cellular MRI: gadolinium and iron oxide nanoparticles for in-depth dual-cell imaging of engineered tissue constructs. ACS Nano. 7 (9), 7500-7512 (2013).
  4. Xu, F., et al. Three-dimensional magnetic assembly of microscale hydrogels. Adv Mater. 23 (37), 4254-4260 (2011).
  5. Kito, T., et al. iPS cell sheets created by a novel magnetite tissue engineering method for reparative angiogenesis. Sci Rep. 3, 1418 (2013).
  6. Mironov, V., Kasyanov, V., Markwald, R. R. Nanotechnology in vascular tissue engineering: from nanoscaffolding towards rapid vessel biofabrication. Trends Biotechnol. 26 (6), 338-344 (2008).
  7. Mattix, B. M., et al. Janus magnetic cellular spheroids for vascular tissue engineering. Biomaterials. 35 (3), 949-960 (2014).
  8. Henstock, J., El Haj, A. Controlled mechanotransduction in therapeutic MSCs: can remotely controlled magnetic nanoparticles regenerate bones?. Regen Med. 10 (4), 377-380 (2015).
  9. Fayol, D., et al. Use of magnetic forces to promote stem cell aggregation during differentiation, and cartilage tissue modeling. Adv Mater. 25 (18), 2611-2616 (2013).
  10. Bartlett, W., et al. Autologous chondrocyte implantation versus matrix-induced autologous chondrocyte implantation for osteochondral defects of the knee: a prospective, randomised study. J Bone Joint Surg Br. 87 (5), 640-645 (2005).
  11. Batty, L., Dance, S., Bajaj, S., Cole, B. J. Autologous chondrocyte implantation: an overview of technique and outcomes. ANZ J Surg. 81, 18-25 (2011).
  12. Song, L., Baksh, D., Tuan, R. S. Mesenchymal stem cell-based cartilage tissue engineering: cells, scaffold and biology. Cytotherapy. 6 (6), 596-601 (2004).
  13. Boeuf, S., Richter, W. Chondrogenesis of mesenchymal stem cells: role of tissue source and inducing factors. Stem Cell Res Ther. 1 (4), 31 (2010).
  14. Kock, L., van Donkelaar, C. C., Ito, K. Tissue engineering of functional articular cartilage: the current status. Cell Tissue Res. 347 (3), 613-627 (2012).
  15. Schon, B. S., et al. Validation of a high-throughput microtissue fabrication process for 3D assembly of tissue engineered cartilage constructs. Cell Tissue Res. , (2012).
  16. Robert, D., et al. Magnetic micro-manipulations to probe the local physical properties of porous scaffolds and to confine stem cells. Biomaterials. 31 (7), 1586-1595 (2010).
  17. Luciani, N., et al. Successful chondrogenesis within scaffolds, using magnetic stem cell confinement and bioreactor maturation. Acta Biomaterialia. 37, 101-110 (2016).
  18. Wilhelm, C., Gazeau, F. Universal cell labelling with anionic magnetic nanoparticles. Biomaterials. 29 (22), 3161-3174 (2008).
  19. Fayol, D., Luciani, N., Lartigue, L., Gazeau, F., Wilhelm, C. Managing magnetic nanoparticle aggregation and cellular uptake: a precondition for efficient stem-cell differentiation and MRI tracking. Adv Healthc Mater. 2 (2), 313-325 (2013).
  20. Wilhelm, C., Gazeau, F., Bacri, J. C. Magnetophoresis and ferromagnetic resonance of magnetically labeled cells. Eur Biophys J. 31 (2), 118-125 (2002).
  21. Autissier, A., Le Visage, C., Pouzet, C., Chaubet, F., Letourneur, D. Fabrication of porous polysaccharide-based scaffolds using a combined freeze-drying/cross-linking process. Acta Biomater. 6 (9), 3640-3648 (2010).
  22. Singh, N., Jenkins, G. J. S., Asadi, R., Doak, S. H. Potential toxicity of superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPION). Nano Reviews. 1, (2010).
  23. Lee, J. H., Hur, W. Scaffold-free formation of a millimeter-scale multicellular spheroid with an internal cavity from magnetically levitated 3T3 cells that ingested iron oxide-containing microspheres. Biotechnol Bioeng. 111 (5), 1038-1047 (2014).
  24. Mattix, B., et al. Biological magnetic cellular spheroids as building blocks for tissue engineering. Acta Biomaterialia. 10 (2), 623-629 (2014).
  25. Mazuel, F., et al. Massive Intracellular Biodegradation of Iron Oxide Nanoparticles Evidenced Magnetically at Single-Endosome and Tissue Levels. ACS Nano. 10 (8), 7627-7638 (2016).
  26. Kim, J. A., et al. High-throughput generation of spheroids using magnetic nanoparticles for three-dimensional cell culture. Biomaterials. 34 (34), 8555-8563 (2013).
  27. Shimizu, K., Ito, A., Honda, H. Enhanced cell-seeding into 3D porous scaffolds by use of magnetite nanoparticles. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 77 (2), 265-272 (2006).
  28. Sensenig, R., Sapir, Y., MacDonald, C., Cohen, S., Polyak, B. Magnetic nanoparticle-based approaches to locally target therapy and enhance tissue regeneration in vivo. Nanomedicine (Lond). 7 (9), 1425-1442 (2012).
  29. Waldman, S. D., Couto, D. C., Grynpas, M. D., Pilliar, R. M., Kandel, R. A. Multi-axial mechanical stimulation of tissue engineered cartilage: review. Eur Cell Mater. 13, 66-74 (2007).
  30. Takahashi, I., et al. Compressive force promotes sox9, type II collagen and aggrecan and inhibits IL-1beta expression resulting in chondrogenesis in mouse embryonic limb bud mesenchymal cells. J Cell Sci. 111 (14), 2067-2076 (1998).
  31. Campbell, J. J., Lee, D. A., Bader, D. L. Dynamic compressive strain influences chondrogenic gene expression in human mesenchymal stem cells. Biorheology. 43, 455-470 (2006).
  32. Vunjak-Novakovic, G., et al. Bioreactor cultivation conditions modulate the composition and mechanical properties of tissue-engineered cartilage. J Orthop Res. 17 (1), 130-138 (1999).

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Cite This Article
Van de Walle, A., Wilhelm, C., Luciani, N. 3D Magnetic Stem Cell Aggregation and Bioreactor Maturation for Cartilage Regeneration. J. Vis. Exp. (122), e55221, doi:10.3791/55221 (2017).

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