Summary
Chondrogenese fra stamceller kræver finjustering dyrkningsbetingelserne. Her præsenterer vi en magnetisk tilgang til kondenserende celler, at et vigtigt skridt initiere chondrogenese. Derudover viser vi, at dynamisk modning i en bioreaktor gælder mekanisk stimulering til de cellulære konstruktioner og øger bruskagtig extracellulær matrixproduktion.
Abstract
Brusk engineering fortsat en udfordring på grund af vanskelighederne med at skabe en in vitro funktionel implantat ligner det native væv. En tilgang nylig undersøgt for udvikling af autologe udskiftninger involverer differentiering af stamceller til chondrocytter. For at påbegynde denne chondrogenese, en komprimeringsgrad af stamcellerne er påkrævet; derfor demonstrerede vi muligheden for magnetisk kondenserende celler, både inden tykke stilladser og stillads-fri, under anvendelse af miniaturiserede magnetiske kilder som celle attractors. Denne magnetiske fremgangsmåde blev også anvendt til at styre aggregat fusion og opbygge stillads-fri, organiseret, tredimensionale (3D) væv flere millimeter i størrelse. Ud over at have en forbedret størrelse, dannet af magnetisk drevne fusion væv præsenteret en signifikant stigning i ekspressionen af kollagen II, og der blev observeret en lignende tendens til aggrecan-ekspression. Som det native brusk blev underkastet kræfter that påvirket sin 3D-struktur, var dynamisk modning også udført. En bioreaktor, der giver mekaniske stimuli blev anvendt til at dyrke de magnetisk podet stilladser over en periode på 21 dage. Bioreaktor modning i høj grad forbedret chondrogenese i cellularized stilladser; den ekstracellulære matrix opnået under disse betingelser var rig på kollagen II og aggrecan. Dette arbejde beskriver innovative potentiale magnetisk kondensering af mærkede stamceller og dynamisk modning i en bioreaktor til forbedret chondrogen differentiering, både scaffold-fri og inden polysaccharid stilladser.
Introduction
Magnetiske nanopartikler anvendes allerede i klinikken som kontrastmidler til magnetisk resonans imaging (MRI), og deres terapeutiske anvendelser holde udvide. For eksempel er det for nylig blevet vist, at mærkede celler kan manipuleres in vivo under anvendelse af et eksternt magnetisk felt, og kan ledes og / eller opretholdes ved en defineret implantationsstedet 1, 2, 3. I regenerativ medicin, kan de anvendes til at konstruere organiserede væv in vitro 4, herunder karvæv 5, 6, 7, knogle 8, og brusk 9.
Ledbrusk er nedsænket i en avaskulær miljø, hvilket gør reparationer af de ekstracellulære matrixkomponenter meget begrænsede, når skaden indtræffer. Af denne grund, researchfirmaerneh er i øjeblikket fokuseret på engineering af hyaline brusk udskiftninger, der kan implanteres i det defekte område. For at fremstille et autologt udskiftning, er nogle forskningsgrupper udforske anvendelsen af autologe chondrocytter som en cellekilde 10, 11, mens andre understreger kapaciteten af mesenkymale stamceller (MSC) til at differentiere til chondrocytter 12, 13. I tidligere undersøgelser er gengivet, valgte vi MSC, som deres knoglemarv prøveudtagning er forholdsvis enkel og kræver ikke det offer af sunde chondrocytter, som risikerer at miste deres fænotype 14.
Et tidligt trin vigtigt at indlede den chondrogene differentiering af stamceller er deres kondens. Celleaggregater dannes almindeligvis ved anvendelse af enten centrifugering eller mikromassekultur 15; men disse kondensationsmetoder neither præsentere potentiale til at skabe celleklynger inden tykke stilladser eller potentialet til at kontrollere fusionen af aggregater. I dette papir, beskriver vi en innovativ tilgang til kondenserende stamceller under anvendelse af MSC magnetisk mærkning og magnetiske tiltrækning. Denne teknik har vist sig at danne stillads-fri 3D konstruktioner via fusion af aggregater med hinanden for at opnå en millimeter-skala bruskvæv 9. Magnetisk podning af tykke og store skeletter har også givet mulighed for at øge størrelsen af den konstruerede væv, designe en form lettere anvendelig til implantering, og diversificering af potentialet for kliniske anvendelser i brusk reparation. Her, vi detaljeret protokol for den magnetiske podning af MSC i porøse stilladser sammensat af naturlige polysaccharider, pullulan og dextran, stilladser tidligere blev anvendt til at begrænse stamceller 16, 17. Chondrogen differentiering var finally udført i en bioreaktor for at sikre løbende næringsstof og gas diffusion i matricen kerne af skeletter podet med en høj tæthed af celler. Ud over at give næringsstoffer, chondrogene vækstfaktorer og gas til cellerne, bioreaktoren tilbød mekanisk stimulation. Samlet set den magnetiske teknologi anvendes til at begrænse stamceller, kombineret med dynamisk modning i en bioreaktor, kan markant forbedre chondrogen differentiering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Konstruktion af de magnetiske enheder
BEMÆRK: udstyr til cellepodning varierer afhængigt af anvendelsen (figur 1). Til dannelse af aggregater, er antallet af celler begrænset til 2,5 x 10 5 / aggregat, så de magnetiske tips skal være meget tynde (750 um i diameter). At pode 1,8 cm2 / 7 mm tykke stilladser, skal magneterne være større (3 mm i diameter) og vil sikre cellemigrering gennem porerne i stilladset.
- Konstruktion af en indretning med mikro-magneter for aggregatdannelse (figur 1A)
- Gøre mikrohuller med en 0,8-mm bor gennem aluminiumplader (3 cm i diameter og 6 mm tykke).
- Indsætte en magnetisk spids (750 pm i diameter) i hvert hul i pladen.
- Placer denne disk over en permanent neodym magnet, som sikrer magnetisering til mætning.
- Konstruktion af en indretning til stillads podning (
- Skæres hårde polystyren i 2,4 cm 2 firkanter.
- Indsætte 9 små magneter (3 mm i diameter, 6 mm lange) i samme afstand over et overfladeareal på 1,6 cm2.
- Placer denne enhed via en permanent neodymium magnet.
2. Stem Cell Mærkning
BEMÆRK: Stamceller blev mærket med 0,1 mM magnetiske nanopartikler i 30 minutter (2,6 ± 0,2 pg jern / celle) for at danne aggregater, mens de blev mærket med 0,2 mM magnetiske nanopartikler i 30 minutter (5 ± 0,4 pg jern / celle) til frø stilladser. Disse nanopartikler koncentrationer og inkuberingstider er blevet anvendt tidligere og offentliggjort for MSC og andre celler 18, 19, og det er blevet bestemt, at nanopartikler påvirket hverken cellelevedygtighed eller MSC differentiering kapacitet. Jern masse inkorporeret ved stamcellerne blev målt via single-cell magnetophoresis 19, 20.
- Kultur humane mesenchymstamceller (MSC) i komplet mesenchymal stamcelle vækstmedium (MSCGM) ved 37 ° C og 5% CO2 indtil nær til konfluens (~ 90%).
- Forberede den magnetiske mærkning opløsning ved blanding af 0,1 eller 0,2 mM maghemit citrat-coatede jernoxid (γFe 2 O 3 kerne: 8 nm diameter) i serumfrit McCoys 5A-medium modificeret i Roswell Park Memorial Institute (RMPI) uden glutamin og indeholdende 5 mM natriumcitrat.
- Kassér mediet, skylles cellerne med serum-frit RPMI-medium uden glutamin og tilsættes 10 ml af jernoxid nanopartikel opløsning pr 150-cm2 dyrkningskolbe, det minimale volumen, der kræves for at dække alle cellerne.
- Inkuber i 30 minutter ved 37 ° C og 5% CO2 og derefter kassere nanopartiklen opløsning. Skyl i 5 minutter med serumfrit RPMI-medium uden glutamin at internalisere nanoparticles stadig fastgjort til plasmamembranen.
- Kassér RPMI-medium og 25 ml komplet MSCGM medium pr kolbe. Inkuber natten over ved 37 ° C og 5% CO2.
3. Magnetisk Cell Seedning
- Frisk forberede den chondrogene medium ved anvendelse af Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM) høj glucose med L-glutamin ved tilsætning af 50 uM L-ascorbinsyre-2-phosphat, 0,1 uM dexamethason, 1 mM natriumpyruvat, 0,35 mM L-prolin, 1% universel kultur supplement indeholdende insulin, humant transferrin og selensyre (ITS-Premix), og 10 ng / ml transformerende vækstfaktor-beta 3 (TGF-β3).
- Frigøre de magnetiske celler under anvendelse 8 ml 0,05% trypsin-EDTA pr 150-cm2 dyrkningskolbe og centrifuger dissocierede celler ved 260 x g i 5 min. Aspirer mediet og tælle resuspenderede celler.
- Placer glasbund cellekultur petriskål (35 mm) oven på begge magnetiske enheder.
- Til magnetically danne aggregater, tilsættes 3 ml chondrogent medium til petriskålen og forsigtigt deponere det mindst mulige volumen (ikke mere end 8 pi) indeholdende 2,5 x 10 5 mærkede celler pr aggregat (op til 16 aggregater kan afsættes). Efterlad petriskålen i 20-30 minutter uden at flytte det, gør det muligt at danne sfæroider, og derefter placere hele anordningen, herunder petriskålen indeholdende de 16 aggregater, i inkubatoren ved 37 ° C og 5% CO2.
- Form kontrol aggregater efter den samme protokol og erstatte det komplette medium med chondrogent medium uden TGF-β3.
- For at generere 3D samlede konstruktion, placere 2-aggregater i kontakt på dag 8 til at danne 8 dubletter og indlede fusion. På dag 11, flette 2 dubletter til dannelse 4 firlinger. Endelig sammensmelte de 4 firlinger på dag 15 til opnåelse af den endelige struktur.
- Samtidig, danne aggregater ved centrifugering 2,5 x 10 5 mærkede stamceller ved 26015; g i 5 minutter i 15-ml rør med 1,5 ml chondrogent medium med eller uden TGF-β3 (for prøve og kontrol, respektivt).
- At magnetisk frø stilladser, placere hver tørrede stillads i en petriskål. Anvende polysaccharid porøse stilladser fremstillet af pullulan / dextran 21. For hvert stillads, fortyndes 2 × 10 6 mærkede stamceller i 350 pi chondrogent medium uden TGF-β3 og omhyggeligt pipette cellerne på stilladset.
- Der inkuberes i 5 minutter ved 37 ° C for at tillade fuld cellepenetrering inden stilladset og derefter forsigtigt tilsættes 3 ml chondrogent medium med eller uden TGF-β3 (for prøve eller kontrol, respektivt) til petriskålen.
- Inkubér cellularized stillads på magnetindretningen ved 37 ° C og 5% CO2 i 4 dage for at give mulighed for cellemigrering gennem stilladsdele porer og indespærring.
- Samtidig, frø stilladser med 2 x 10 6
4. Differentiering til chondrocytter
BEMÆRK: Efter 4 dages inkubation fjerne magneterne og fortsætte den chondrogene modning enten i en petriskål (statiske betingelser) eller i en bioreaktor (dynamiske forhold). Negative kontrolprøver er modnet i statiske forhold med chondrogent medium uden TGF-β3.
- I statiske forhold, holde cellularized stilladser eller aggregater i samme petriskål. Skift chondrogene medium to gange om ugen i 21 dage.
- I dynamiske forhold, forberede bioreaktoren.
- Skåret silikoneslange i passende længde ifølge fabrikantens protokol.
- Autoklavér alle materialer: 500 ml kultur kammer, slanger, 2-vejs rotatorer, og bure.
- Placere bioreaktor dele i en steril Microbiologisk sikkerhed station. Tilslut slangen til de 2-vejs rotatorer og til dyrkningskammeret efter fabrikantens anvisninger.
- overføre omhyggeligt cellularized stilladser i steriliserede bure under anvendelse af en steril spatel. Sted 2 skeletter pr bur. Når burene er klar, indsætte dem i nålene i låget for at holde dem fra at flytte under yderligere rotation. Fyld dyrkningskammeret med chondrogent medium og lukke den med låget indeholdende burene.
- Tænd peristaltisk pumpe til at fylde slangen med chondrogene medium og fjerne luftbobler.
- Placere og fastgøre fyldte kammer ind i motoren af bioreaktoren og tænder computeren, som styrer rotationer både af armen og af kammeret.
- Anvende en rotationshastighed på 5 omdrejninger pr minut (RPM) på både armen og kammeret. Justere den peristaltiske pumpe ved en strømningshastighed på 10 rpm i kontinuerlig tilførsel af cellularized stilladser.
BEMÆRK: Før RNA-ekstraktion, fordøje stilladser med en enzymatisk opløsning.
- Forberede 1 ml enzymatisk opløsning ved tilsætning af 100 pi pullulanase (40 U / ml) og 50 pi dextranase (60 mg / ml) til 850 ml serumfrit DMEM-medium.
- Skyl stilladser to gange med serumfrit DMEM-medium, kasseres mediet, og tilsæt 800 pi af den enzymatiske opløsning pr stillads. Inkuber i 15-30 minutter ved 37 ° C under forsigtig omrøring.
- Når stilladset er fuldstændig opløst, overføres opløsningen indeholdende cellerne til et 1,5-ml rør, centrifugeres ved 300 x g i 10 minutter, omhyggeligt aspireres mediet, skylles to gange med steril 1 x phosphatbufret saltvand (PBS), centrifuger ved 300 x g i 10 min, og re-suspendere cellerne i RNA-isolering opløsning.
- For at ekstrahere RNA fra aggregaterne, placere sfæroiderne i RNA-isolering opløsning ogfuldstændigt knuse dem under anvendelse af en homogenisator før udførelse RNA-ekstraktion.
- Isolere RNA under anvendelse af et kit til total RNA-ekstraktion i overensstemmelse med producentens anvisninger.
- Syntetisere komplementært DNA fra 400 ng totalt RNA under anvendelse af revers transkriptase ifølge producentens anvisninger ved hjælp 250 ng tilfældige primere, 1 pi dNTP-blanding (10 mM hver), og 40 U / ml RNase-inhibitor; slutvolumenet af reaktionen er 20 pi. Ved afslutningen af reaktionen tilsættes 80 pi destilleret vand til opnåelse af et slutvolumen på 100 pi.
- Til kvantitativ polymerasekædereaktion (PCR), bruge en PCR-blanding indeholdende et fluorescerende reagens at kvantificere den relative ekspression af generne af interesse, såsom aggrecan (AGC) og kollagen II (Col II), med 10 × fortyndet cDNA. Normalisere niveauer af genekspression med henvisning gen ribosomale protein, Large, P0 (RPLP0). Udføre beregningerne med 2 - ΔΔCT formel, Hvor ΔΔCT = ACt af differentieret tilstand - betyde ACt af kontrol, og hver af ACt repræsenterer CT af genet af interesse - CT af referencen genet (RPLP0).
- Bestemme statistiske målinger som middelværdierne ± standardfejlen på middelværdien (SEM). Udføre analysen med n ≥ 2 uafhængige forsøg. Brug t-test til at analysere de statistiske forskelle mellem centrifugerede pellets og magnetiske fusioner (* p <0,05). Bestemme betydningen med en Kruskal-Wallis-test (envejs ANOVA-parametrisk) at analysere statistiske forskelle mellem differentierede stilladser og med kontrol stillads (* p <0,05).
6. Histologisk analyse
- Skyl cellularized stilladser eller aggregater med steril 1 x PBS, rette dem i 10% formalinopløsning i 1 time ved stuetemperatur, og skyl med 1 × PBS.
- Fjern PBS, indkapsle prøverne i optimal cutting temperatur forbindelse (OLT) og fryse dem i en isopentan bad nedsænket i flydende nitrogen. Prøven opbevares ved -20 ° C. Skær prøverne med en kryostat til opnåelse 8 um kryosektioner for aggregater eller 12-um for de cellularized stilladser.
- Farv kryosektionerne med 0,5% toluidinblåt opløsning i 2 minutter, skylles i ledningsvand, dehydrere med 100% ethanol, tydeliggøre anvendelse af toluen, og montere objektglassene med et monteringsmedium til lysmikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For det første kan aggregater individuelt dannet ved anvendelse af mikro-magneter ved at afsætte 2,5 x 10 5 mærkede stamceller (figur 2A). Disse enkelt aggregater (~ 0,8 mm i størrelse) kan derefter fusioneres til større strukturer takket være sekventiel, magnetisk induceret fusion. For eksempel på dag 8 af chondrogen modning blev aggregater anbragt i kontakt i par til dannelse dubletter; firlinger blev samlet på dag 11 ved at sammenlægge 2 dubletter; og endelig, på dag 15, de 4 firlinger blev fusioneret til dannelse af en 3D-konstruktion indeholdende 16 af de oprindeligt dannede aggregater, med i alt 4 x 10 6 celler (~ 4 mm i størrelse) (Figur 2B). For det andet har den magnetiske tiltrækning teknik blevet anvendt til dannelse af celleaggregater inden stilladser. Skeletter blev podet over magnetindretningen og viste tæt kondenseret celler i porerne af stilladset, ved nøjagtige mikro-magnet steder (figur 2C). Derimod når celler blev podet i et stillads uden magnetisk tiltrækning (passiv podning), viste de sig at være jævnt fordelt. Cellularized skeletter blev derefter indsat i bure (figur 3A) er fastgjort til bioreaktoren kammer til at udføre den chondrogene proces under dynamiske modningsprodukter betingelser (figur 3B). Sådan en bioreaktor forbedrer udveksling af næringsstoffer og gas og tilvejebringer mekanisk stimulation ved transduktion. Rotationshastighed både armen og kammeret blev indstillet til 5 omdr./min, som anbefalet af konstruktøren til blødt 3D vævsregenerering. En peristaltisk pumpe, der tilvejebringer en kontinuerlig forsyning af medium blev indstillet til 10 omdr./min.
For alle betingelser for celleorganisation (fusionerede aggregater og podning inden stilladser) og væv modning (i eller uden en bioreaktor) blev genekspression analyseret på dag 25. Vævet dannes af magnetisk fusion viste en significant stigning i kollagen II-ekspression i forhold til pelleten opnået ved centrifugering (figur 4A), sammen med en øget tendens til aggrecan-ekspression. For cellularized stilladser, opnåede vi en stigning i aggrecan og collagen II-ekspression-signifikant for collagen II-når blev anvendt magnetisk podning sammenlignet med skeletterne podet uden magnetiske kræfter. Hertil kommer, at ekspression af begge gener var meget højere (signifikant for Col II), når magnetisk podning blev kombineret med dynamisk differentiering (figur 4B).
Histologiske analyser blev også udført, for eksempel ved anvendelse af en toluidinblåt plet at afsløre de glycosaminoglycaner (GAG). Den sekventielle magnetisk fusion af 16 aggregater udviste rigelige aflejring af GAG, som bekræftet af blå-violet farve (figur 5A). For stilladser, kun dem magnetisk seedet blev farvet med toluidinblåt. GAG content var højere, når skeletterne blev differentieret i en bioreaktor (figur 5B) snarere end statisk (figur 5C). Taget sammen viser disse resultater potentialet af magnetisk aggregering og magnetisk såning i stilladser kan forbedre chondrogenese. Det viser også, at de dynamiske modning betingelser inden bioreaktoren er langt mere gunstige for effektiv differentiering.
Figur 1. Konstruktion af de magnetiske enheder. (A) Eksempel på en magnetisk indretning til aggregatdannelse: aluminiumspladen blev boret (0,8 um diameter huller) og tip blev indsat i hvert hul og derefter anbragt på en permanent neodym magnet, som har sikret magnetisering til mætning. (B) Magnetisk enhed til frø stilladset: hårde polystyren (24 mm2) med 9 manuelt lavet huller varplaceret på en permanent neodym magnet, som har sikret magnetisering til mætning. Små magneter (3 mm i diameter) blev derefter indsat i hvert hul til dannelse af indretningen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Magnetisk mærkning af stamceller og podning. (A) Stamceller blev mærket med jernoxid nanopartikler i 30 minutter ved 37 ° C. (B) Sfæroider dannet ud fra mærkede celler tiltrækkes af et netværk af 16 mikro-magneter. Aggregaterne blev slået sammen i firlinger på dag 11 ved fusion af dubletter dannede 3 dage før. De firlinger blev derefter fusioneret på dag 15 for at konstruere den endelige manipuleret væv. (C) En stillads, anbragt i en glas-bund skålen, blev podet med eller medud magnetiske kræfter. På dag 4 blev pletter af komprimerede stamceller observeret i magnetisk podede stillads, medens cellerne optrådte ensartet fordelt i stilladset podet uden en magnet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Dynamisk modning af cellularized stilladser. (A) Efter magnetisk eller passiv såning, blev cellularized stilladser sat i bure for at undgå forstyrrelser. (B) Bure, faste anvendelse nålene i hætten, blev anbragt i beholderen af bioreaktoren fyldt med chondrogent medium. Bioreaktoren anvendt biaksial rotation med en uafhængigt styret hastighed (1-12 rpm og 1-35 rpm i armen og kammeret, henholdsvis). En peristaltisk pumpe kontinuerligt billede medium. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Ekspression af specifikke chondrogene gener på dag 25. (A) Det magnetisk inducerede fusion af MSC sfæroider viste en betydelig stigning i kollagen II sammenlignet med pelleten dannet ved centrifugering. * Betegner en statistisk forskel ved anvendelse af Students t-test (p-værdi <0,05). (B) Ekspression af aggrecan og collagen II blev klart forøget i skeletter differentierede med en kombination af magnetisk podning og dynamisk modning i en bioreaktor. Genekspression blev normaliseret til RPLP0 mRNA og udtrykkes i vilkårlige enheder i forhold til kontrol (~ 1 ± SEM). Resultaterne er vist som middelværdi ± SEM af to til fire uafhængige eksperimenter. * deNOTES en statistisk forskel under anvendelse af Kruskal-Wallis-test (envejs ANOVA-parametrisk test) (p-værdi <0,05). (-): såning uden magnet; (+): Podning med magnetiske kræfter. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Histologisk farvning af glycosaminoglycaner på dag 25. Glycosaminoglycannedbrydende (GAG) indskud er godtgjort ved blåviolet farve. (A) En positiv toluidinblåt farve blev observeret i de 8 um snit af frosset den endelige bruskstruktur opnået fra den sekventielle fusion af 16 aggregater. 12-um snit af frosset scaffolds magnetisk podet efter statisk (B) eller dynamiske (C) betingelser viste tydeligtat GAG indhold var højere i stilladser differentierede i en bioreaktor. Pile viser aggregater af differentierede celler. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For det første fordi de teknikker, der præsenteres her stole på internalisering af magnetiske nanopartikler, en vigtigt spørgsmål er resultatet af nanopartiklerne, når de lokaliserer i cellerne. Det er korrekt, jern nanopartikler kan udløse potentiel toksicitet eller forringet differentieringskapacitet afhængig af deres størrelse, belægning, og eksponeringstiden 19, 22. Imidlertid har flere undersøgelser vist nogen indvirkning på cellulær fysiologi, når indkapslede jern nanopartikler blev anvendt 23 i form af magnetoferritin, en biologisk magnetisk nanopartikel 24, eller blev anvendt med en simpel citrat belægning og passende koncentrationer 18. Hertil kommer, når jernoxid nanopartikler blev anvendt i lignende betingelser som dem, der er beskrevet i dette dokument (med MSC og for chondrogenese), vi for nylig vist, at en hurtig og næsten total nedbrydning af nanopartikler forekommer inden endosomerne i omkring 10 dage efter cellulær inkorporering og MSC klumpformet dannelse. Interessant nok blev denne massive nedbrydning forbundet med effektiv lagring af frit jern i ferritinprotein og resulterede i en meget begrænset indvirkning på den cellulære jern metabolisme, boding godt for fremtidige kliniske anvendelser 25.
Et andet kritisk punkt er kravet om celle komprimering at initiere chondrogenese. Sædvanligvis kondensation af celler opnået ved centrifugering; Dog er denne fremgangsmåde begrænset af et lavt antal celler (ikke mere end 2,5 × 10 5 celler). Past dette nummer, kan de næringsstoffer og gas ikke diffunderer til midten af aggregaterne, udløser celle nekrose. Her, vises den magnetiske kondensation af mærkede stamceller til aggregater som en væsentlig metode til dannelse af 3D-konstruktioner til bruskvæv regenerering. En sådan magnetisk procedure er blevet anvendt af andre forfattere tilbygge 3D sfæroider: ved magnetisk levitation med en magnet placeret på toppen af pladen efter dissociation af celler 23 eller med jern stifter at lokalisere det magnetiske felt 26. Imidlertid magnetisk levitation ikke at være egnet til de næste trin af den samlede fusion. Derimod med den magnetiske fremgangsmåde foreslås her, skal vi styre alle fusionsproteiner foranstaltninger for at opnå en trin-for-trin bruskvæv konstruktion. Kort fortalt denne flertrinsproces starter med indespærring af stamceller i aggregerede byggesten og efterfølges af fusionen af disse blokke i en større struktur. De kritiske trin i denne stillads-fri stamcelle aggregering procedure er følgende: for det første må man danne hvert aggregat med så lille et volumen på celler som muligt og for det andet må man styre fusionsproteiner skridt til at undgå dannelsen af en enkelt, stor aggregat. Den her opnåede væv var rig på kollagen II og aggrecan. Den fremlagde også advantages ved at have fleksibel geometri og størrelse og af at være stillads-fri.
Den magnetiske fremgangsmåde blev også anvendt til at styre stamceller inden tykke og store stilladser; et andet alternativ til design af forskellige former og størrelser. Det kritiske skridt her er at frø stilladser med en passende mængde af celler: hverken for lidt til at have en samlet homogen fordeling af celler, og heller ikke for meget for at undgå enhver celle tab. Magnetiske kræfter blev tidligere anvendt til at tiltrække og fastholde celler i stilladser og at forbedre cellepodning 27, 28. Her, tilstrækkelig celle kondens i porerne i polysaccharid scaffolds ført til vellykket chondrogenese. Den ekstracellulære matrix produktion blev markant forbedret, når de magnetisk cellularized skeletter blev underkastet de transduktion / shear stress stimuli leveret af bioreaktoren takket være sin bi-aksial rotation. Det er blevet vist i andre undersøgelser, der multi-aksiale belastningstilstande forbedret kvaliteten af væv dannet af chondrocytter 29. Denne hidtil ukendte bioreaktor koncept præsenterer en virkelig gevinst i forhold til de eksisterende teknikker, hvor kun trykkræfter påføres 30, 31, 32.
Som konklusion chondrogen differentiering, brug af magnetisk indeslutning af mærkede stamceller til at danne og manipulere aggregater samt til frø skeletter tilladt til oprettelse af millimeter størrelse brusk cellulære konstruktioner. Desuden kombinerer magnetisk cellepodning med dynamisk differentiering giver et værdifuldt nyt værktøj til regenerativ medicin applikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne anerkende QuinXell Technologies og CellD, især Lothar Grannemann og Dominique Ghozlan for deres hjælp med bioreaktoren. Vi takker Catherine Le Visage, der har givet os med pullulanet / dextran polysaccharid stilladser. Dette arbejde blev støttet af Den Europæiske Union (ERC-2014-cog projekt Matisse 648.779) og af AgenceNationalede Recherche (ANR), Frankrig (MagStem projekt ANR-11 SVSE5).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Iron oxide (maghemite) nanoparticules (γ-Fe2O3) | PHENIX - University Paris 6 | Made and given by C. Ménager | Mean diameter of 8.1 nm and negative surface charge |
| Polysaccharide Pullulan/Dextran scaffolds | LIOAD - University Nantes | Made and given by C. Le Visage | Prepared from a 75:25 mixture of pullulan/dextran in alkaline conditions (10 M NaOH). Porosity: 185-205 µm; Thickness: 7 mm; Surface area: 1.8 cm2. |
| TisXell Regeneration System | QuinXell Technologies | QX900-002 | Biaxial bioreactor with 500 mL culture chamber |
| Cage for scaffolds: Histosette II M492 | VWR | 720-0909 | |
| Mesenchymal Stem Cell (MSC) | Lonza | PT-2501 | Three independant batches have been used |
| MSCGM BulletKit medium | Lonza | PT-3001 | For the complete medium, add the provided BulletKit (containing serum, glutamine and antibiotics) to the MSCGM medium |
| DMEM with Glutamax I | Life Technologies | 31966-021 | No sodium pyruvate, no HEPES |
| RPMI medium 1640, no Glutamine | Life Technologies | 31870-025 | No sodium pyruvate, no HEPES |
| PBS w/o CaCl2 w/o MgCl2 | Life Technologies | 14190-094 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 25300-054 | |
| Penicillin (10,000 U/mL) / Streptomycin (10,000 µg/mL) | Life Technologies | 15140-122 | |
| ITS Premix Universal Culture Supplement (20x) | Corning | 354352 | |
| Sodium pyruvate solution 100 mM | Sigma | S8636 | |
| L-Ascorbic Acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | Prepare the concentrated solution (25 mM) in distilled water extemporaneously |
| L-Proline | Sigma | P5607 | Prepare the 175 mM stock solution diluted in distilled water and store at 4 °C |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | Prepare the 1 mM stock solution diluted in Ethanol 100% and store at -20 °C |
| TGF-beta 3 protein 10 µg | Interchim | 30R-AT028 | |
| Tri-sodium citrate | VWR | 33615.268 | Prepare the 1 M stock solution diluted in distilled water and store at 4 °C |
| Pullulanase from Bacillus acidopullulyticus | Sigma | P2986 | |
| Dextranase from Chaetomium erraticum | Sigma | D0443 | |
| NucleoSpin RNA Extraction Kit | Macherey-Nagel | 740955.5 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Life Technologies | 18064-014 | |
| Random Primer - Hexamer | Promega | C1181 | 500 µg/mL: Use diluted 1/2 and put 1 µL per sample |
| Recombinant RNAs in ribonuclease inhibitor | Promega | N2511 | 40 U/µL: put 1 µL per sample |
| PCR nucleotide dNTP mix (10 mM each) | Roche | 10842321 | |
| SyBr Green PCR Master Mix | Life Technologies | 4368708 | |
| Step One Plus Real-Time PCR System | Life Technologies | 4381792 | |
| Formalin solution 10% neutral buffered | Sigma | HT5012 | |
| OCT solution | VWR | 361603E | |
| Isopentane | Sigma | M32631 | |
| Toluidine blue O | VWR | 1.15930.0025 | |
| Ethanol absolute | VWR | 20821.310 | |
| Toluene | VWR | 1.08323.1000 | |
| Mounting medium Pertex | Histolab | 840 | |
| RPLP0 Primer for qPCR | Eurogentec | 5'-TGCATCAGTAC CCCATTCTATCAT-3'; 5'-AAGGTGTAATC CGTCTCCACAGA-3' |
|
| Aggrecan Primer for qPCR | Eurogentec | 5'-TCTACCGCTGCGAGGTGAT-3'; 3'-TGTAATGGAACACGATGCCTTT-5' | |
| Collagen II Primer for qPCR | Eurogentec | 5'-ACTGGATTGACCCCAACCAA-3'; 3'-TCCATGTTGCAGAAAACCTTCA-5' |
References
- Naumova, A. V., Modo, M., Moore, A., Murry, C. E., Frank, J. A.
- Edmundson, M., Thanh, N. T., Song, B. Nanoparticles based stem cell tracking in regenerative medicine. Theranostics. 3 (8), 573-582 (2013).
- Di Corato, R., et al. High-resolution cellular MRI: gadolinium and iron oxide nanoparticles for in-depth dual-cell imaging of engineered tissue constructs. ACS Nano. 7 (9), 7500-7512 (2013).
- Xu, F., et al. Three-dimensional magnetic assembly of microscale hydrogels. Adv Mater. 23 (37), 4254-4260 (2011).
- Kito, T., et al. iPS cell sheets created by a novel magnetite tissue engineering method for reparative angiogenesis. Sci Rep. 3, 1418 (2013).
- Mironov, V., Kasyanov, V., Markwald, R. R. Nanotechnology in vascular tissue engineering: from nanoscaffolding towards rapid vessel biofabrication. Trends Biotechnol. 26 (6), 338-344 (2008).
- Mattix, B. M., et al. Janus magnetic cellular spheroids for vascular tissue engineering. Biomaterials. 35 (3), 949-960 (2014).
- Henstock, J., El Haj, A. Controlled mechanotransduction in therapeutic MSCs: can remotely controlled magnetic nanoparticles regenerate bones? Regen Med. 10 (4), 377-380 (2015).
- Fayol, D., et al. Use of magnetic forces to promote stem cell aggregation during differentiation, and cartilage tissue modeling. Adv Mater. 25 (18), 2611-2616 (2013).
- Bartlett, W., et al. Autologous chondrocyte implantation versus matrix-induced autologous chondrocyte implantation for osteochondral defects of the knee: a prospective, randomised study. J Bone Joint Surg Br. 87 (5), 640-645 (2005).
- Batty, L., Dance, S., Bajaj, S., Cole, B. J. Autologous chondrocyte implantation: an overview of technique and outcomes. ANZ J Surg. 81, 18-25 (2011).
- Song, L., Baksh, D., Tuan, R. S. Mesenchymal stem cell-based cartilage tissue engineering: cells, scaffold and biology. Cytotherapy. 6 (6), 596-601 (2004).
- Boeuf, S., Richter, W. Chondrogenesis of mesenchymal stem cells: role of tissue source and inducing factors. Stem Cell Res Ther. 1 (4), 31 (2010).
- Kock, L., van Donkelaar, C. C., Ito, K. Tissue engineering of functional articular cartilage: the current status. Cell Tissue Res. 347 (3), 613-627 (2012).
- Schon, B. S., et al. Validation of a high-throughput microtissue fabrication process for 3D assembly of tissue engineered cartilage constructs. Cell Tissue Res. , (2012).
- Robert, D., et al. Magnetic micro-manipulations to probe the local physical properties of porous scaffolds and to confine stem cells. Biomaterials. 31 (7), 1586-1595 (2010).
- Luciani, N., et al. Successful chondrogenesis within scaffolds, using magnetic stem cell confinement and bioreactor maturation. Acta Biomaterialia. 37, 101-110 (2016).
- Wilhelm, C., Gazeau, F. Universal cell labelling with anionic magnetic nanoparticles. Biomaterials. 29 (22), 3161-3174 (2008).
- Fayol, D., Luciani, N., Lartigue, L., Gazeau, F., Wilhelm, C. Managing magnetic nanoparticle aggregation and cellular uptake: a precondition for efficient stem-cell differentiation and MRI tracking. Adv Healthc Mater. 2 (2), 313-325 (2013).
- Wilhelm, C., Gazeau, F., Bacri, J. C. Magnetophoresis and ferromagnetic resonance of magnetically labeled cells. Eur Biophys J. 31 (2), 118-125 (2002).
- Autissier, A., Le Visage, C., Pouzet, C., Chaubet, F., Letourneur, D. Fabrication of porous polysaccharide-based scaffolds using a combined freeze-drying/cross-linking process. Acta Biomater. 6 (9), 3640-3648 (2010).
- Singh, N., Jenkins, G. J. S., Asadi, R., Doak, S. H. Potential toxicity of superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPION). Nano Reviews. 1, (2010).
- Lee, J. H., Hur, W. Scaffold-free formation of a millimeter-scale multicellular spheroid with an internal cavity from magnetically levitated 3T3 cells that ingested iron oxide-containing microspheres. Biotechnol Bioeng. 111 (5), 1038-1047 (2014).
- Mattix, B., et al. Biological magnetic cellular spheroids as building blocks for tissue engineering. Acta Biomaterialia. 10 (2), 623-629 (2014).
- Mazuel, F., et al. Massive Intracellular Biodegradation of Iron Oxide Nanoparticles Evidenced Magnetically at Single-Endosome and Tissue Levels. ACS Nano. 10 (8), 7627-7638 (2016).
- Kim, J. A., et al. High-throughput generation of spheroids using magnetic nanoparticles for three-dimensional cell culture. Biomaterials. 34 (34), 8555-8563 (2013).
- Shimizu, K., Ito, A., Honda, H. Enhanced cell-seeding into 3D porous scaffolds by use of magnetite nanoparticles. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 77 (2), 265-272 (2006).
- Sensenig, R., Sapir, Y., MacDonald, C., Cohen, S., Polyak, B. Magnetic nanoparticle-based approaches to locally target therapy and enhance tissue regeneration in vivo. Nanomedicine (Lond). 7 (9), 1425-1442 (2012).
- Waldman, S. D., Couto, D. C., Grynpas, M. D., Pilliar, R. M., Kandel, R. A. Multi-axial mechanical stimulation of tissue engineered cartilage: review. Eur Cell Mater. 13, 66-74 (2007).
- Takahashi, I., et al. Compressive force promotes sox9, type II collagen and aggrecan and inhibits IL-1beta expression resulting in chondrogenesis in mouse embryonic limb bud mesenchymal cells. J Cell Sci. 111 (14), 2067-2076 (1998).
- Campbell, J. J., Lee, D. A., Bader, D. L. Dynamic compressive strain influences chondrogenic gene expression in human mesenchymal stem cells. Biorheology. 43, 455-470 (2006).
- Vunjak-Novakovic, G., et al. Bioreactor cultivation conditions modulate the composition and mechanical properties of tissue-engineered cartilage. J Orthop Res. 17 (1), 130-138 (1999).
