Summary
Condrogênese a partir de células-tronco requer ajuste fino as condições de cultura. Aqui, apresentamos uma abordagem magnética para células de condensação, um passo essencial para iniciar chondrogenesis. Além disso, mostramos que a maturação dinâmico num biorreactor aplica estimulação mecânica para as construes celulares e aumenta a produção de matriz extracelular cartilaginosa.
Abstract
Engenharia cartilagem permanece um desafio devido às dificuldades de criação de um implante funcional in vitro semelhante ao tecido nativo. Uma abordagem recentemente explorada para o desenvolvimento de substitutos autólogos envolve a diferenciação de células estaminais em condrócitos. Para iniciar este condrogénese, um grau de compactação das células estaminais é necessário; Assim, foi demonstrada a viabilidade de células magneticamente de condensação, tanto dentro de andaimes espessas e livres de andaime, utilizando as fontes de campo magnico em miniatura como atractores de células. Esta abordagem também magnética foi usada para guiar fusão agregado e para construir livre de andaime, organizada, tridimensional (3D) tecidos vários milímetros de tamanho. Além de ter um tamanho aumentado, o tecido formado pela fusão magnética-driven apresentou um aumento significativo na expressão de colagénio II, e observou-se uma tendência similar para a express de agrecano. Como a cartilagem nativa foi submetido a forças tchapéu influenciado sua estrutura 3D, a maturação dinâmica também foi realizada. Um bio-reactor que fornece estímulos mecânicos foi utilizado para a cultura dos andaimes magneticamente semeadas ao longo de um período de 21 dias. Biorreactor maturação largamente melhorada condrogénese nos andaimes celularizados; a matriz extracelular obtida sob estas condições era rico em colagénio II e agrecan. Este trabalho descreve o potencial inovador de condensação magnética de células estaminais marcados e maturação dinâmico num biorreactor para uma melhor diferenciação condrogénica, ambas isentas de andaime e dentro de suportes de polissacáridos.
Introduction
nanopartículas magnéticas já são utilizados na clínica como agentes de contraste para ressonância magnética (MRI), e suas aplicações terapêuticas continuar expandindo. Por exemplo, recentemente, tem sido mostrado que as células marcadas podem ser manipuladas in vivo, utilizando um campo magnético externo e podem ser dirigidas e / ou mantido a um sítio definido de implante 1, 2, 3. Na medicina regenerativa, eles podem ser utilizados para manipular tecidos organizados in vitro 4, incluindo tecido vascular 5, 6, 7, 8, osso, cartilagem e 9.
A cartilagem articular é imersa num ambiente avascular, fazer reparações dos componentes da matriz extracelular muito limitada quando ocorrerem danos. Por esta razão, research está atualmente focada na engenharia de substituições de cartilagem hialina que podem ser implantados no local do defeito. A fim de produzir um substituto autólogo, alguns grupos de pesquisa estão explorando o uso de condrócitos autólogos como fonte de células 10, 11, enquanto outros enfatizam a capacidade das células-tronco mesenquimais (MSC) para se diferenciar em condrócitos 12, 13. Em estudos anteriores retomados aqui, foram selecionados MSC, como sua amostragem de medula óssea é bastante simples e não requer o sacrifício de condrócitos saudáveis, que correm o risco de perder o seu fenótipo 14.
Um passo inicial essencial para iniciar a diferenciao condrogica de células estaminais é a sua condensação. Agregados celulares são normalmente formados usando centrifugação ou cultura de micromassa 15; no entanto, estes métodos de condensação neither apresentam o potencial de criar agrupamentos de células dentro de andaimes espessas nem o potencial para controlar a fusão de agregados. Neste artigo, descrevemos uma abordagem inovadora para condensar as células-tronco usando rotulagem magnético MSC e atração magnética. Esta técnica tem sido provada para formar construções de 3D livre de andaime através da fusão de agregados um com o outro para se obter um tecido cartilaginoso-escala milimétrica 9. semeadura magnético de andaimes de espessura e grandes também permitiu a possibilidade de aumentar o tamanho da engenharia de tecidos, desenhando uma forma mais facilmente útil para a implantação, e diversificar o potencial para aplicações clínicas de reparação da cartilagem. Aqui, nós detalhe do protocolo para a semeadura magnético de MSC em matrizes porosas compostas de polissacáridos naturais, pululano e dextrano, andaimes anteriormente utilizado para confinar células estaminais 16, 17. diferenciao condrogica foi finally realizada num biorreactor para garantir contínua de nutrientes e de difusão de gás para o núcleo da matriz dos andaimes semeados com uma alta densidade de células. Além de fornecer nutrientes, factores de crescimento condrogénicas, e gás às células, o biorreactor oferecido estimulação mecânica. Em geral, a tecnologia magnético utilizado para confinar células estaminais, combinada com a maturação dinâmico num biorreactor, podem melhorar acentuadamente a diferenciação condrogénica.
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Protocol
1. Construção dos dispositivos magnéticos
NOTA: Os dispositivos usados para a sementeira de células variam dependendo da aplicação (Figura 1). Para formar agregados, o número de células é limitado a 2,5 x 10 5 / agregado, de modo que as pontas magnéticos devem ser muito fina (750 um de diâmetro). Para semear as andaimes 1,8 centímetros 2/7 mm de espessura, os ímans devem ser maiores (3 mm de diâmetro) e vai garantir a migração de células através dos poros do andaime.
- Construção de um dispositivo com micro-imans para a formao de agregados (Figura 1A)
- Fazer micro-furos com uma broca de 0,8 mm através de placas de alumínio (3 cm de diâmetro e 6 mm de espessura).
- Inserir uma ponta magnética (750 um de diâmetro) em cada orifício da placa.
- Coloque este disco durante um ímã de neodímio permanente, o que garante a magnetização de saturação.
- Construção de um dispositivo para a semeadura andaime (
- Cortar poliestireno disco em 2,4 cm 2 quadrados.
- Inserir pequenos ímans 9 (3 mm de diâmetro, 6 mm long) a uma distância igual ao longo de uma área de superfície de 1,6 cm2.
- Coloque este dispositivo sobre um ímã de neodímio permanente.
2. Stem Rotulagem celular
NOTA: As células estaminais foram marcadas com 0,1 mM de nanopartículas magnéticas durante 30 min (de ferro 2,6 ± 0,2 pg / célula) para formar agregados, enquanto que foram marcadas com 0,2 mM nanopartículas magnéticas durante 30 min (5 ± 0,4 pg de ferro / célula) para semear andaimes. Estas concentrações de nanopartículas e tempos de incubação foram usadas anteriormente e publicado por MSC e outras células 18, 19, e determinou-se que as nanopartículas impactado nem a viabilidade celular, nem capacidade de diferenciação MSC. A massa de ferro incorporado pelas células estaminais foi medida através de um único cell magnetoforese 19, 20.
- Culturas de células humanas estaminais mesenquimais (MSC) em meio de crescimento de células estaminais mesenquimais completo (MSCGM) a 37 ° C e 5% de CO 2 até próximo da confluência (~ 90%).
- Preparar a solução de marcação magnética, misturando mM maghemite óxido de ferro revestido de citrato de 0,1 ou 0,2 (γFe 2 O 3; núcleo: 8 nm de diâmetro) em meio 5A de McCoy isento de soro modificado no Roswell Park Memorial Institute (RPMI) sem glutamina e contendo cinco citrato de sódio mM.
- Descartar o meio, lavar as células com meio RPMI isento de soro, sem glutamina, e adicionar 10 ml de solução de nanopartículas de óxido de ferro por frasco de cultura de 150 cm 2, o volume mínimo necessário para cobrir todas as células.
- Incubar durante 30 min a 37 ° C e CO2 a 5% e, em seguida, descartar a solução de nanopartículas. Lavar durante 5 minutos com meio RPMI isento de soro, sem glutamina para internalizar o nanoparticles ainda ligada à membrana plasmática.
- Descartar o meio RPMI e adicionar 25 mL de meio completo MSCGM por frasco. Incubar durante a noite a 37 ° C e 5% de CO 2.
3. semeadura de células Magnetic
- Recentemente preparar a forma condrogénica através de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) alto teor de glucose com L-glutamina por adição de 50 uM de ácido L-ascórbico 2-fosfato, 0,1? M de dexametasona, piruvato de sódio 1 mM, 0,35 mM de L-prolina, 1% de cultura universal suplemento contendo insulina, transferrina humana e ácido selenoso (ITS-Pré-mistura), e 10 ng / mL de factor de crescimento transformante-beta 3 (TGF-β3).
- Separe as células magnéticas utilizando 8 mL de 0,05% de tripsina-EDTA por frasco de cultura de 150 cm 2 e centrifuga-se as células dissociadas a 260 × g durante 5 min. Aspirar o meio e contar as células ressuspensas.
- Coloque uma cultura de células com fundo de vidro de Petri (35 mm) na parte superior de ambos os dispositivos magnéticos.
- para magnetically formar agregados, adicionar 3 ml de meio de condrogénica para a placa de Petri e suavemente depositar o menor volume possível (não mais do que 8 mL) contendo 2,5 x 10 5 culas marcadas por agregado (até 16 agregados pode ser depositado). Deixar a placa de Petri durante 20-30 minutos sem movê-lo, permitindo-lhe formar esferóides, e, em seguida, colocar o dispositivo completo, incluindo a placa de Petri contendo os 16 agregados, na incubadora a 37 ° C e 5% de CO 2.
- agregados de controlo de forma a seguir o mesmo protocolo e substituir o meio completo com meio condrogénica sem TGF-β3.
- Para gerar a construção de agregado 3D, colocar em contacto os agregados 2 no dia 8 de modo a formar 8 dupletos e iniciar a fusão. No dia 11, mesclar 2 dobletes para formar 4 quadrigêmeos. Finalmente, fundir as 4 quádruplos no dia 15 para se obter a estrutura final.
- Ao mesmo tempo, formar agregados por centrifugação de 2,5 x 10 5 marcado com células estaminais a 26015; g durante 5 min em 15 ml de tubos com 1,5 mL de meio de condrogénica com ou sem TGF-β3 (por amostra e de controlo, respectivamente).
- Para magneticamente andaimes de sementes, colocar cada andaime seco em uma placa de Petri. Use de polissacáridos matrizes porosas feitas de pululano / dextrano 21. Para cada andaime, dilui-se 2 x 10 6 culas estaminais marcadas em 350 uL de meio de condrogénica sem TGF-β3 e cuidadosamente pipetar as células sobre o andaime.
- Incubar durante 5 min a 37 ° C para permitir a penetração de células total dentro do andaime e, em seguida, cuidadosamente adicionar 3 mL de meio condrogénica com ou sem TGF-β3 (por amostra ou de controlo, respectivamente) para a placa de Petri.
- Incubar o andaime celularizado no seu dispositivo magnético a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 4 dias para permitir a migração de células através dos poros de andaime e confinamento.
- Ao mesmo tempo, semear andaimes com 2 x 10 6
4. Diferenciação em condrócitos
NOTA: Após 4 dias de incubação, remove os ímans e continuar a maturação condrogénica, quer numa placa de Petri (condições estáticas) ou num biorreactor (condições dinâmicas). amostras de controlo negativo são envelhecidos em condições estáticas com meio condrogénica sem TGF-β3.
- Em condições estáticas, manter os andaimes celularizados ou agregados na mesma placa de Petri. Mudar o meio condrogênica duas vezes por semana durante 21 dias.
- Em condições dinâmicas, preparar o biorreator.
- Cortar tubagem de silicone com o comprimento adequado de acordo com o protocolo do fabricante.
- Autoclave todos os materiais: da câmara de 500 mL de cultura, de tubos, de rotadores de 2 vias, e gaiolas.
- Colocar as peças de biorreactor em um MicroBio estérilestação de segurança lógica. Ligar a tubagem para as duas vias rotadores e para a câmara de cultura de acordo com as instruções do fabricante.
- transferir cuidadosamente os andaimes celularizados em gaiolas esterilizados utilizando uma espátula esterilizada. Coloque 2 andaimes por gaiola. Quando as gaiolas estão prontos, inseri-los nas agulhas da tampa para mantê-los de se mover durante a rotação adicional. Encher a câmara de cultura com meio condrogénica e fechá-lo com a tampa contendo as gaiolas.
- Ligar a bomba peristáltica para encher o tubo com o meio condrogénica e para eliminar as bolhas de ar.
- Coloque e prenda a câmara cheia no motor do biorreator e ligar o computador, que controla as rotações tanto do braço e da câmara.
- Aplicar uma velocidade de rotação de 5 rotações por minuto (rpm) em ambos o braço e a câmara. Ajustar a bomba peristáltica a um caudal de 10 rpm para uma alimentação contínua dos andaimes celularizados.
NOTA: Antes da extracção de RNA, digerir os andaimes com uma solução enzimática.
- Prepare 1 ml de solução enzimática pela adição de 100 uL de pululanase (40 U / mL) e 50 uL de dextranase (60 mg / mL) a 850 mL de meio DMEM isento de soro.
- Lavar os andaimes duas vezes com meio DMEM isento de soro, descartar o meio e adicionar 800 uL da solução enzimática por andaime. Incubar durante 15-30 min a 37 ° C sob agitação suave.
- Quando o andaime esteja completamente dissolvido, transferir a solução contendo as células para um tubo de 1,5 mL, centrifugar a 300 x g durante 10 min, aspirar cuidadosamente o meio, lavar duas vezes com estéril 1 × solução salina tamponada com fosfato (PBS), centrifugar a 300 × g durante 10 min, e re-suspender as células na solução de isolamento de ARN.
- Para extrair o ARN a partir de agregados, colocar os esferóides na solução de isolamento de ARN ecompletamente esmagar-los utilizando um homogeneizador antes de realizar a extraco de ARN.
- Isola-se o ARN utilizando um kit de extracção de ARN total de acordo com as instruções do fabricante.
- Sintetizar ADN complementar a partir de 400 ng de ARN total utilizando a transcriptase inversa de acordo com as instruções do fabricante, utilizando 250 ng de iniciadores aleatórios, 1 uL de mistura de dNTP (10 mM cada), e 40 U / ml de RNase inibidor; o volume final da reacção é de 20 pL. No final da reacção, adicionar 80 mL de água destilada para obter um volume final de 100 uL.
- Para quantitativa da reacção em cadeia da polimerase (PCR), utilizar uma mistura de PCR contendo um reagente fluorescente para quantificar a expressão relativa de genes de interesse, tais como agrecano (AGC) e colagénio II (Col II), com 10 × de cDNA diluído. Normalizar os níveis de expressão do gene com a proteína ribossómica do gene de referência, Grande, P0 (RPLP0). Executar os cálculos com o 2 - fórmula ΔΔCT, Onde ΔΔCT =? Ct de condição diferenciada - significa? Ct de condição de controlo, e cada um de? Ct representa a CT do gene de interesse - a CT do gene de referência (RPLP0).
- Determinar medidas estatísticas como os valores médios ± o erro padrão da média (SEM). Realizar a análise com n ≥ 2 experimentos independentes. Utilização do teste t de Student para analisar as diferenças estatísticas entre os peletes centrifugadas e fuss magnéticos (* p <0,05). Determinar o significado com um teste de Kruskal-Wallis (ANOVA de uma via não paramétrico) para analisar as diferenças estatísticas entre os suportes diferenciados e com o andaime de controlo (* p <0,05).
6. Análise histológica
- Lavar os andaimes celularizados ou agregados com estéril 1 x PBS, corrigi-los em solução de formalina a 10% durante 1 h à temperatura ambiente, e lavar com 1 x PBS.
- Remover o PBS, incorporar as amostras em cuttin óptimag composto de temperatura (OCT), e congelá-los num banho de isopentano imerso em azoto líquido. Armazenar a amostra a -20 ° C. Corte as amostras com um criostato para obter criocortes 8-M para os agregados ou de 12 mm para os andaimes celularizados.
- Manchar os criocortes com solução de azul de toluidina a 0,5% durante 2 minutos, enxaguar com água da torneira, desidratar com 100% de etanol, clarificar usando tolueno, e montar as lâminas com um meio de montagem para a microscopia de luz.
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Representative Results
Em primeiro lugar, os agregados podem ser formados individualmente usando micro-imans através do depósito de 2,5 x 10 5 culas estaminais marcados (Figura 2A). Estes agregados individuais (~ 0,8 mm de tamanho) pode, então, ser fundidos em estruturas maiores, graças à fusão sequencial, induzida magneticamente. Por exemplo, no dia oito de maturação condrogénica, os agregados foram colocados em contacto aos pares para formar dupletos; quádruplos foram montados no dia 11 através da fusão de 2 dupletos; e, finalmente, em 15 dias, os 4 quádruplos foram fundidas para formar uma construção de 3D contendo 16 dos agregados formados inicialmente, com um total de 4 x 10 6 culas (~ 4 mm de tamanho) (Figura 2B). Em segundo lugar, a mesma técnica de atracção magnética tem sido utilizada para formar agregados de células dentro de andaimes. Andaimes foram semeadas sobre o dispositivo magnético e mostrou células densamente condensado no interior dos poros do andaime, em locais exactos micro-íman (Figura 2C). Em contraste, quando as células foram semeadas dentro de uma estrutura de suporte, sem atracção magnética (sementeira passiva), eles foram encontrados para ser distribuído uniformemente. Andaimes celularizados foram então inseridos em gaiolas (Figura 3A) ligados à câmara de biorreactor para realizar o processo sob condições de maturação condrogénica dinâmicas (Figura 3B). Tal biorreactor melhora as trocas de nutrientes e de gás e fornece estimulação mecânica através de transdução. A velocidade de rotação de ambos o braço e a câmara foi ajustado para 5 rpm, tal como recomendado pelo construtor para a regeneração do tecido macio 3D. Uma bomba peristáltica que fornece um suprimento contínuo de meio foi fixada em 10 rpm.
Para todas as condições de organização celular (agregados fundidos e sementeira dentro de andaimes) e maturação do tecido (dentro ou fora de um bio-reactor), a expressão do gene foi analisada no dia 25. O tecido formado por fusão magnética mostraram uma signiaumento ficant na expressão de colagénio II em comparação com o sedimento obtido por centrifugação (Figura 4A), em conjunto com um aumento da tendência de expressão agrecano. Para andaimes celularizados, obteve-se um aumento em agrecano e colagénio II-II, quando foi utilizado semeadura magnético expressão significativa de colagénio, em comparação com os andaimes semeados sem forças magnéticas. Além disso, a expressão de ambos os genes foi muito maior (importante para Col II) quando semeadura magnética foi combinado com diferenciação dinâmico (Figura 4B).
As análises histológicas também foram realizadas, por exemplo, utilizando uma mancha azul de toluidina para revelar os glicosaminoglicanos (GAG). A fusão magnético sequencial de 16 agregados exibiu abundantes deposição de GAG, como evidenciado pela cor azul-púrpura (Figura 5A). Para os andaimes, apenas aqueles magneticamente semeadas foram coradas com azul de toluidina. conten GAGt foi maior quando os andaimes foram diferenciadas num bioreactor (Figura 5B) em vez de estaticamente (Figura 5C). Tomados em conjunto, estes resultados demonstram o potencial de agregação magnética e semeadura magnético dentro andaimes para melhorar chondrogenesis. Ele também indica que as condições de maturação dinâmicas dentro do biorreactor são muito mais favoráveis para a diferenciação eficiente.
Figura 1. Construo dos dispositivos magnéticos. (A) Exemplo de um dispositivo magnético para a formação de agregados: a placa de alumínio foi perfurado (0,8 buracos? M de diâmetro) e dicas foram inseridos em cada orifício e, em seguida, colocado sobre um íman de neodímio permanente, o que assegurou a magnetização de saturação. (B) dispositivo magnético para semear o andaime: poliestireno disco (24 mm2) com 9 buracos feitos manualmente eracolocado em um ímã de neodímio permanente, o que garantiu a magnetização de saturação. Pequenos ímans (3 mm de diâmetro) foram, em seguida, inserida em cada furo para formar o dispositivo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. marcação magnética de células-tronco e a sementeira. (A) As células-tronco foram marcadas com nanopartículas de óxido de ferro durante 30 min a 37 ° C. (B) Os esferóides foram formados a partir de células marcadas atraídos por uma rede de 16 micro-imans. Os agregados foram fundidos em quádruplos no dia 11 por meio da fusão dos dupletos formadas 3 dias antes. Os quádruplos foram então fundidos no dia 15 para a construção da engenharia de tecidos final. (C) Um andaime, colocada em um prato de vidro de fundo, foi semeada com ou comforças magnéticas para fora. No dia 4, os pontos de células estaminais compactadas foram observados no andaime magneticamente semeado, enquanto as células apareceu uniformemente distribuído no andaime semeadas sem um íman. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. maturação dinâmico de andaimes celularizados. (A) após a sementeira magnético ou passiva, andaimes celularizados foram colocados em gaiolas de evitar a ruptura. (B) as gaiolas fixas, utilizando as agulhas da tampa, foram colocados dentro do vaso do bioreactor preenchido com meio condrogénica. O bioreactor aplicada rotação biaxial com uma velocidade controlada de forma independente (1-12 rpm e 1-35 rpm para o braço e a câmara, respectivamente). Uma bomba peristáltica fornecida continuamente medium. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Expressão de genes específicos condrogênicos no dia 25. (A) A fusão induzida magneticamente de esferóides MSC demonstraram um aumento significativo em colagénio II em comparação com o sedimento formado por centrifugação. * Indica uma diferença estatística utilizando o teste t de Student (p <0,05). (B) A expressão de agrecano e colagénio II foram claramente aumentada em andaimes diferenciadas com uma combinação de semeadura magnético e maturação dinâmico num biorreactor. a expressão do gene foi normalizado para ARNm RPLP0 e expressa em unidades arbitrárias em relação ao controlo (~ 1 ± SEM). Os resultados são apresentados como médias ± SEM de duas a quatro experiências independentes. * denoTES uma diferença estatística usando o teste de Kruskal-Wallis (unidirecional teste não paramétrico ANOVA) (valor de p <0,05). (-): semeadura sem ímã; (+): Semear com forças magnéticas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. histológica coloração de glicosaminoglicanos no dia 25. Os glicosaminoglicanos (GAG) depósitos são evidenciados por coloração azul-púrpura. (A) Uma mancha azul de toluidina positiva foi observada nos criocortes 8 mícrons da estrutura cartilaginosa final obtido a partir da fusão sequencial de 16 agregados. Os criocortes de 12 ^ m de andaimes semeados após magneticamente estático (B) ou as condições dinâmicas (C) mostrou claramenteque o conteúdo GAG foi maior nos andaimes diferenciados em um biorreator. As setas indicam agregados de células diferenciadas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Primeiro, porque as técnicas aqui apresentadas dependem da internalização de nanopartículas magnéticas, uma questão importante é o resultado das nanopartículas, uma vez que localizar dentro das células. É verdade que as nanopartículas de ferro pode provocar potencial toxicidade ou a capacidade de diferenciação prejudicada dependendo do seu tamanho, de revestimento, e tempo de exposição de 19, 22. No entanto, vários estudos têm demonstrado nenhum impacto sobre a fisiologia celular quando nanopartículas de ferro encapsulados foram usadas 23 sob a forma de magnetoferritin, uma nanopartícula magnética biológico 24, ou foram usadas com um revestimento de citrato simples e concentrações adequadas 18. Além disso, quando as nanopartículas de óxido de ferro foram usadas em condições semelhantes às descritas no presente documento (com MSC e para condrogénese), demonstramos recentemente que uma degradação rápida e quase total da nanopartiCiclos ocorre dentro dos endossomas em cerca de 10 dias após a incorporação celular e a formação de esferóides MSC. Curiosamente, esta degradação massiva foi associada com o armazenamento eficiente do ferro livre no interior da proteína ferritina e resultou em um impacto muito limitado sobre o metabolismo do ferro celular, bem boding para futuras aplicações clínicas 25.
Outro ponto crítico é a exigência de compactação celular para iniciar chondrogenesis. Normalmente, a condensação de células é conseguida por meio de centrifugação; no entanto, este método é limitado por um baixo número de células (não mais do que 2,5 x 10 5 culas). Passado este número, os nutrientes e gás não pode difundir para o centro dos agregados, provocando necrose celular. Aqui, a condensação magnética de células estaminais marcadas em agregados aparece como um método significativo para formar 3D constrói para a regeneração do tecido da cartilagem. Tal procedimento magnética tem sido utilizada por outros autores paraconstruir esferóides 3D: por levitação magnética com um íman colocado no topo da placa após a dissociação de células de 23 ou com dentes de ferro para localizar o campo magnético 26. No entanto, levitação magnética não parece ser adequado para as fases posteriores de fusão agregado. Por contraste, com o método proposto aqui magnético, que pode controlar todas as etapas de fus para se obter uma construção de tecido de cartilagem passo-a-passo. Em resumo, este processo de vários passos começa com confinamento de células estaminais em blocos de construção de agregação e é seguida pela fusão destes blocos para uma estrutura maior. Os passos críticos do presente procedimento de agregação de células-tronco isento de andaime são as seguintes: em primeiro lugar, deve-se formar cada agregado com um volume tão pequeno de células quanto possível e em segundo lugar, deve-se controlar as etapas de fusão, para evitar a formação de uma única, grande agregar. O tecido obtido aqui era rico em colagénio II e agrecan. Ele também apresentou o advantages de ter geometria e tamanho flexível e de estar livre de andaime.
A abordagem magnético também foi utilizado para orientar células estaminais dentro de andaimes de espessura e grandes; Outra alternativa para o projeto de várias formas e tamanhos. O passo crítico aqui é para semear os andaimes com um volume adequado de células: nem muito pouco para ter uma distribuição homogênea total de células, nem muito para evitar qualquer perda de células. Forças magnéticas foram previamente utilizados para atrair e reter células dentro de andaimes e para melhorar semeadura de células 27, 28. Aqui, a condensação de células suficientes dentro dos poros dos andaimes polissacarídeos levou a chondrogenesis bem sucedido. A produção de matriz extracelular foi marcadamente melhorado quando os suportes magneticamente celularizados foram submetidas aos estímulos de stress / cisalhamento de transdução fornecidas pelo bioreactor, graças à sua rotação bi-axial. Tem sido demonstrado em outros estudos que Mulcondições de carga ti-axial melhorado a qualidade de tecidos formados a partir de condrócitos 29. Este conceito biorreator romance apresenta um ganho real quando comparado com as técnicas existentes, onde apenas as forças de compressão são aplicadas 30, 31, 32.
Em conclusão, para a diferenciação condrogénica, o uso de confinamento magnético de células estaminais marcados para formar e manipular agregados, bem como para semear andaimes permitidos para a criação de construes celulares milímetros de tamanho de cartilagem. Além disso, combinando semeadura de células magnético com diferenciação dinâmica fornece uma nova ferramenta valiosa para aplicações de medicina regenerativa.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer QuinXell Technologies e CellD, particularmente Lothar Grannemann e Dominique Ghozlan por sua ajuda com o biorreator. Agradecemos Catherine Le Visage, que forneceu-nos com pululano / andaimes polissacarídeos dextrano. Este trabalho foi apoiado pela União Europeia (projecto ERC-2014-CG Matisse 648.779) e pela AgenceNationalede la Recherche (ANR), França (projeto MagStem ANR-11 SVSE5).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Iron oxide (maghemite) nanoparticules (γ-Fe2O3) | PHENIX - University Paris 6 | Made and given by C. Ménager | Mean diameter of 8.1 nm and negative surface charge |
| Polysaccharide Pullulan/Dextran scaffolds | LIOAD - University Nantes | Made and given by C. Le Visage | Prepared from a 75:25 mixture of pullulan/dextran in alkaline conditions (10 M NaOH). Porosity: 185-205 µm; Thickness: 7 mm; Surface area: 1.8 cm2. |
| TisXell Regeneration System | QuinXell Technologies | QX900-002 | Biaxial bioreactor with 500 mL culture chamber |
| Cage for scaffolds: Histosette II M492 | VWR | 720-0909 | |
| Mesenchymal Stem Cell (MSC) | Lonza | PT-2501 | Three independant batches have been used |
| MSCGM BulletKit medium | Lonza | PT-3001 | For the complete medium, add the provided BulletKit (containing serum, glutamine and antibiotics) to the MSCGM medium |
| DMEM with Glutamax I | Life Technologies | 31966-021 | No sodium pyruvate, no HEPES |
| RPMI medium 1640, no Glutamine | Life Technologies | 31870-025 | No sodium pyruvate, no HEPES |
| PBS w/o CaCl2 w/o MgCl2 | Life Technologies | 14190-094 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 25300-054 | |
| Penicillin (10,000 U/mL) / Streptomycin (10,000 µg/mL) | Life Technologies | 15140-122 | |
| ITS Premix Universal Culture Supplement (20x) | Corning | 354352 | |
| Sodium pyruvate solution 100 mM | Sigma | S8636 | |
| L-Ascorbic Acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | Prepare the concentrated solution (25 mM) in distilled water extemporaneously |
| L-Proline | Sigma | P5607 | Prepare the 175 mM stock solution diluted in distilled water and store at 4 °C |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | Prepare the 1 mM stock solution diluted in Ethanol 100% and store at -20 °C |
| TGF-beta 3 protein 10 µg | Interchim | 30R-AT028 | |
| Tri-sodium citrate | VWR | 33615.268 | Prepare the 1 M stock solution diluted in distilled water and store at 4 °C |
| Pullulanase from Bacillus acidopullulyticus | Sigma | P2986 | |
| Dextranase from Chaetomium erraticum | Sigma | D0443 | |
| NucleoSpin RNA Extraction Kit | Macherey-Nagel | 740955.5 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Life Technologies | 18064-014 | |
| Random Primer - Hexamer | Promega | C1181 | 500 µg/mL: Use diluted 1/2 and put 1 µL per sample |
| Recombinant RNAs in ribonuclease inhibitor | Promega | N2511 | 40 U/µL: put 1 µL per sample |
| PCR nucleotide dNTP mix (10 mM each) | Roche | 10842321 | |
| SyBr Green PCR Master Mix | Life Technologies | 4368708 | |
| Step One Plus Real-Time PCR System | Life Technologies | 4381792 | |
| Formalin solution 10% neutral buffered | Sigma | HT5012 | |
| OCT solution | VWR | 361603E | |
| Isopentane | Sigma | M32631 | |
| Toluidine blue O | VWR | 1.15930.0025 | |
| Ethanol absolute | VWR | 20821.310 | |
| Toluene | VWR | 1.08323.1000 | |
| Mounting medium Pertex | Histolab | 840 | |
| RPLP0 Primer for qPCR | Eurogentec | 5'-TGCATCAGTAC CCCATTCTATCAT-3'; 5'-AAGGTGTAATC CGTCTCCACAGA-3' |
|
| Aggrecan Primer for qPCR | Eurogentec | 5'-TCTACCGCTGCGAGGTGAT-3'; 3'-TGTAATGGAACACGATGCCTTT-5' | |
| Collagen II Primer for qPCR | Eurogentec | 5'-ACTGGATTGACCCCAACCAA-3'; 3'-TCCATGTTGCAGAAAACCTTCA-5' |
References
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