Summary
Chondrogenese aus Stammzellen erfordert Feinabstimmung der Kulturbedingungen. Hier präsentieren wir einen magnetischen Ansatz für Zellen Kondensation, ein wesentlicher Schritt Chondrogenese zu initiieren. Darüber hinaus zeigen wir, dass dynamische Reifung in einem Bioreaktor mechanische Stimulation auf die Zellkonstrukte und verbessert knorpelige extrazelluläre Matrixproduktion gilt.
Abstract
Cartilage Engineering bleibt eine Herausforderung aufgrund der Schwierigkeiten in einer in - vitro - Funktions Implantat ähnlich dem nativen Gewebe zu schaffen. Ein Ansatz vor kurzem für die Entwicklung von autologem Ersatz erforscht beinhaltet die Differenzierung von Stammzellen in Chondrozyten. Zur Einleitung dieses Chondrogenese, einen Verdichtungsgrad der Stammzellen erforderlich ist; Somit haben wir gezeigt, die Machbarkeit der magnetisch Kondensieren Zellen sowohl innerhalb dicken Gerüste und Gerüstfrei, unter Verwendung von miniaturisierten Magnetfeldquellen als Zell Attraktoren. Dieser magnetische Ansatz wurde auch zur Führung Aggregat Fusion verwendet und gerüstfrei organisiert, dreidimensionale (3D) Gewebe mehr Millimeter groß zu bauen. Zusätzlich zur Bereitstellung einer verbesserten Größe aufweist, wobei die durch magnetische angetriebene fusion gebildete Gewebe stellte eine signifikante Zunahme der Expression von Kollagen II, und ein ähnlicher Trend wurde für Aggrecan Expression beobachtet. Da die nativen Knorpel wurde Kräfte t ausgesetztHut seine 3D-Struktur, dynamische Reifung beeinflusst wurde ebenfalls durchgeführt. Ein Bioreaktor, die mechanischen Reiz liefert wurde, um die magnetisch ausgesät Gerüste über einen Zeitraum von 21 Tagen zur Kultur verwendet. Bioreactor Reifung weitgehend Chondrogenese in die cellularized Gerüste verbessert; die extrazelluläre Matrix unter diesen Bedingungen erhalten wurde, war reich an Kollagen II und Aggrecan. Diese Arbeit beschreibt das innovative Potential der magnetischen Kondensation von markierten Stammzellen und dynamischer Reifung in einem Bioreaktor für eine verbesserte chondrogene Differenzierung, beide Gerüstfrei und innerhalb Polysaccharid Gerüste.
Introduction
Magnetische Nanopartikel ist bereits in der Klinik als Kontrastmittel für die Magnetresonanztomographie (MRI) verwendet wird, und die therapeutischen Anwendungen weiter wachsen. Zum Beispiel hat es vor kurzem , dass markierte Zellen in vivo unter Verwendung eines externen Magnetfeld manipuliert werden können , gezeigt worden und können an einer definierten Stelle der Implantation 1, 2, 3 gerichtet und / oder aufrechterhalten werden. In der regenerativen Medizin, können sie organisierte Gewebe in vitro 4, einschließlich Gefäßgewebe 5, 6, 7, 8 Knochen, Knorpeln und 9 zu konstruieren , werden verwendet.
Gelenkknorpel wird in einer avaskuläre Umgebung eingetaucht, Reparaturen der extrazellulären Matrix-Komponenten Herstellung sehr begrenzt, wenn Schäden auftreten. Aus diesem Grund research wird zur Zeit auf dem Engineering von hyalinem Knorpelersatz konzentriert, die an der defekten Stelle implantiert werden können. Um einen autologe Ersatz einige Forschungsgruppen untersuchen die Verwendung von autologem Chondrozyten als Zellquelle 10, 11, zu erzeugen , während andere die Fähigkeit der mesenchymalen Stammzellen (MSC) in 12 betonen Chondrozyten zu differenzieren, 13. In früheren Studien hier rekapituliert, wählten wir MSC, als ihr Knochenmark Probenahme ist ziemlich einfach und erfordert nicht das Opfer von gesunden Chondrozyten, die ihren Phänotyp 14 verlieren riskieren.
Ein früher Schritt wesentlich für die chondrogene Differenzierung von Stammzellen Einleitung ist ihre Kondensation. Zellaggregate werden unter Verwendung entweder Zentrifugation oder Mikromassenkultur 15 allgemein gebildet; jedoch neithe diese Kondensationsverfahrenr stellen die potentiellen Zellcluster innerhalb dicken Gerüste noch das Potential zu schaffen, die Fusion von Aggregaten zu steuern. unter Verwendung von MSC magnetische Markierung und magnetische Anziehung In diesem Papier beschreiben wir einen innovativen Ansatz Stammzellen zu kondensieren. Diese Technik hat sich bewährt miteinander zu erhalten , die eine Millimeterskala knorpeligen Gewebe 9 gerüstfreie 3D - Konstrukte über die Fusion von Aggregaten zu bilden. Magnetische Aussaat von dicken und großen Gerüsten hat auch die Möglichkeit der Erhöhung die Größe des erzeugten Gewebes erlaubt, eine Form leichter nützlich für die Implantation der Gestaltung und das Potenzial für die klinische Anwendung bei der Knorpelreparatur zu diversifizieren. Hier stellen wir detailliert das Protokoll für das magnetische Aussäen von MSC in poröse Gerüste , bestehend aus natürlichen Polysacchariden, Pullulan und Dextran, Gerüste bisher verwendeten Stammzellen beschränken 16, 17. Chondrogene Differenzierung war finally durchgeführt in einem Bioreaktor kontinuierliche Nährstoff- und Gasdiffusion in die Matrixkerne der Gerüste mit einer hohen Dichte von Zellen ausgesät zu gewährleisten. Neben Nährstoffe, chondrogene Wachstumsfaktoren und Gas zu den Zellen bereitstellt, bot der Bioreaktor mechanische Stimulation. Insgesamt ist die magnetische Technologie zu beschränken Stammzellen verwendet, kombiniert mit dynamischer Reifung in einem Bioreaktor, kann deutlich chondrogene Differenzierung verbessern.
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Protocol
1. Aufbau der Magneteinrichtungen
HINWEIS: Die Vorrichtungen zur Zellbesiedelung verwendet , variieren je nach der Anwendung (Abbildung 1). Aggregat zu bilden, wird die Anzahl der Zellen auf 2,5 × 10 5 / Aggregat begrenzt, so dass die magnetischen Spitzen sehr dünn sein muss (750 & mgr; m im Durchmesser). Um das 1,8 cm 2/7 mm dickes Scaffolds Saatgut, müssen die Magnete größer (3 mm im Durchmesser) , und werden die Zellmigration durch die Poren des Gerüsts gewährleisten.
- Aufbau einer Vorrichtung mit Mikromagnete für Aggregatbildung (1A)
- Make Mikrolöcher mit einem 0,8-mm-Bohrer durch Aluminiumbleche (3 cm im Durchmesser und 6 mm dick).
- Legen Sie eine magnetische Spitze (750 & mgr; m im Durchmesser) in jedes Loch der Platte.
- Diese Scheibe über einen Permanentmagnet Neodymium, die Magnetisierung bis zur Sättigung gewährleistet.
- Aufbau einer Vorrichtung für Gerüst Aussaat (
- Schneidet harten Polystyrol in 2,4 cm 2 Quadrate.
- Einsatz 9 kleine Magnete (3 mm im Durchmesser, 6 mm lang) in einem gleichen Abstand über eine Fläche von 1,6 cm 2.
- Dieses Gerät über einen permanenten Neodym-Magneten.
2. Stem Cell Labeling
HINWEIS: Es wurden Stammzellen mit 0,1 mM magnetischen Nanopartikeln für 30 min (2,6 ± 0,2 pg Eisen / Zelle) markierte Aggregate zu bilden, während sie mit 0,2 mM magnetischen Nanopartikeln für 30 min (5 ± 0,4 pg Eisen / Zelle) markiert wurden auf Saatgut Gerüste. Diese Nanopartikel - Konzentrationen und Inkubationszeiten wurden bereits veröffentlicht und für MSC und anderen Zellen 18, 19, verwendet , und es bestimmt wurde , dass Nanopartikel beeinflusst weder die Lebensfähigkeit der Zellen noch MSC Differenzierungsfähigkeit. Die Eisenmasse von den Stammzellen eingebracht wurde mittels Single-ce gemessenll Magnetophorese 19, 20.
- Kultur von humanen mesenchymalen Stammzellen (MSC) in komplettem mesenchymalen Stammzellwachstumsmedium (MSCGM) bei 37 ° C und 5% CO 2 , bis nahe zur Konfluenz (~ 90%).
- Bereiten Sie die magnetische Markierungslösung durch Mischen von 0,1 oder 0,2 mM Maghemit Citrat beschichteten Eisenoxid (γFe 2 O 3; Kern: 8 nm Durchmesser) in serumfreien 5A Medium McCoy modifizierte bei Roswell Park Memorial Institute (RPMI) ohne Glutamin und enthaltend 5 mM Natriumcitrat.
- Entsorgen des Mediums, spülen Sie die Zellen mit serumfreiem RPMI - Medium ohne Glutamin und 10 ml Eisenoxid - Nanopartikel - Lösung pro 150 cm 2 Kulturkolben, dem minimalen Volumen benötigt , um alle Zellen zu bedecken.
- Inkubieren für 30 min bei 37 ° C und 5% CO 2 und dann die Nanopartikel - Lösung verwerfen. Spülen für 5 Minuten mit serumfreiem RPMI-Medium ohne Glutamin nan das internalisierenoparticles noch an die Plasmamembran gebunden.
- Verwerfen Sie den RPMI-Medium und 25 ml komplettes Medium MSCGM pro Kolben. Inkubiere über Nacht bei 37 ° C und 5% CO 2.
3. Magnetische Zell Seeding
- Frisch bereiten das chondrogenen Medium nach Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit hohem Glucose mit L-Glutamin durch Zugabe von 50 & mgr; M L-Ascorbinsäure-2-phosphat, 0,1 & mgr; M Dexamethason, 1 mM Natriumpyruvat, 0,35 mM L-Prolin, 1% universelle Kultur Ergänzung mit Insulin, Transferrin und menschliche Selenige Säure (ITS-Premix) und 10 ng / ml transformierender Wachstumsfaktor-beta 3 (TGF-β3).
- Lösen sie die magnetischen Zellen unter Verwendung von 8 ml 0,05% Trypsin-EDTA pro 150 cm 2 Kulturkolben und zentrifugieren Sie die dissoziierten Zellen bei 260 × g für 5 min. Anzusaugen, das Medium und zähle die resuspendierten Zellen.
- Eine Glasboden-Zellkultur-Petrischale (35 mm) auf der Oberseite der beiden Magnetvorrichtungen.
- Um magnetically Aggregate bilden, 3 ml chondrogenen Medium zu der Petrischale hinzuzufügen und sanft das kleinste Volumen möglich ist (nicht mehr als 8 & mgr; l) , die 2,5 × 10 5 Zellen pro Aggregat markierten Ablagerung (bis zu 16 Aggregaten abgelagert werden kann). Lassen Sie die Petrischale für 20-30 min ohne ihn zu bewegen, so dass es Sphäroide zu bilden, und dann das komplette Gerät, einschließlich der Petrischale mit 16 die Aggregate in den Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2.
- Formsteuer Aggregate nach dem gleichen Protokoll und ersetzen das gesamte Medium mit chondrogenen Medium ohne TGF-β3.
- Um das 3D-Aggregat-Konstrukt zu erzeugen, legen zwei Aggregate in Kontakt am Tag 8-8 Dubletten zu bilden und die Fusion einzuleiten. Am Tag 11, fusionieren 2 Dubletten 4 Vierlinge zu bilden. Schließlich verschmelzen die vier Vierlinge am Tag 15 die endgültige Struktur zu erhalten.
- Zur gleichen Zeit bilden sich Aggregate von 2,5 x 10 5 Zentrifugieren markierten Stammzellen bei 26015; g für 5 min in 15-ml-Röhrchen mit 1,5 ml chondrogenen Medium mit oder ohne TGF-β3 (für die Probe und die Kontrolle, jeweils).
- Magnetisch seed Scaffolds Platzieren jedes getrocknetes Gerüst in eine Petrischale. Verwenden Polysaccharid poröse Gerüste aus Pullulan / Dextran - 21. Für jedes Gerüst, verdünnte 2 × 10 6 markierte Stammzellen in 350 & mgr; l von chondrogenen Medium ohne TGF-β3 und sorgfältig die Zellen auf das Gerüst pipettieren.
- bei 37 ° C für 5 min inkubieren Vollzellpenetration innerhalb des Gerüsts zu ermöglichen, und fügen Sie dann vorsichtig 3 ml chondrogenen Medium mit oder ohne TGF-β3 (für die Probe oder Kontrolle, jeweils), um die Petrischale.
- Inkubiere das cellularized Gerüst an seiner Magnetvorrichtung bei 37 ° C und 5% CO 2 für 4 Tage für Zellmigration durch die Poren und das Gerüstes Confinement zu ermöglichen.
- Zur gleichen Zeit, Samen Gerüste mit 2 x 10 6
4. Differenzierung in Chondrozyten
HINWEIS: Nach 4 Tagen Inkubation entfernen, die Magnete und weiterhin die chondrogene Reifung entweder in einer Petrischale (statische Bedingungen) oder in einem Bioreaktor (dynamische Bedingungen). Negative Kontrollproben werden in statischen Bedingungen mit chondrogenen Medium ohne TGF-β3 gereift.
- In statischen Bedingungen halten die cellularized Gerüste oder Aggregate in der gleichen Petrischale. Ändern Sie den chondrogenen Medium zweimal pro Woche für 21 Tage.
- In dynamischen Bedingungen, bereitet den Bioreaktor.
- Schneiden Silikonschlauch an der entsprechenden Länge entsprechend dem Protokoll des Herstellers.
- Autoklaviert alle Materialien: 500 ml Kulturkammer, Schläuche, 2-Wege-Rotatoren und Käfige.
- Legen Sie die Bioreaktor Teile in einen sterilen microbiologische Sicherheit Station. Schließen Sie den Schlauch an den 2-Wege-Rotatoren und in die Kulturkammer nach den Anweisungen des Herstellers.
- übertragen sorgfältig die cellularized Scaffolds in sterilisierte Käfigen einem sterilen Spatel verwendet wird. Platz 2 Gerüste pro Käfig. Wenn die Käfige bereit sind, legen Sie sie in die Nadeln des Deckels, damit sie nicht während der weiteren Drehung bewegt. Füllen der Kulturkammer mit chondrogenem Medium und schließen, wobei der Deckel die Käfige enthalten.
- Schalten Sie die peristaltische Pumpe den Schlauch mit chondrogenem Medium zu füllen und Luftblasen zu beseitigen.
- Und sichern die gefüllte Kammer in den Motor des Bioreaktors und schalten auf dem Computer, der die Drehungen steuert sowohl des Armes und der Kammer.
- Anwenden einer Rotationsgeschwindigkeit von 5 Umdrehungen pro Minute (rpm), die beide auf dem Arm und der Kammer. Stellen Sie die peristaltische Pumpe bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 10 Umdrehungen pro Minute für die kontinuierliche Zuführung der cellularized Gerüste.
HINWEIS: Vor der RNA-Extraktion, verdaut die Gerüste mit einer enzymatischen Lösung.
- Herstellung von 1 ml Enzymlösung durch Zugabe von 100 & mgr; l von Pullulanase (40 U / ml) und 50 ul Dextranase (60 mg / ml) zu 850 ml serumfreiem DMEM Medium.
- Spülen Sie die Gerüste zweimal mit serumfreiem DMEM-Medium, entsorgen Sie das Medium, und fügen Sie 800 ul der Enzymlösung pro Gerüst. Inkubieren für 15-30 min bei 37 ° C unter leichtem Schütteln.
- Wenn das Gerüst vollständig gelöst ist, werden die Lösung um die Zellen in ein 1,5-ml-Röhrchen, Zentrifuge bei 300 × g für 10 min enthält, sorgfältig das Medium absaugen, spült zweimal mit steriler 1 × Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS), Zentrifuge bei 300 × g für 10 min und erneut suspendieren die Zellen in der RNA-Isolierungslösung.
- Um die RNA aus den Aggregaten zu extrahieren, legen Sie die Sphäroiden in der RNA-Isolationslösung undvollständig zerquetscht sie mit einem Homogenisator RNA-Extraktion vor der Durchführung.
- Isolieren Sie die RNA ein Kit zur Gesamt-RNA-Extraktion unter Verwendung nach den Anweisungen des Herstellers.
- Synthetisieren komplementärer DNA von 400 ng Gesamt-RNA unter Verwendung von reverser Transkriptase gemäß den Anweisungen des Herstellers unter Verwendung von 250 ng-Zufallsprimer, 1 & mgr; l dNTP-Mix (jeweils 10 mM) und 40 U / ml RNase-Inhibitor; Das Endvolumen der Reaktion beträgt 20 & mgr; L. Am Ende der Reaktion, fügen 80 ul destilliertes Wasser, um ein Endvolumen von 100 & mgr; l zu erhalten.
- Für eine quantitative Polymerase-Kettenreaktion (PCR), mit einem PCR-Gemisch ein fluoreszierendes Reagens enthält, um die relative Expression der Gene von Interesse, wie Aggrecan (AGC) und Kollagen II (Col II) quantitativ zu bestimmen, das mit 10 × verdünnt cDNA. Normalisieren des Niveaus der Genexpression mit dem Referenz-Genen ribosomale Protein, Groß, P0 (RPLP0). Führen Sie die Berechnungen mit der 2 - ΔΔCT FormelGegebenen ΔΔCT = ACT von differenzierten Zustand - bedeuten ACT der Kontrollbedingung, und jeder ACT stellt die CT des Gens von Interesse - die CT des Referenzgens (RPLP0).
- Bestimmen, statistische Messungen als Mittelwert, die Standardabweichung des Mittelwerts (SEM) ±. Führen Sie die Analyse mit n ≥ 2 unabhängigen Experimenten. Verwenden Sie T-Test die statistischen Unterschiede zwischen zentrifugierten Pellets und magnetischen Fusionen (* p <0,05) zu analysieren. Bestimmen Sie die Bedeutung mit Kruskal-Wallis-Test (one-way ANOVA nichtparametrischer) statistisch signifikante Unterschiede zwischen differenzierten Gerüsten und mit dem Steuer Gerüst (* p <0,05) zu analysieren.
6. Die histologische Analyse
- Spülen Sie die cellularized Gerüste oder Aggregate mit sterilem 1 × PBS, fixieren sie in 10% Formalin-Lösung für 1 h bei Raumtemperatur und spült mit 1 × PBS.
- Entfernen Sie die PBS, bettet die Proben in optimaler cutting Temperatur Verbindung (OCT), und sie in einem Bad Isopentan in flüssigen Stickstoff getaucht einzufrieren. Lagern Sie die Probe bei -20 ° C. Schneiden Sie die Proben mit einem Kryostat-8 & mgr; m Kryoschnitte für die Aggregate oder 12 & mgr; m für die cellularized Gerüste zu erhalten.
- Verfärbung die Kryoschnitte mit 0,5% Toluidinblau-Lösung für 2 min, Spülen in Leitungswasser, Entwässern mit 100% Ethanol, Toluol klären, und montieren die Objektträger mit einem Befestigungsmittel für die Lichtmikroskopie.
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Representative Results
Erstens können Aggregate gebildet werden , einzeln Mikromagnete unter Verwendung von 2,5 x 10 5 markierten Stammzellen (2A) abzuscheiden. Diese einzelnen Aggregate (~ 0,8 mm groß), kann dann in größeren Strukturen durch sequenzielle, magnetisch induzierte Fusion fusioniert werden. Zum Beispiel am Tag 8 der chondrogenen Reifung wurden Aggregate in Kontakt paarweise angeordnet Dubletts zu bilden; Vierlinge wurden am Tag versammelt 11 von 2 Dubletten vermischt; und schließlich am Tag 15 wurden die 4 quadruplets fusionieren , um ein 3D - Konstrukt zu bilden , 16 des anfänglich gebildeten Aggregats enthält, mit einer Gesamtzahl von 4 × 10 6 Zellen (~ 4 mm in der Größe) (2B). Zweitens hat die gleiche magnetische Anziehung Technik verwendet wurden Zellaggregate innerhalb Gerüste zu bilden. Scaffolds wurde über die Magneteinrichtung ausgesät und zeigte dicht kondensierte Zellen innerhalb der Poren des Gerüstes, um genauer Mikromagneten Stellen (2C). Im Gegensatz dazu, wenn die Zellen in einem Gerüst ohne magnetische Anziehung (passives seeding) ausgesät wurden, wurden sie gefunden, gleichmäßig verteilt werden. Cellularized Gerüste wurden dann in Käfigen (3A) eingefügt an der Bioreaktorkammer die chondrogene Prozess unter dynamischen Reifungsbedingungen (3B) durchzuführen. Solche verbessert ein Bioreaktor Nährstoff- und Gasaustausch und eine mechanische Stimulation durch Transduktion. Die Drehzahl sowohl des Arms und die Kammer wurde auf 5 Umdrehungen pro Minute eingestellt, wie durch den Konstruktor für Soft 3D Geweberegeneration empfohlen. Eine peristaltische Pumpe, die eine kontinuierliche Zufuhr von Medium ermöglicht wurde bei 10 Umdrehungen pro Minute eingestellt.
Für alle Bedingungen der Zellorganisation (verschmolzenen Aggregate und seeding innerhalb Gerüste) und Gewebereifung (innerhalb oder ohne einen Bioreaktor) wurde am Tag analysiert Genexpression 25. Die durch magnetische fusion gebildeten Gewebe zeigten einen significant Anstieg der Expression von Kollagen II im Vergleich zu dem Pellet durch Zentrifugation (4A) erhalten wird, zusammen mit einer erhöhten Tendenz der Aggrecan - Expression. Für cellularized Gerüste, erhielten wir eine Zunahme des Aggrecan und Kollagen-II-Expression signifikant für Kollagen II-wenn magnetischen Seeding verwendet wurde, im Vergleich zu den Gerüsten ohne Magnetkräfte ausgesät. Darüber hinaus war die Expression beider Gene viel höher (signifikant für Col II) , wenn magnetische Impfen mit dynamischer Differenzierung (4B) kombiniert wurden.
Die histologischen Analysen wurden ebenfalls durchgeführt, zum Beispiel einer Toluidinblau-Färbung mit den Glykosaminoglykanen offenbaren (GAG). Die sequenzielle magnetische Fusion von 16 Aggregaten reichlich Ablagerung von GAG zeigte, wie sie in der blau-lila Farbe (5A) zeigte. Für die Gerüste, nur die magnetisch wurden mit Toluidinblau ausgesät gefärbt. GAG content war höher , wenn die Gerüste in einem Bioreaktor (5B) differenziert wurden statt statisch (5C). Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse das Potenzial der magnetischen Aggregation und magnetischer Seeding innerhalb Gerüste Chondrogenese zu verbessern. Es zeigt auch, dass die dynamischen Reifungsbedingungen im Bioreaktor sind viel günstiger für eine effiziente Differenzierung.
Abbildung 1. Konstruktion der magnetischen Vorrichtungen. (A) Beispiel einer Magnetvorrichtung zur Aggregatbildung: die Aluminiumplatte gebohrt wurde (0,8 & mgr; m-Durchmesser - Loch) und Spitzen wurden in jedem Loch eingeführt und dann auf einem permanenten Neodymmagneten gelegt, die Magnetisierung bis zur Sättigung gewährleistet. (B) magnetische Vorrichtung auf Saatgut das Gerüst: Hart Polystyrol (24 mm 2) mit 9 Löchern manuell vorgenommen wurdeauf einem permanenten Neodymmagneten gelegt, die Magnetisierung bis zur Sättigung gewährleistet. Kleine Magnete (3 mm Durchmesser) wurde dann in jedes Loch eingeführt, um die Vorrichtung zu bilden. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Magnetische Markierung von Stammzellen und Aussaat. (A) Stammzellen wurden für 30 min bei 37 ° C mit Eisenoxid - Nanopartikeln markiert. (B) Sphäroide wurden von markierten Zellen , die durch ein Netzwerk von 16 Mikro Magneten angezogen. Die Aggregate wurden in Vierergruppen am Tag fusionieren 11 durch Fusion der Dubletten vor 3 Tagen gebildet. Die Vierlinge wurden dann am Tag fusionierten 15 die endgültige technisch hergestellte Gewebe zu konstruieren. (C) ein Gerüst, platziert in einem Glasbodenschale ausgesät wurde mit oder mitaus magnetischen Kräften. Am Tag 4 spots verdichteter Stammzellen wurden in dem magnetisch seeded Gerüst beobachtet, während die Zellen in das Gerüst, ohne einen Magneten ausgesät gleichmäßig verteilt erschien. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Dynamische Reifung von cellularized Gerüste. (A) Nach dem magnetischen oder passiven Aussäen cellularized Gerüste wurden in Käfige gesetzt Störung zu vermeiden. (B) Cages, fixiert , um die Nadeln der Kappe verwendet wird , wurden in das Gefäß mit der chondrogenen Medium gefüllten Bioreaktor gegeben. Der Bioreaktor biaxiale Drehung mit einer unabhängig gesteuerten Geschwindigkeit (1-12 rpm und 1-35 rpm für den Arm und die Kammer, jeweils) aufgetragen. Eine peristaltische Pumpe kontinuierlich medi vorgesehenÄh. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Expression spezifischer Gene chondrogene am Tag 25 (A) , um die magnetisch induzierte Fusion von MSC Sphäroiden zeigte einen signifikanten Anstieg in Kollagen II im Vergleich zu dem Pellet durch Zentrifugation gebildet. * Bezeichnet einen statistischen Unterschied T-Test (p-Wert <0.05) verwendet wird. (B) Die Expression von Aggrecan und Kollagen II mit einer Kombination von magnetischem Aussäen und dynamischer Reifung in einem Bioreaktor differenzierten in Gerüsten deutlich erhöht wurden. Genexpression wurde normalisiert auf RPLP0 mRNA und ausgedrückt in willkürlichen Einheiten relativ zur Kontrolle (~ 1 ± SEM). Ergebnisse sind als Mittelwert ± SEM von zwei bis vier unabhängigen Experimenten. * denoTes einen statistisch signifikanten Unterschied unter Verwendung des Kruskal-Wallis-Test (one-way ANOVA nichtparametrischer Test) (p-Wert <0.05). (-): Impfen ohne Magneten; (+): Mit magnetischen Kräften Säen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5. histologische Färbung von Glykosaminoglykanen am Tag 25. Glycosaminoglycan (GAG) Einlagen von blau-lila Färbung nachgewiesen werden. (A) Eine positive Toluidinblau-Färbung wurde in den 8 & mgr; m-Gefrierschnitten der fertigen knorpeligen Struktur vom sequenziellen Fusion von 16 Aggregaten erhalten beobachtet. Die 12 & mgr; m-Gefrierschnitten von Gerüsten magnetisch ausgesät nach statischem (B) oder dynamisch (C) Bedingungen zeigten deutlich ,dass GAG-Gehalt höher war in Gerüsten in einem Bioreaktor unterscheiden. Die Pfeile zeigen die Aggregate von differenzierten Zellen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Erstens, weil die hier vorgestellten Techniken auf der Internalisierung von magnetischen Nanopartikeln beruhen, ein wichtiges Thema ist das Ergebnis der Nanopartikel, wenn sie innerhalb der Zellen zu lokalisieren. Es ist wahr , dass Eisen - Nanopartikeln potenzielle Toxizität oder beeinträchtigter Differenzierung Kapazität auslösen können je nach ihrer Größe, Beschichtungs- und Belichtungszeit 19, 22. Jedoch haben mehrere Studien keinen Einfluss auf die Zellphysiologie gezeigt , wenn gekapselte Eisennanopartikel 23 in Form von magnetoferritin verwendet wurden, eine biologische magnetischen Nanopartikel 24, oder sie wurden mit einer einfachen Beschichtung und Citrat ausreichenden Konzentrationen 18 verwendet. Wenn zusätzlich Eisenoxid-Nanopartikel in ähnlichen Bedingungen wie in diesem Dokument beschrieben ist, verwendet wurde (mit MSC und Chondrogenese) haben wir gezeigt, kürzlich, dass eine schnelle und fast vollständige Zersetzung des nanoparticles tritt in etwa 10 Tagen auf zelluläre Inkorporation und MSC Sphäroidbildung innerhalb der Endosomen. Interessanterweise wurde diese massive Abbau mit der effizienten Speicherung des freien Eisens innerhalb des Ferritin - Protein verbunden und führte zu einer sehr geringen Einfluss auf die zelluläre Eisenstoffwechsel, ein gutes Vorzeichen für zukünftige klinische Anwendungen 25.
Ein weiterer kritischer Punkt ist die Forderung der Zellverdichtung Chondrogenese zu initiieren. Üblicherweise wird die Kondensation von Zellen durch Zentrifugation erreicht; Jedoch wird dieses Verfahren durch eine geringe Anzahl von Zellen begrenzt (nicht mehr als 2,5 × 10 5 Zellen). Vergangenheit dieser Zahl, die Nährstoffe und Gas nicht in die Mitte der Aggregate diffundieren, Triggern Zellnekrosen. Hier wird die magnetische Kondensation von markierten Stammzellen in Aggregate erscheint als eine wichtige Methode zur Bildung 3D-Konstrukte für die Knorpelgeweberegeneration. Ein solches magnetisches Verfahren wurde von anderen Autoren verwendet worden, umAufbau 3D Sphäroide: durch Magnetschwebebahn mit einem Magneten auf der Oberseite der Platte nach der Dissoziation der Zellen 23 oder mit Eisenstiften platziert das Magnetfeld 26 zu lokalisieren. Jedoch Magnetschwebebahn erscheint nicht für weitere Stufen des Aggregat Fusion geeignet zu sein. Im Gegensatz dazu mit den magnetischen hier vorgeschlagenen Verfahren können wir alle Fusionsschritte steuern, um eine Schritt-für-Schritt Knorpelgewebekonstruktion zu erhalten. Kurz gesagt, dieser mehrstufigen Prozess beginnt mit Einschluss von Stammzellen in Aggregate Bausteine und wird durch die Fusion dieser Blöcke in eine größere Struktur folgt. Die kritischen Schritte dieses Gerüsts freien Stammzellaggregationsverfahren sind die folgenden: Erstens, man muss jedes Aggregat bilden, mit einem möglichst kleinen Volumen von Zellen wie möglich und zweitens, muß man die Fusionsschritte steuern die Bildung eines einzelnen, großen zu vermeiden Aggregat. Das Gewebe erhält hier war reich an Kollagen II und Aggrecan. Sie stellte auch den advantages von mit flexiblen Geometrie und Größe und des Seins gerüstfrei.
Der magnetische Ansatz wurde auch zur Führung Stammzellen innerhalb dicken und großen Gerüsten verwendet wird; eine weitere Alternative für die Gestaltung von verschiedenen Formen und Größen. Der entscheidende Schritt ist hier die Gerüste mit einem geeigneten Volumen an Zellen zu impfen: weder zu wenig eine Gesamt homogene Verteilung der Zellen zu haben, noch zu viel jeden Zellverlust zu vermeiden. Magnetische Kräfte wurden verwendet , vorher zu gewinnen und Zellen innerhalb Gerüste zu behalten und Zellaussaat 27, 28 zu erhöhen. Hier ausreichendes Zell Kondensation innerhalb der Poren der Polysaccharid-Gerüste führte zu einem erfolgreichen Chondrogenese. Die extrazelluläre Matrixproduktion war deutlich verbessert, wenn die magnetisch cellularized Gerüste auf die Transduktion / Scherstressstimuli durch den Bioreaktor dank seiner biaxialen Drehung vorgesehen unterworfen. Es wurde in anderen Studien gezeigt, dass MULti-axialen Belastungsbedingungen verbessert die Qualität von Geweben aus Chondrozyten 29 gebildet. Dieses neuartige Bioreaktor Konzept stellt eine echte Verstärkung , wenn zu den bestehenden Techniken verglichen, wobei nur Druckkräfte 30 angelegt werden, 31, 32.
Zusammenfassend für die chondrogene Differenzierung, die Verwendung von magnetischem Einschluss von markierten Stammzellen Aggregate als auch zu bilden und zu manipulieren, um als Gerüst für die Erstellung von Millimetergröße Knorpelzellkonstrukten erlaubt Samen. Darüber hinaus bietet ein wertvolles Anwendungen neues Werkzeug für die regenerative Medizin magnetische Zellaussaat mit dynamischer Differenzierung zu kombinieren.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Die Autoren möchten sich QuinXell Technologies und CellD, insbesondere Lothar Grannemann und Dominique Ghozlan für ihre Hilfe mit dem Bioreaktor bestätigen. Wir danken Catherine Le Visage, die uns mit den Pullulan / Dextran-Polysaccharid-Gerüste zur Verfügung gestellt. Diese Arbeit wurde von der Europäischen Union (ERC-2014-Cog Projekt MATISSE 648.779) und von der AgenceNationalede la Recherche (ANR), Frankreich (MagStem Projekt ANR-11 SVSE5) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Iron oxide (maghemite) nanoparticules (γ-Fe2O3) | PHENIX - University Paris 6 | Made and given by C. Ménager | Mean diameter of 8.1 nm and negative surface charge |
| Polysaccharide Pullulan/Dextran scaffolds | LIOAD - University Nantes | Made and given by C. Le Visage | Prepared from a 75:25 mixture of pullulan/dextran in alkaline conditions (10 M NaOH). Porosity: 185-205 µm; Thickness: 7 mm; Surface area: 1.8 cm2. |
| TisXell Regeneration System | QuinXell Technologies | QX900-002 | Biaxial bioreactor with 500 mL culture chamber |
| Cage for scaffolds: Histosette II M492 | VWR | 720-0909 | |
| Mesenchymal Stem Cell (MSC) | Lonza | PT-2501 | Three independant batches have been used |
| MSCGM BulletKit medium | Lonza | PT-3001 | For the complete medium, add the provided BulletKit (containing serum, glutamine and antibiotics) to the MSCGM medium |
| DMEM with Glutamax I | Life Technologies | 31966-021 | No sodium pyruvate, no HEPES |
| RPMI medium 1640, no Glutamine | Life Technologies | 31870-025 | No sodium pyruvate, no HEPES |
| PBS w/o CaCl2 w/o MgCl2 | Life Technologies | 14190-094 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 25300-054 | |
| Penicillin (10,000 U/mL) / Streptomycin (10,000 µg/mL) | Life Technologies | 15140-122 | |
| ITS Premix Universal Culture Supplement (20x) | Corning | 354352 | |
| Sodium pyruvate solution 100 mM | Sigma | S8636 | |
| L-Ascorbic Acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | Prepare the concentrated solution (25 mM) in distilled water extemporaneously |
| L-Proline | Sigma | P5607 | Prepare the 175 mM stock solution diluted in distilled water and store at 4 °C |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | Prepare the 1 mM stock solution diluted in Ethanol 100% and store at -20 °C |
| TGF-beta 3 protein 10 µg | Interchim | 30R-AT028 | |
| Tri-sodium citrate | VWR | 33615.268 | Prepare the 1 M stock solution diluted in distilled water and store at 4 °C |
| Pullulanase from Bacillus acidopullulyticus | Sigma | P2986 | |
| Dextranase from Chaetomium erraticum | Sigma | D0443 | |
| NucleoSpin RNA Extraction Kit | Macherey-Nagel | 740955.5 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Life Technologies | 18064-014 | |
| Random Primer - Hexamer | Promega | C1181 | 500 µg/mL: Use diluted 1/2 and put 1 µL per sample |
| Recombinant RNAs in ribonuclease inhibitor | Promega | N2511 | 40 U/µL: put 1 µL per sample |
| PCR nucleotide dNTP mix (10 mM each) | Roche | 10842321 | |
| SyBr Green PCR Master Mix | Life Technologies | 4368708 | |
| Step One Plus Real-Time PCR System | Life Technologies | 4381792 | |
| Formalin solution 10% neutral buffered | Sigma | HT5012 | |
| OCT solution | VWR | 361603E | |
| Isopentane | Sigma | M32631 | |
| Toluidine blue O | VWR | 1.15930.0025 | |
| Ethanol absolute | VWR | 20821.310 | |
| Toluene | VWR | 1.08323.1000 | |
| Mounting medium Pertex | Histolab | 840 | |
| RPLP0 Primer for qPCR | Eurogentec | 5'-TGCATCAGTAC CCCATTCTATCAT-3'; 5'-AAGGTGTAATC CGTCTCCACAGA-3' |
|
| Aggrecan Primer for qPCR | Eurogentec | 5'-TCTACCGCTGCGAGGTGAT-3'; 3'-TGTAATGGAACACGATGCCTTT-5' | |
| Collagen II Primer for qPCR | Eurogentec | 5'-ACTGGATTGACCCCAACCAA-3'; 3'-TCCATGTTGCAGAAAACCTTCA-5' |
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