Summary
Kök hücrelerden kondrogenezis kültür koşulları ince ayar gerektirir. Burada, hücreleri yoğunlaştırmak için bir manyetik yaklaşım sunmak, önemli bir adım kondorjenez başlatmak için. Buna ek olarak, bir biyo-reaktör içinde dinamik olgunlaşma hücresel yapıların mekanik uyarma uygulanır ve kıkırdak hücre dışı matris üretimini artırdığını göstermektedir.
Abstract
Kıkırdak mühendislik, doğal dokusuna benzer bir in vitro fonksiyonel implant oluşturmada zorluklar nedeniyle bir sorun olmaya devam etmektedir. Son zamanlarda otolog değiştirmeler geliştirilmesi için araştırdı bir yaklaşım kondrositlere kök hücrelerin farklılaşmasını içerir. Bu kondorjenez gereklidir kök hücre sıkıştırılması derecesi başlatmak için; Bu yüzden, hücre çekicilerin olarak minyatür bir manyetik alan kaynakları kullanılarak, kalın yapı iskeleleri ve iskele içermeyen içinde hem de manyetik olarak yoğunlaştırma hücrelerin uygulanabileceğini göstermiştir. Bu durum, manyetik yaklaşım, aynı zamanda, toplam füzyon kılavuz ve skafold içermeyen, organize oluşturmak için kullanılan, üç boyutlu (3D) boyut olarak birkaç milimetre dokular. gelişmiş bir boyuta sahip ek olarak, manyetik tahrikli füzyonuyla oluşturulan doku kolajen II ekspresyonunda önemli bir artış mevcuttur, ve benzer bir gelişme agrekan ifadesi için gözlemlendi. doğal kıkırdak kuvvetleri t tabi tutuldu olarakşapka onun 3D yapısını etkilemiş, dinamik olgunlaşma da yapıldı. mekanik uyaran sağlayan bir biyo-reaktör, 21 günlük bir süre boyunca kültüre manyetik ekildi iskeleleri kullanılmıştır. Biyoreaktör olgunlaşma ölçüde cellularized iskele içine kondrojenezi geliştirilmiş; Bu koşullar altında elde edilen hücre dışı matris, kolajen II ve agrekan zengin oldu. Bu çalışma, geliştirilmiş kondrojenik farklılaşması, her iki iskele içermeyen ve polisakarid iskeleleri için bir biyo-reaktör içinde etiketlenmiş kök hücrelerin manyetik yoğunlaştırılması ve dinamik olgunlaşma yenilikçi potansiyel özetlenmektedir.
Introduction
Manyetik nanopartiküller zaten manyetik rezonans görüntüleme (MRI) için kontrast ajanları olarak klinikte kullanılmaktadır ve bunların tedavi edici uygulamalar genişleyen tutun. Örneğin, son zamanlarda etiketli hücreler implantasyonu, 1, 2, 3 ve belirlenen bir alanda bir dış manyetik alan kullanılarak in vivo olarak manipüle edilebilir ve yönlendirilebilir ve / veya muhafaza gösterilmiştir. Rejeneratif tıpta, vasküler dokuda 5, 6, 7, kemik 8 ve kıkırdak 9 içeren in vitro 4 organize dokular, mühendislikten geçirilmesi için de kullanılabilir.
Eklem kıkırdağı zarar meydana geldiğinde çok sınırlı bir hücre dışı matris bileşenlerinin tamiratlar, avasküler bir ortamda batırılır. Bu nedenle, Araştırma, Forh anda anzasının bulunduğu yere implante edilebilir hyalin kıkırdak değiştirmeleri mühendisliği odaklanmıştır. Diğer kondrosit 12, 13 içine ayırt etmek mezenkimal kök hücreler (MSC) kapasitesini vurgulamak sırasında bir otolog değiştirme üretmek için, bir araştırma grupları, bir hücre kaynağı 10, 11 otolog kondrositlerin kullanılmasını araştırmaktadır. Onların kemik iliği örneklemesi oldukça basittir ve bunların fenotipi 14 kaybetme riski sağlıklı kondrosit kurbanını gerektirmez burada değinmeyecek önceki çalışmalarda, biz, MSC seçildi.
Kök hücrelerin kondrojenik farklılaşma başlatılması için gerekli erken adım onların yoğunlaşma olduğunu. Hücre kümeleri genellikle santrifüj veya mikrokütle kültürü 15 kullanılarak oluşturulur; Bununla birlikte, bu yoğunlaştırma yöntemleri neither kalın iskeleler de agrega füzyon kontrol etmek için potansiyeli olan, hücre kümeleri oluşturmak için potansiyel göstermektedir. Bu makalede, MSC manyetik etiketleme ve manyetik cazibe kullanarak kök hücrelerin yoğuşmalı için yenilikçi bir yaklaşım açıklar. Bu teknik, bir milimetre çaplı kıkırdak doku 9 elde etmek üzere bir diğeri ile agrega füzyon yoluyla iskele-3D yapıları oluşturmak üzere kanıtlanmıştır. kalın ve büyük yapı iskeleleri manyetik tohumlama da işlenmiş doku boyutunu artırmak implantasyon için daha kolay bir şekilde faydalı olan bir şekil tasarımı ve kıkırdak tamir klinik uygulamalar için potansiyel çeşitlendirilmesi olasılığını sağlamıştır. Burada, doğal polisakaritler, pullulan ve dekstran oluşan gözenekli yapı iskeleleri içine MSC manyetik tohumlama için ayrıntılarıyla protokolü, iskeleler, daha önce kök hücreleri 16, 17 sınırlandırmak için kullanılmaktadır. Kondrojenik farklılaşma finall olduy hücrelerin yüksek yoğunluğa sahip tohumlanmış iskelesinin matris çekirdek içine sürekli besin ve gaz yayılmasını sağlamak için bir biyo-reaktörde gerçekleştirilmiştir. hücrelere besin, kondrojenik büyüme faktörleri ve gaz sağlamanın yanı sıra, biyoreaktör mekanik stimülasyonu sundu. Genel olarak, bir biyo-reaktör içinde dinamik olgunlaşma ile birlikte kök hücreleri sınırlandırmak için kullanılan manyetik teknolojisi, belirgin kondrojenik farklılaşma artırabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Manyetik Cihazların 1. İnşaat
Not: Hücre ekimi için kullanılan cihazlar, uygulamaya bağlı olarak değişir (Şekil 1). Manyetik uçları (çapı 750 mm), çok ince olmalıdır, böylece agrega oluşturmak için, hücrelerin sayısı, 2.5 x 10 5 / agrega ile sınırlıdır. 1.8 cm 2/7 mm kalınlığında iskeleleri tohum için, mıknatısların daha büyük (Çapı 3 mm) olması gerekir ve skafold gözeneklerinin içinden hücre göçünü sağlayacaktır.
- Agregat oluşumu için mikro-mıknatıs olan bir cihaz yapımı (Şekil 1A)
- alüminyum plakalar içinden bir 0.8 mm matkap ile mikro-delikleri (3 cm çapında ve 6 mm kalınlığında) konur.
- plakanın her deliğe, bir manyetik uç (çapı 750 mm) yerleştirin.
- doygunluk manyetizasyonu sağlayan kalıcı bir neodim mıknatıs, üzerinde bu disketi yerleştirin.
- iskele tohumlama için bir cihazın İnşaat (
- 2.4 cm2 kareler halinde sert polistiren kesin.
- 1.6 cm2 'lik bir yüzey alanı üzerinde eşit mesafede 9, küçük mıknatıslar (çap 3 mm uzunluğunda ve 6 mm) takın.
- Kalıcı neodim mıknatıs üzerinde bu cihazı yerleştirin.
2. Kök Hücre Etiketleme
NOT: 30 dakika (5 ± 0.4 pg demir / hücre) tohum için 0.2 mM manyetik nano partiküller ile etiketlenmiştir Kök hücreleri, 30 dakika boyunca (2.6 ± 0.2 pg demir / hücre) agregatlar oluşturması için 0.1 mM manyetik nano partiküller ile etiketlenmiştir iskeleleri. Bu nanoparçacık konsantrasyonları ve inkübasyon süreleri, daha önce kullanılmış, MSC ve diğer hücreler 18, 19 için yayınlanan ve nanopartiküller ne hücre canlılığı veya MSC farklılaşma kapasitesi etkilenmiş olduğu tespit edilmiştir edilmiştir. kök hücre ile bu buluşa katılan demir kütlesi tek ce ile ölçüldüII magnetophoresis 19, 20.
- Civarındaki kadar 37 ° C'de ve% 5 CO2 seviyesinde tam mezenkimal kök hücre büyüme ortamı (MSCGM) Kültür mezenkimal kök hücreler (MSC) (~% 90) birbirine kaynaşma seviyesine kadar.
- Glutaminsiz Roswell Park Memorial Institute (Kan numuneleri) modifiye edilmiş serumsuz McCoy'un 5A ortamında ve 5 ihtiva eden: 0.1 ya da 0.2 mM maghemit sitrat-kaplı demir oksit (8 nm çapında ana γFe 2 O 3) karıştırılması ile, manyetik işaretleme çözeltisi hazırlayın mM sodyum sitrat.
- , Orta atın glutamin içermeyen serumsuz RPMI ortamı ile hücrelerin durulama ve 150 cm2'lik kültür şişesi, tüm hücreleri karşılamak için gerekli olan minimum hacim başına demir oksit nanopartiküllerinin çözeltisi 10 ml.
- 37 ° C'de 30 dakika karıştırıldı ve% 5 CO2 inkübe edin ve daha sonra nanoparçacık solüsyonu atın. nan içselleştirme glutamin içermeyen serumsuz RPMI ortamı 5 dakika boyunca durulamaoparticles hala plazma membranına bağlı.
- RPMI ortamı atılır ve kap başına tam MSCGM ortamı 25 ml. 37 ° C'de gece boyunca inkübe edilir ve% 5 CO2.
3. Manyetik Hücre Ekme
- Taze 50 uM L-askorbik asit 2-fosfat, 0.1 uM deksametazon, 1 mM sodyum piruvat, 0.35 mM L-prolin,% 1 evrensel kültürü eklenerek Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı (DMEM), L-glutamin ile, yüksek glukoz kullanılarak kondrojenik ortamı hazırlamak insülin, insan transferrin ve selenik asit (ITS-karışımlar) ve 10 ng / ml, transforme edici büyüme faktörü-beta 3 (TGF-β3) içeren ek.
- 5 dakika boyunca 260 x g'de% 0.05 150 cm2'lik kültür şişesi başına tripsin-EDTA ve santrifüj ayrışmış hücreleri 8 mL kullanılarak manyetik hücre ayırın. orta aspire ve yeniden süspansiyon haline hücreleri sayın.
- Her iki manyetik cihazların üstünde bir cam tabanlı hücre kültürü Petri kabı (35 mm) yerleştirin.
- magnetically agrega başı (yatırılabilir 16 agrega kadar) 2.5 x 10 5 etiketli hücreler ihtiva eden mümkün olan en küçük bir hacmi (en fazla 8 uL) yatırma yavaşça Petri kabı kondrojenik orta 3 mL ekleyin ve agregatlar oluştururlar. Bu sferoidler oluşmasına izin vererek, taşımadan 20-30 dakika süreyle Petri kabı bırakın ve daha sonra 37 ° C'de ve% 5 CO2 inkübatörü içinde, 16 agrega içeren Petri kabı da dahil olmak üzere, komple bir cihaz yerleştirin.
- Form kontrolü agrega aynı protokolü takip ve TGF-p3 olmadan kondrojenik ortamla tam orta yerine.
- 3D toplam yapı üretmek 8 çiftleri oluştururlar ve füzyon başlatmak için günde 8 temas eden 2 agrega yerleştirin. Gün 11, 4 dördüz oluşturmak üzere 2 çift durumlar birleştirme. Son olarak, nihai bir yapı elde etmek günde 15 4 dördüz kaynaştırmak.
- Aynı zamanda, x 10 5 2.5 santrifüjleme ile bir araya toplanırlar 260 ° kök hücreleri etiketli15; ya da TGF-p3 olmadan kondrojenik ortamın 1.5 mL, 15 ml tüpler içinde 5 dakika boyunca gr (numune ve kontrol için, sırasıyla).
- Tohum iskeleleri manyetik olarak için, bir Petri kutusu içine her kurutuldu iskele yerleştirin. Pullulan / dekstran 21 yapılmış polisakarit gözenekli iskeleleri kullanın. Her bir yapı iskelesi için, TGF-p3 olmadan kondrojenik ortamın 350 uL 2 x 10 6 etiketli kök hücreleri sulandırmak ve dikkatli bir şekilde bir yapı iskeleti içine hücreleri pipetle.
- iskele içinde tam hücre penetrasyonu imkan vermek için 37 ° C'de 5 dakika boyunca inkübe edin ve daha sonra yavaşça veya Petri kabı (sırasıyla numune ya da kontrol için,), TGF-p3 olmadan kondrojenik orta 3 ml.
- Iskele gözenekler ve sınırlandırılması yolu ile hücre göçü için izin vermek üzere 2 ila 4 gün boyunca CO, 37 ° C'de, manyetik cihazda cellularized iskele inkübe ve% 5.
- Aynı zamanda, özellıklerı tohum 2 x 10 6
Kondrositlere 4. Farklılaşma
NOT: 4 günlük kuluçkadan sonra, mıknatıslar kaldırıp kondrojenik olgunlaşmasını ya bir Petri kabı (statik koşullar) veya bir biyoreaktör (dinamik koşullar) içinde devam ediyor. Negatif kontrol numuneleri TGF-p3 olmadan kondrojenik ortamla statik koşullarda olgunlaştırılır.
- Statik koşullarda, aynı Petri kabındaki cellularized iskele veya agrega tutun. 21 gün boyunca haftada iki kez kondrojenik orta değiştirin.
- Dinamik koşullarda, biyoreaktör hazırlayın.
- üreticinin protokolüne uygun olarak uygun uzunlukta silikon tüp kesin.
- 500 ml'lik kültür odası, boru, 2-yollu rotatorlar ve kafesler: tüm malzemeleri otoklava.
- steril microbio içine biyoreaktör parçaları yerleştirinMantıksal güvenlik istasyonu. Üreticinin talimatlarını takip 2 yönlü rotatörlerde ve kültür odasına boru bağlayın.
- Dikkatle steril bir spatula kullanılarak sterilize kafeslerin içine cellularized iskele aktarın. kafes başına 2 iskeleleri yerleştirin. kafesleri hazır olduğunda, daha fazla rotasyon sırasında hareket onları tutmak için kapağın iğne içine yerleştirin. kondrojenik ortam ile kültür odası doldurun ve kafesleri içeren kapak ile kapatın.
- kondrojenik ortamla boru doldurmak için ve hava kabarcıklarını yok etmek için peristaltik pompa açın.
- Yerleştirin ve biyoreaktör motora doldurulur odasını güvenceye ve kolun ve odanın her iki rotasyonları kontrol eden bilgisayar, açın.
- kol ve bölme her iki dakika başına 5 dönüş (rpm) bir dönme hızı uygulanır. cellularized iskelelerinin sürekli beslenmesi için 10 rpm'de bir akış hızında peristaltik pompa ayarlayın.
Not: RNA ekstraksiyonu önce, bir enzimatik solüsyon ile iskeleleri sindirimi.
- pululanaz, 100 uL (40 U / mL) ve serum içermeyen DMEM ortamı 850 mL dekstranaz 50 uL (60 mg / ml) eklenerek enzimatik solüsyon 1 mL hazırlayın.
- Serum içermeyen DMEM ortamı ile iki kez iskeleleri durulayın orta atmak ve iskele başına enzimatik çözeltisinin 800 uL ekleyin. , hafifçe çalkalanarak 37 ° C'de 15-30 dakika süreyle inkübe edilir.
- iskele tamamen çözülür, dikkatli bir şekilde orta aspire, 10 dakika boyunca 300 x g 'de bir 1,5-ml tüp hücreleri ihtiva eden çözelti, santrifüj transferi x 1 steril fosfat-tamponlu tuzlu su (PBS), santrifüj ile iki kez durulama 300 x g'de 10 dakika ve RNA izolasyon çözeltisi içinde hücreler yeniden askıya.
- , Agrega RNA çıkarmak RNA izolasyonu çözeltisi içinde sferoidler yerleştirmek için veTamamen RNA ekstraksiyonu yapılmadan önce bir homojenleştirici kullanarak ezmek.
- Üreticinin talimatlarına uygun olarak, toplam RNA ekstraksiyonu için bir kit kullanılarak RNA izole edilir.
- DNTP karışımı 1 uL (10 mM), 40 U / ml RNaz inhibitör rastgele primerler 250 ng kullanılarak, üreticinin talimatlarına uygun olarak, ters transkriptaz kullanılarak toplam RNA 400 ng tamamlayıcı DNA sentez; reaksiyonun nihai hacmi, 20 uL'dir. Reaksiyonun sonunda, 100 uL nihai hacim elde etmek üzere damıtılmış su 80 uL ekleyin.
- kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) için, 10 x seyreltildi cDNA ile, örneğin agrekan (AGC) ve kolajen II'ye (Col II) ilgi konusu genlerin, göreceli ifade miktarını belirlemek için bir floresan madde içeren bir PCR karışımı kullanılır. referans gen ribozomal protein, büyük, P0 (RPLP0) ile gen ekspresyonunun seviyelerini normalize. AACT formülü - 2 ile hesaplamalar gerçekleştirin, AACT = ACt farklı durumun burada - Kontrol koşulu ACt anlamına gelir ve her bir ACt ilgi konusu genin, CT temsil eder - referans gen (RPLP0) arasında CT.
- ortalama değerler ortalama (SEM) ± standart hata olarak istatistiksel ölçümleri belirler. n ≥ 2 bağımsız deneylerle analizi gerçekleştirin. santrifüj edilmiş peletler ve manyetik füzyonları (* p <0.05) arasında istatistiki farklılıklarını analiz etmek için, Student t-testi kullanın. Kontrol skafold farklı yapı iskeleleri arasında istatistiksel farklılıkları (* p <0.05) analiz etmek için bir Kruskal-Wallis testi (tek yönlü ANOVA parametrik olmayan) ile önem belirler.
6. Histolojik Analiz
- Steril 1 x PBS ile cellularized iskeleleri veya agregaların durulayın, oda sıcaklığında 1 saat için% 10 formalin çözeltisi içinde çözmek ve 1 x PBS ile yıkayın.
- , PBS çıkarın optimum kesmeye örnekleri gömmekg sıcaklık bileşiği (OCT), ve sıvı azot içine daldırılmış bir izopentan küveti içinde dondurulur. -20 ° C'de örnek saklayın. agregatlar veya cellularized İskele 12 um 8 mikron cryosections elde etmek için bir kriyostat ile örnekleri kesilir.
- tolüen kullanılarak açıklık,% 100 etanol ile dehidre musluk suyu ile durulayın, 2 dakika süre ile% 0.5 toluidin mavisi çözeltisi ile cryosections Leke ve ışık mikroskopi için bir montaj ortamı ile montaj slaydları.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
İlk olarak, gruplar ayrı ayrı 2.5 x 10 5 etiketli kök hücreleri (Şekil 2A) biriktirilmesiyle mikro mıknatıslar kullanılarak oluşturulabilir. Bu tek agregalar (girişlerinin boyu yaklaşık olarak 0.8 mm), daha sonra ardışık manyetik indüklenen füzyon daha büyük yapılar sayesinde içine birleştirilebilir. Örneğin, kondrojenik olgunlaşma 8. günde, agrega çiftleri oluşturmak üzere çiftler halinde temas halinde yerleştirilmiştir; quadruplets 2 ikili birleştirme ile 11. günde monte edilmiştir; ve son olarak, 15. günde, 4 quadruplets 4 x 10 6 hücre (girişlerinin boyu yaklaşık olarak 4 mm) (Şekil 2B) olmak üzere toplam, başlangıçta oluşan agregalar 16 ihtiva eden bir 3 boyutlu yapısı oluşturmak üzere birleştirilmiştir. İkinci olarak, aynı manyetik çekim tekniği iskeleleri içinde hücre agregatları oluşturmak üzere kullanılmıştır. Iskeleleri manyetik cihazın üzerine ekildi ve yoğun (Şekil 2C tam mikro mıknatıs yerlerde, iskele gözenekleri içinde hücreler kondanse gösterdi). Hücreler manyetik çekim (pasif tohumlama olmadan) bir iskele içinde tohumlanmıştır Aksine, bunlar eşit olarak dağıtılmış olduğu bulunmuştur. Cellularized iskeleleri sonra dinamik olgunlaştırma koşullarında (Şekil 3B) altında kondrojenik işlemini gerçekleştirmek için biyoreaktör odasına bağlanmış kafeslere (Şekil 3A) yerleştirilmiştir. Böyle bir biyo-reaktör besin ve gaz alışverişini artırır ve transdüksiyonu ile mekanik stimülasyon sağlar. Yumuşak 3D doku rejenerasyonu için yapıcısı tarafından tavsiye edildiği gibi kol ve odanın her iki dönme hızı, 5 rpm'ye ayarlanmıştır. ortam sürekli bir kaynağı sağlayan bir peristaltik pompa 10 rpm'de ayarlandı.
Tüm hücre organizasyonu koşullarına (kaynaşık agrega ve iskeleler olan tohumlama) ve (a biyoreaktör içinde veya olmadan) doku olgunlaşması için, gen ekspresyonu, günde 25 üzerinde analiz edilmiştir manyetik füzyonu ile oluşturulan doku signi gösterdibirlikte agrekan ekspresyonunun yüksek bir eğilim ile santrifüj (Şekil 4A) ile elde edilen taneciğe kıyasla kolajen II ekspresyonunda ficant artış. cellularized iskeleler sağlamak için, bir artış elde agrekan ve iskeleler manyetik kuvvetler olmadan tohumlandı karşılaştırıldığında kolajen II ekspresyonu anlamlı kolajen II-zaman manyetik tohumlama kullanılmıştır. Buna ek olarak, her iki genin ifade manyetik tohumlama dinamik farklılaşması (Şekil 4B) ile kombine edildiğinde (Col II anlamlı) daha yüksektir.
Histolojik analizler de glikosaminoglisanlar (GAG) ortaya çıkarmak için bir toluidin mavisi boya kullanılarak, örneğin gerçekleştirilmiştir. Mavi-mor renk (Şekil 5A) de işaret ettiği gibi 16 agrega ardışık manyetik füzyon, GAG bol birikmesini göstermiştir. iskelelerinin için, sadece bu manyetik olarak toluidin mavisi ile boyandı seribaşı. GAG conteniskeleler bir biyoreaktör (Şekil 5B) yerine statik (Şekil 5C) farklılaşan zaman t yüksekti. Birlikte ele alındığında bu sonuçlar, kondrojenezi geliştirmek için iskeleler içinde manyetik toplama ve manyetik tohum potansiyelini göstermektedir. Ayrıca biyoreaktör içinde dinamik olgunlaşma koşulları çok daha elverişli verimli farklılaşması için olduğunu gösterir.
Manyetik cihazlar Şekil 1. İnşaat. (A), agregat oluşumu için bir manyetik cihaz örneği: alüminyum levha (0.8 um çaplı delikler) delinmiştir ve uçları, her deliğe sokulur ve daha sonra doyma noktasına mıknatıslanma sağlanmış bir kalıcı neodimiyum mıknatıs üzerine yerleştirilmiştir. (B), manyetik cihaz iskele tohum: 9 elle yapılan delik vardı (24 mm x 2) sabit polistirendoygunluk manyetizasyonu sağlanmalıdır kalıcı Neodimyum mıknatıs, üzerine yerleştirdi. Küçük mıknatıslar (Çapı 3 mm) daha sonra cihaz oluşturmak için her deliğin içine yerleştirilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Kök hücreleri ve tohum 2. Manyetik etiketleme Şekil. (A), hücrelerin 37 ° C'de 30 dakika boyunca demir oksit nanopartiküllerinin ile etiketlenmiştir Stem. (B) sferoidler 16 mikro mıknatıslar ağı ile çeken etiketlenmiş hücrelerden meydana gelmiştir. agregalar 3 gün önce oluşturulan çiftler füzyonu ile 11. günde dördüz birleştirilmiştir. quadruplets daha sonra nihai işlenmiş doku oluşturmak için 15. günde kaynaştırılmıştır. Bir cam tabanlı kap içine yerleştirilir (C) iskeleti, ile ya da tohumlanmışdışarı manyetik kuvvetler. Hücreler eşit bir mıknatıs olmaksızın tohumlanır iskele dağıtılan çıktı ise 4. günde, sıkıştırılmış kök hücrelerin lekeler, manyetik tohumlanmış iskele gözlenmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Cellularized iskelelerinin 3. Dinamik olgunlaşmasını Şekil. Manyetik veya pasif, tohumlamadan sonra, (A), cellularized iskeleleri zarar görmesini önlemek için kafeslerine konuldu. Kapağın iğneler kullanılarak sabit (B) Kafesler, kondrojenik ortam ile doldurulmuş biyoreaktörün kap içine yerleştirilmiştir. biyoreaktör bağımsız olarak kontrol edilen bir hızda (1-12 rpm ve kol ve bölme için sırasıyla 1-35 rpm) ile iki eksenli rotasyon uygulanır. Bir peristaltik pompa sürekli olarak medi Resimum. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
25 gün belirli kondrojenik genlerin Şekil 4. (A) ekspresyonu MSC sferoitlerin manyetik indüklenen füzyon santrifüjle oluşan pelet ile karşılaştırıldığında kolajen II önemli bir artış gösterdi. * Student t-testi (p-değeri <0.05) kullanılarak istatistiksel bir fark gösterir. (B), II açık bir biyoreaktörde manyetik ekim ve dinamik olgunlaşma bir kombinasyonu ile ayırt iskeleleri artmıştır agrekan ve kollajen ifadesi. Gen ekspresyonu RPLP0 mRNA normalize edilmiştir ve (± 1 ± SEM) kontrol etmek için rasgele bir birim cinsinden ifade. Sonuçlar, iki-dört bağımsız deneyin ortalama ± SEM olarak sunulmuştur. * indenoKruskal-Wallis testi (tek yönlü ANOVA parametrik olmayan testi) (p-değeri <0.05) kullanılarak istatistiksel fark TES. (-): mıknatıs olmaksızın tohumlama; (+): Manyetik kuvvetler tohumlamadan. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
25. glikozaminoglikan (GAG) yatakları mavi-mor renk ile kanıtlanabilen gün glikozaminoglikanların Şekil 5. histolojik boyama. (A), pozitif bir toluidin mavisi boyama 16 agrega ardışık füzyon ile elde edilen son kıkırdak yapının 8 mikron cryosections gözlenmiştir. Manyetik statik (B) ardından ekilmiştir iskeleler veya dinamik (C) koşullarda 12 mikron halinde kriyoseksiyonlar açıkça gösterdibu GAG içeriği bir biyoreaktörde farklılaşmış iskeleleri daha yüksekti. Oklar farklılaşmış hücre agregatları göstermektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada sunulan teknikler manyetik nanopartiküllerin içselleştirilmesi güvenmek çünkü hücrelerin içinde lokalize bir kez Birincisi, bir önemli konu nanopartiküllerin sonucudur. Demir nanopartikullerin potansiyel toksisite veya maruz kalma 19, 22 boyutları, kaplama ve zamana bağlı olarak bozulmuş farklılaşma kapasitesi tetikleyebilir doğrudur. Kapsüllenmiş demir nanopartiküllerin magnetoferritin şeklinde, biyolojik manyetik nano parçacık 24 23 kullanılmıştır, ya da basit bir sitrat kaplama ve yeterli konsantrasyonda 18 kullanılmıştır, ancak bazı çalışmalar hücre fizyolojisi üzerinde herhangi bir etkisi göstermiştir. Buna ek olarak, demir oksit nanopartiküller (MSC ile ve kondrojenez için) Bu makalede tarif edilenler gibi benzer koşullar altında kullanıldığı zaman, son zamanlarda göstermiştir ki nanoparti hızlı bir şekilde ve hemen hemen toplam bozunmadöngüler hücresel dahil ve MSC küremsi formasyonu üzerine yaklaşık 10 gün içinde endozomlarda içinde gerçekleşir. İlginç bir şekilde, bu büyük parçalanma ferritin proteini içindeki serbest demirin etkili bir depolama ile ilişkilendirilmiştir ve gelecekteki klinik uygulamalar için 25 rakamlarının hızla, hücresel demir metabolizması üzerinde çok az bir etkiye yol açmıştır.
Başka kritik nokta kondrojenezi başlatmak için hücre sıkışma gerekliliktir. Genellikle, hücre yoğunlaşma santrifüjleme yoluyla elde edilir; Bununla birlikte, bu yöntem, bir hücre az sayıda (en fazla 2.5 x 10 5 hücre) ile sınırlıdır. Bu sayı Geçmiş, besin ve gaz hücre nekrozu tetikleyerek agrega merkeze dağınık olamaz. Burada, agregalar halinde etiketli kök hücrelerin manyetik yoğunlaşma 3D kıkırdak doku rejenerasyonu için yapıları oluşturmak üzere önemli bir yöntem olarak görülmektedir. Bu tür bir manyetik prosedür Diğer yazarlar tarafından kullanılmaktadır3D sferoidler oluşturmak: manyetik olarak kaldırılmasının göre manyetik alan 26 lokalize hücre 23 veya demir pimleri ayrışma sonrasında plaka üzerine yerleştirilen bir mıknatıs. Bununla birlikte, manyetik asma toplam kaynaşma daha aşamaları için uygun olması gibi görünmemektedir. Manyetik bir yöntem burada önerilen tam aksine, bir adım adım kıkırdak dokusu yapı elde etmek tüm füzyon adımları kontrol edebilir. Özet olarak, bu çok-aşamalı işlem, toplam yapı blokları kök hücre hapsi ile başlar ve daha büyük bir yapı halinde, bu blokların füzyon tarafından takip edilir. Bu yapı iskelesi içermeyen kök hücre agregasyonu prosedürü kritik aşamaları aşağıdaki gibidir: İlk olarak, tek tek tek, büyük oluşumunu önlemek için füzyon adımları kontrol gerekir, mümkün ve ikinci olarak küçük hücre hacmi her agreganın oluşturulması gerekir agrega. Burada elde edilen doku kollajen II ve çöktürücü zengin oldu. Ayrıca advantag sunduEsnek geometri ve boyutuna sahip olan ve yapı iskelesi içermeyen olma es.
Manyetik yaklaşım kalın ve büyük iskeleler olan kök hücreleri yönlendirmek için kullanılmıştır; Çeşitli şekil ve boyutlarda tasarımı için başka bir alternatif. hücre baştan aşağı homojen bir dağılıma sahip olması, çok az ne çok fazla herhangi bir hücre kaybını önlemek için de: burada kritik bir adım hücrelerinin uygun bir hacmiyle iskeleleri tohum etmektir. Manyetik kuvvetler daha önce çekmek ve iskeleler içinde hücreleri korumak ve hücre tohumlama 27, 28 artırmak için kullanıldı. Burada, polisakkarit iskelelerinin gözenekler içinde yeterli hücre yoğunlaşma başarılı kondrogenezisi yol açtı. manyetik cellularized iskeleleri onun bi-eksenel dönüşe biyoreaktör sayesinde sağlanan transdüksiyon / kesilme baskısı uyaranlara maruz kaldıkları hücre dışı matris üretimini belirgin bir şekilde artmıştır. Bu mul diğer çalışmalarda gösterilmiştirti-eksenel yükleme koşulları kondrositlerin 29 oluşan dokuların kalitesi artar. Sadece basınç kuvvetlerinin 30, 31, 32 uygulandığı mevcut tekniklere kıyasla, bu yeni biyoreaktör kavramı gerçek kazanç sunulur.
Sonuç olarak, kondrojenik farklılaşması için, etiketli kök hücrelerin manyetik lohusalık kullanımı oluşturmak ve işlemek agregatlar olarak milimetrik boyutlu kıkırdak hücre yapıları oluşturulması için izin iskeleleri tohum için. Buna ek olarak, dinamik farklılaşma ile manyetik hücre tohumlama birleştiren rejeneratif tıp uygulamalarında değerli bir yeni araç sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Yazarlar biyoreaktör sağlamada yardımcı olan QuinXell Teknolojileri ve CellD, özellikle Lothar Grannemann Dominique Ghozlan kabul etmek istiyorum. Biz pullulan / dekstran polisakkarit iskeleleri ile bize sağladığı Catherine Le Visage, teşekkür ederim. Bu çalışma, Avrupa Birliği (ERC-2014-ağırlık merkezi projesi Matisse 648779) tarafından ve AgenceNationalede la Recherche (ANR), Fransa (MagStem proje ANR-11 SVSE5) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Iron oxide (maghemite) nanoparticules (γ-Fe2O3) | PHENIX - University Paris 6 | Made and given by C. Ménager | Mean diameter of 8.1 nm and negative surface charge |
| Polysaccharide Pullulan/Dextran scaffolds | LIOAD - University Nantes | Made and given by C. Le Visage | Prepared from a 75:25 mixture of pullulan/dextran in alkaline conditions (10 M NaOH). Porosity: 185-205 µm; Thickness: 7 mm; Surface area: 1.8 cm2. |
| TisXell Regeneration System | QuinXell Technologies | QX900-002 | Biaxial bioreactor with 500 mL culture chamber |
| Cage for scaffolds: Histosette II M492 | VWR | 720-0909 | |
| Mesenchymal Stem Cell (MSC) | Lonza | PT-2501 | Three independant batches have been used |
| MSCGM BulletKit medium | Lonza | PT-3001 | For the complete medium, add the provided BulletKit (containing serum, glutamine and antibiotics) to the MSCGM medium |
| DMEM with Glutamax I | Life Technologies | 31966-021 | No sodium pyruvate, no HEPES |
| RPMI medium 1640, no Glutamine | Life Technologies | 31870-025 | No sodium pyruvate, no HEPES |
| PBS w/o CaCl2 w/o MgCl2 | Life Technologies | 14190-094 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 25300-054 | |
| Penicillin (10,000 U/mL) / Streptomycin (10,000 µg/mL) | Life Technologies | 15140-122 | |
| ITS Premix Universal Culture Supplement (20x) | Corning | 354352 | |
| Sodium pyruvate solution 100 mM | Sigma | S8636 | |
| L-Ascorbic Acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | Prepare the concentrated solution (25 mM) in distilled water extemporaneously |
| L-Proline | Sigma | P5607 | Prepare the 175 mM stock solution diluted in distilled water and store at 4 °C |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | Prepare the 1 mM stock solution diluted in Ethanol 100% and store at -20 °C |
| TGF-beta 3 protein 10 µg | Interchim | 30R-AT028 | |
| Tri-sodium citrate | VWR | 33615.268 | Prepare the 1 M stock solution diluted in distilled water and store at 4 °C |
| Pullulanase from Bacillus acidopullulyticus | Sigma | P2986 | |
| Dextranase from Chaetomium erraticum | Sigma | D0443 | |
| NucleoSpin RNA Extraction Kit | Macherey-Nagel | 740955.5 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Life Technologies | 18064-014 | |
| Random Primer - Hexamer | Promega | C1181 | 500 µg/mL: Use diluted 1/2 and put 1 µL per sample |
| Recombinant RNAs in ribonuclease inhibitor | Promega | N2511 | 40 U/µL: put 1 µL per sample |
| PCR nucleotide dNTP mix (10 mM each) | Roche | 10842321 | |
| SyBr Green PCR Master Mix | Life Technologies | 4368708 | |
| Step One Plus Real-Time PCR System | Life Technologies | 4381792 | |
| Formalin solution 10% neutral buffered | Sigma | HT5012 | |
| OCT solution | VWR | 361603E | |
| Isopentane | Sigma | M32631 | |
| Toluidine blue O | VWR | 1.15930.0025 | |
| Ethanol absolute | VWR | 20821.310 | |
| Toluene | VWR | 1.08323.1000 | |
| Mounting medium Pertex | Histolab | 840 | |
| RPLP0 Primer for qPCR | Eurogentec | 5'-TGCATCAGTAC CCCATTCTATCAT-3'; 5'-AAGGTGTAATC CGTCTCCACAGA-3' |
|
| Aggrecan Primer for qPCR | Eurogentec | 5'-TCTACCGCTGCGAGGTGAT-3'; 3'-TGTAATGGAACACGATGCCTTT-5' | |
| Collagen II Primer for qPCR | Eurogentec | 5'-ACTGGATTGACCCCAACCAA-3'; 3'-TCCATGTTGCAGAAAACCTTCA-5' |
References
- Naumova, A. V., Modo, M., Moore, A., Murry, C. E., Frank, J. A.
- Edmundson, M., Thanh, N. T., Song, B. Nanoparticles based stem cell tracking in regenerative medicine. Theranostics. 3 (8), 573-582 (2013).
- Di Corato, R., et al. High-resolution cellular MRI: gadolinium and iron oxide nanoparticles for in-depth dual-cell imaging of engineered tissue constructs. ACS Nano. 7 (9), 7500-7512 (2013).
- Xu, F., et al. Three-dimensional magnetic assembly of microscale hydrogels. Adv Mater. 23 (37), 4254-4260 (2011).
- Kito, T., et al. iPS cell sheets created by a novel magnetite tissue engineering method for reparative angiogenesis. Sci Rep. 3, 1418 (2013).
- Mironov, V., Kasyanov, V., Markwald, R. R. Nanotechnology in vascular tissue engineering: from nanoscaffolding towards rapid vessel biofabrication. Trends Biotechnol. 26 (6), 338-344 (2008).
- Mattix, B. M., et al. Janus magnetic cellular spheroids for vascular tissue engineering. Biomaterials. 35 (3), 949-960 (2014).
- Henstock, J., El Haj, A. Controlled mechanotransduction in therapeutic MSCs: can remotely controlled magnetic nanoparticles regenerate bones? Regen Med. 10 (4), 377-380 (2015).
- Fayol, D., et al. Use of magnetic forces to promote stem cell aggregation during differentiation, and cartilage tissue modeling. Adv Mater. 25 (18), 2611-2616 (2013).
- Bartlett, W., et al. Autologous chondrocyte implantation versus matrix-induced autologous chondrocyte implantation for osteochondral defects of the knee: a prospective, randomised study. J Bone Joint Surg Br. 87 (5), 640-645 (2005).
- Batty, L., Dance, S., Bajaj, S., Cole, B. J. Autologous chondrocyte implantation: an overview of technique and outcomes. ANZ J Surg. 81, 18-25 (2011).
- Song, L., Baksh, D., Tuan, R. S. Mesenchymal stem cell-based cartilage tissue engineering: cells, scaffold and biology. Cytotherapy. 6 (6), 596-601 (2004).
- Boeuf, S., Richter, W. Chondrogenesis of mesenchymal stem cells: role of tissue source and inducing factors. Stem Cell Res Ther. 1 (4), 31 (2010).
- Kock, L., van Donkelaar, C. C., Ito, K. Tissue engineering of functional articular cartilage: the current status. Cell Tissue Res. 347 (3), 613-627 (2012).
- Schon, B. S., et al. Validation of a high-throughput microtissue fabrication process for 3D assembly of tissue engineered cartilage constructs. Cell Tissue Res. , (2012).
- Robert, D., et al. Magnetic micro-manipulations to probe the local physical properties of porous scaffolds and to confine stem cells. Biomaterials. 31 (7), 1586-1595 (2010).
- Luciani, N., et al. Successful chondrogenesis within scaffolds, using magnetic stem cell confinement and bioreactor maturation. Acta Biomaterialia. 37, 101-110 (2016).
- Wilhelm, C., Gazeau, F. Universal cell labelling with anionic magnetic nanoparticles. Biomaterials. 29 (22), 3161-3174 (2008).
- Fayol, D., Luciani, N., Lartigue, L., Gazeau, F., Wilhelm, C. Managing magnetic nanoparticle aggregation and cellular uptake: a precondition for efficient stem-cell differentiation and MRI tracking. Adv Healthc Mater. 2 (2), 313-325 (2013).
- Wilhelm, C., Gazeau, F., Bacri, J. C. Magnetophoresis and ferromagnetic resonance of magnetically labeled cells. Eur Biophys J. 31 (2), 118-125 (2002).
- Autissier, A., Le Visage, C., Pouzet, C., Chaubet, F., Letourneur, D. Fabrication of porous polysaccharide-based scaffolds using a combined freeze-drying/cross-linking process. Acta Biomater. 6 (9), 3640-3648 (2010).
- Singh, N., Jenkins, G. J. S., Asadi, R., Doak, S. H. Potential toxicity of superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPION). Nano Reviews. 1, (2010).
- Lee, J. H., Hur, W. Scaffold-free formation of a millimeter-scale multicellular spheroid with an internal cavity from magnetically levitated 3T3 cells that ingested iron oxide-containing microspheres. Biotechnol Bioeng. 111 (5), 1038-1047 (2014).
- Mattix, B., et al. Biological magnetic cellular spheroids as building blocks for tissue engineering. Acta Biomaterialia. 10 (2), 623-629 (2014).
- Mazuel, F., et al. Massive Intracellular Biodegradation of Iron Oxide Nanoparticles Evidenced Magnetically at Single-Endosome and Tissue Levels. ACS Nano. 10 (8), 7627-7638 (2016).
- Kim, J. A., et al. High-throughput generation of spheroids using magnetic nanoparticles for three-dimensional cell culture. Biomaterials. 34 (34), 8555-8563 (2013).
- Shimizu, K., Ito, A., Honda, H. Enhanced cell-seeding into 3D porous scaffolds by use of magnetite nanoparticles. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 77 (2), 265-272 (2006).
- Sensenig, R., Sapir, Y., MacDonald, C., Cohen, S., Polyak, B. Magnetic nanoparticle-based approaches to locally target therapy and enhance tissue regeneration in vivo. Nanomedicine (Lond). 7 (9), 1425-1442 (2012).
- Waldman, S. D., Couto, D. C., Grynpas, M. D., Pilliar, R. M., Kandel, R. A. Multi-axial mechanical stimulation of tissue engineered cartilage: review. Eur Cell Mater. 13, 66-74 (2007).
- Takahashi, I., et al. Compressive force promotes sox9, type II collagen and aggrecan and inhibits IL-1beta expression resulting in chondrogenesis in mouse embryonic limb bud mesenchymal cells. J Cell Sci. 111 (14), 2067-2076 (1998).
- Campbell, J. J., Lee, D. A., Bader, D. L. Dynamic compressive strain influences chondrogenic gene expression in human mesenchymal stem cells. Biorheology. 43, 455-470 (2006).
- Vunjak-Novakovic, G., et al. Bioreactor cultivation conditions modulate the composition and mechanical properties of tissue-engineered cartilage. J Orthop Res. 17 (1), 130-138 (1999).
