Summary
Chondrogenèse de cellules souches nécessite un réglage fin des conditions de culture. Nous présentons ici une approche magnétique pour les cellules de condensation, une étape essentielle pour initier chondrogenèse. De plus, nous montrons que la maturation dynamique dans un bioréacteur applique une stimulation mécanique aux constructions cellulaires et améliore la production de la matrice extracellulaire cartilagineuse.
Abstract
Ingénierie Cartilage reste un défi en raison des difficultés à créer un implant fonctionnel in vitro similaire au tissu natif. Une approche récemment exploré pour le développement de substituts autologues implique la différenciation des cellules souches en chondrocytes. Pour lancer ce chondrogenèse, un degré de compactage des cellules souches est nécessaire; Par conséquent, nous avons démontré la faisabilité de cellules magnétiquement à condensation, à l'intérieur des échafaudages épais et sans échafaudage, en utilisant des sources de champ magnétique miniaturisé attracteurs cellulaires. Cette approche magnétique a également été utilisé pour guider la fusion globale et de construire sans échafaudage, organisé, en trois dimensions (3D) tissus de plusieurs millimètres en taille. En plus d'avoir une taille accrue, le tissu formé par fusion à entraînement magnétique a présenté une augmentation significative de l'expression du collagène II, et on a observé une tendance similaire pour l'expression de l'aggrécane. Comme le cartilage natif a été soumis à des forces tchapeau influencé sa structure 3D, la maturation dynamique a également été réalisée. Un bioréacteur qui fournit des stimuli mécaniques a été utilisé pour la culture des échafauds magnétique ensemencés sur une période de 21 jours. maturation des bioréacteurs largement améliorée chondrogenèse dans les échafauds cellularisées; la matrice extracellulaire obtenue dans ces conditions a été riche en collagène de type II et aggrécane. Ce travail présente le potentiel d'innovation de la condensation magnétique des cellules souches marquées et la maturation dynamique dans un bioréacteur pour une meilleure différenciation chondrogénique, les deux sans échafaudage et à l'intérieur de polysaccharide échafauds.
Introduction
Les nanoparticules magnétiques sont déjà utilisés dans la clinique comme agents de contraste pour l'imagerie par résonance magnétique (IRM), et leurs applications thérapeutiques garder en expansion. Par exemple, il a récemment été démontré que les cellules marquées peuvent être manipulées in vivo en utilisant un champ magnétique externe et peuvent être dirigées et / ou maintenues à un site défini d'implantation 1, 2, 3. Dans la médecine régénérative, ils peuvent être utilisés pour concevoir des tissus organisés in vitro 4, y compris le tissu vasculaire 5, 6, 7, 8 os, cartilage et 9.
Le cartilage articulaire est immergé dans un environnement aseptique, ce qui rend la réparation des composants de la matrice extracellulaire sont très limitées lorsque les dommages se produisent. Pour cette raison, recherch se concentre actuellement sur l'ingénierie des remplacements de cartilage hyalin qui peuvent être implantés sur le site de défaut. Afin de produire un remplacement autologue, certains groupes de recherche étudient l'utilisation de chondrocytes autologues en tant que source de cellules 10, 11, tandis que d' autres mettent l' accent sur la capacité des cellules souches mésenchymateuses (MSC) de se différencier en chondrocytes 12, 13. Dans des études antérieures récapitulés ici, nous avons choisi MSC, comme prélèvement de moelle osseuse est assez simple et ne nécessite pas le sacrifice de chondrocytes en bonne santé, qui risquent de perdre leur phénotype 14.
Une première étape essentielle pour initier la différenciation chondrogénique des cellules souches est leur condensation. Les agrégats cellulaires sont couramment formés en utilisant soit la centrifugation ou la culture de Micromass 15; Cependant, ces procédés de condensation neither présenter le potentiel de créer des agrégats de cellules à l'intérieur des échafaudages d'épaisseur, ni la possibilité de contrôler la fusion des agrégats. Dans cet article, nous décrivons une approche novatrice de condensation des cellules souches en utilisant un marquage magnétique MSC et attraction magnétique. Cette technique a été prouvée pour former des constructions 3D sans échafaudage par l' intermédiaire de la fusion des agrégats avec l'autre pour obtenir un tissu cartilagineux échelle millimétrique 9. ensemencement magnétique de échafauds épais et grand a également permis la possibilité d'augmenter la taille du tissu d'ingénierie, la conception d'une forme plus facilement utile pour l'implantation et la diversification du potentiel pour les applications cliniques de réparation du cartilage. Ici, nous détaillons le protocole pour l'ensemencement magnétique du MSC en supports poreux constitués de polysaccharides naturels, le pullulane et le dextrane, les échafaudages précédemment utilisé pour confiner des cellules souches 16, 17. la différenciation chondrogénique était finally effectuée dans un bioréacteur pour assurer la diffusion des éléments nutritifs et de gaz en continu dans le noyau de la matrice des échafaudages ensemencés avec une densité élevée de cellules. En plus de fournir des éléments nutritifs, les facteurs de croissance chondrogéniques, et le gaz aux cellules, le bioréacteur a offert la stimulation mécanique. Dans l'ensemble, la technologie magnétique pour confiner les cellules souches, combinée à la maturation dynamique dans un bioréacteur, peut améliorer considérablement la différenciation chondrogénique.
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Protocol
1. La construction des dispositifs magnétiques
REMARQUE: Les dispositifs utilisés pour l' ensemencement des cellules varient en fonction de l'application (Figure 1). Pour former des agrégats, le nombre de cellules est limité à 2,5 x 10 5 / agrégat, de sorte que les pointes magnétiques doivent être très minces (750 um de diamètre). Pour les semences 1,8 cm 2/7 échafauds mm d'épaisseur, les aimants doivent être plus grands (3 mm de diamètre) et assureront la migration des cellules à travers les pores de l'échafaudage.
- Construction d'un dispositif à micro-aimants pour la formation d' agrégats (figure 1A)
- Faire des micro-trous avec un foret de 0,8 mm à travers des plaques d'aluminium (3 cm de diamètre et de 6 mm d'épaisseur).
- Insérer une pointe magnétique (750 um de diamètre) dans chaque trou de la plaque.
- Placez ce disque sur un aimant néodyme permanent, qui assure l'aimantation à saturation.
- La construction d'un dispositif d'ensemencement d'échafaudage (
- Couper le polystyrène dur en 2,4 cm 2 carrés.
- Insérez 9 petits aimants (3 mm de diamètre, 6 mm de long) à une distance égale sur une zone de surface de 1,6 cm 2.
- Placez cet appareil sur un aimant néodyme permanent.
2. Tige marquage des cellules
NOTE: Les cellules souches ont été marquées avec 0,1 mM de nanoparticules magnétiques pendant 30 min (2,6 ± 0,2 pg fer / cellule) pour former des agrégats, alors qu'ils ont été marquées avec 0,2 mM de nanoparticules magnétiques pendant 30 min (5 ± 0,4 pg fer / cellule) aux plants échafauds. Ces concentrations de nanoparticules et des temps d'incubation ont été utilisés précédemment et publié pour les cellules MSC et d' autres 18, 19, et il a été déterminé que les nanoparticules touchées ni la viabilité cellulaire , ni la capacité de différenciation MSC. La masse de fer incorporée par les cellules souches a été mesurée par simple-cell magnétophorèse 19, 20.
- Culture de cellules souches mésenchymateuses humaines (MSC) dans un milieu de croissance de cellules souches mésenchymateuses intégral (MSCGM) à 37 ° C et 5% de CO 2 , jusqu'à proximité de la confluence (~ 90%).
- Préparer la solution magnétique de marquage en mélangeant 0,1 ou 0,2 mM d' oxyde de fer revêtu de citrate-maghémite (γFe 2 O 3; core: 8 nm de diamètre) dans du milieu de 5A de McCoy sans sérum modifié au Roswell Park Memorial Institute (RPMI) sans glutamine et contenant 5 mM de citrate de sodium.
- Jeter le milieu, laver les cellules avec du milieu RPMI exempt de sérum sans glutamine, et ajouter 10 ml de solution de nanoparticules d'oxyde de fer par 150 cm 2 flacon de culture, le volume minimum nécessaire pour couvrir toutes les cellules.
- Incuber pendant 30 min à 37 ° C et 5% de CO 2, puis jeter la solution de nanoparticules. Rincer pendant 5 min avec du milieu RPMI exempt de sérum sans glutamine à internaliser le nanoparticles encore attachés à la membrane plasmatique.
- Jeter le milieu RPMI et ajouter 25 ml de milieu complet MSCGM par flacon. Incuber pendant une nuit à 37 ° C et 5% de CO 2.
3. Ensemencement cellulaire magnétique
- préparer fraîchement le moyen chondrogénique utilisant Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) de glucose élevé avec de la L-glutamine par addition de 50 uM d'acide L-ascorbique-2-phosphate, 0,1 uM de dexaméthasone, 1 mM de pyruvate de sodium, 0,35 mM de L-proline, 1% de culture universelle supplément contenant de l'insuline, de la transferrine humaine et de l'acide sélénieux (ITS-Premix), et 10 ng / ml facteur transformant-bêta de croissance 3 (TGF-β3).
- Détacher les cellules magnétiques en utilisant 8 ml de 0,05% de trypsine-EDTA par 150 cm 2 flacon de culture et centrifuger les cellules dissociées à 260 x g pendant 5 min. Aspirer le moyen et compter les cellules remises en suspension.
- Placer une boîte de Pétri de culture cellulaire à fond en verre (35 mm) au-dessus des deux dispositifs magnétiques.
- À Mformer des agrégats agnetically, ajouter 3 ml de milieu chondrogénique à la boîte de Petri et déposer doucement le plus petit volume possible (pas plus de 8 ul) contenant 2,5 x 10 5 cellules marquées par agrégat (jusqu'à 16 agrégats peuvent être déposés). Laisser la boîte de Pétri pendant 20-30 min sans le déplacer, ce qui permet de former des sphéroïdes, puis placer le dispositif complet, y compris la boîte de Petri contenant des 16 agrégats dans l'incubateur à 37 ° C et 5% de CO 2.
- agrégats de contrôle de formulaire suivant le même protocole et remplacer le milieu par du milieu complet sans chondrogénique TGF-β3.
- Pour générer la construction d'agrégat 3D, placer 2 agrégats en contact le jour 8 pour former 8 doublets et d'initier la fusion. Le jour 11, fusion 2 doublets pour former 4 quadruplés. Enfin, les 4 quadruplés fusible le jour 15 pour obtenir la structure finale.
- Dans le même temps, former des agrégats par centrifugation de 2,5 x 10 5 cellules souches marquées à 26015; g pendant 5 min dans des tubes de 15 ml avec 1,5 ml de milieu chondrogénique avec ou sans TGF-β3 (pour l'échantillon et de contrôle, respectivement).
- Pour magnétiquement échafauds de semences, placer chaque échafaudage séché dans une boîte de Petri. Utilisation des échafaudages poreux de polysaccharide en pullulane / dextran 21. Pour chaque échafaudage, diluer 2 x 10 6 cellules souches marquées dans 350 ul de milieu chondrogénique sans TGF-β3 et la pipette soigneusement les cellules sur l'échafaudage.
- Incuber pendant 5 min à 37 ° C pour permettre la pénétration cellulaire complète à l'intérieur de l'échafaudage, puis ajouter doucement 3 ml de milieu chondrogénique avec ou sans TGF-β3 (pour l'échantillon ou du contrôle, respectivement) à la boîte de Petri.
- Incuber l'échafaudage cellularisée sur son dispositif magnétique à 37 ° C et 5% de CO 2 pendant 4 jours pour permettre la migration des cellules à travers les pores de l' échafaudage et de confinement.
- Dans le même temps, les semences échafaudages avec 2 x 10 6
4. Différenciation en chondrocytes
NOTE: Après 4 jours d'incubation, retirez les aimants et continuer la maturation chondrogénique soit dans une boîte de Petri (conditions statiques) ou dans un bioréacteur (conditions dynamiques). Des échantillons de contrôle négatifs sont arrivés à échéance dans des conditions statiques avec un milieu chondrogénique sans TGF-β3.
- Dans des conditions statiques, garder les échafauds cellularisées ou d'agrégats dans la même boîte de Petri. Changer le support chondrogénique deux fois par semaine pendant 21 jours.
- Dans des conditions dynamiques, préparer le bioréacteur.
- Couper un tube en silicone à la longueur appropriée selon le protocole du fabricant.
- Autoclave tous les matériaux: chambre de culture de 500 ml, tubes, rotateur deux voies, et des cages.
- Placez les pièces dans un bioréacteur microbio stérilestation logique de sécurité. Connectez le tuyau aux rotateurs 2 voies et à la chambre de culture suivant les instructions du fabricant.
- Transférer délicatement les échafauds cellularisées dans des cages stérilisées à l'aide d'une spatule stérile. Placez 2 par cage échafauds. Lorsque les cages sont prêts, les insérer dans les aiguilles du couvercle pour les empêcher de se déplacer pendant la rotation supplémentaire. Remplir la chambre de culture avec du milieu chondrogénique et le fermer avec le couvercle contenant les cages.
- Mettre en marche la pompe péristaltique pour remplir le tube avec le milieu chondrogénique et pour éliminer les bulles d'air.
- Placer et fixer la chambre remplie dans le moteur du bioréacteur et tourner sur l'ordinateur, qui commande les rotations à la fois du bras et de la chambre.
- Appliquer une vitesse de rotation de 5 tours par min (rpm) sur le bras et la chambre. Régler la pompe péristaltique à un débit de 10 tours par minute pour l'alimentation continue des échafaudages cellularisées.
REMARQUE: avant l'extraction de l'ARN, digérer les échafauds avec une solution enzymatique.
- Préparer 1 ml de solution enzymatique par addition de 100 ul de pullulanase (40 U / ml) et 50 ul de dextranase (60 mg / ml) à 850 ml de milieu DMEM exempt de sérum.
- Rincer les échafauds deux fois avec du milieu DMEM exempt de sérum, éliminer le milieu et ajouter 800 ul de la solution enzymatique par échafaudage. Incuber pendant 15-30 minutes à 37 ° C sous agitation douce.
- Lorsque l'échafaudage est complètement dissous, le transfert de la solution contenant les cellules à un tube de 1,5 ml, centrifuger à 300 g pendant 10 min, aspirer soigneusement le milieu, rincer deux fois avec stérile 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS), centrifuger à 300 x g pendant 10 min, et remettre en suspension les cellules dans la solution d'isolement d'ARN.
- Pour extraire l'ARN à partir des agrégats, placer les sphéroïdes dans la solution d'isolement d'ARN etécraser complètement les utilisant un homogénéisateur avant d'effectuer l'extraction d'ARN.
- Isoler l'ARN en utilisant un kit d'extraction d'ARN total selon les instructions du fabricant.
- Synthétiser de l'ADN complémentaire à partir de 400 ng d'ARN total en utilisant la transcriptase inverse selon les instructions du fabricant, en utilisant des amorces aléatoires de 250 ng, 1 pi de mélange de dNTP (10 mM chacun), et 40 U / ml d'inhibiteur de RNase; le volume final de la réaction est de 20 pi. A la fin de la réaction, ajouter 80 ul d'eau distillée pour obtenir un volume final de 100 pi.
- Pour la réaction en chaîne par polymérase quantitative (PCR), en utilisant un mélange de PCR contenant un réactif fluorescent pour quantifier l'expression relative des gènes d'intérêt, tels que l'aggrécane (AGC) et le collagène II (Col II), avec 10 × ADNc dilué. Normaliser les niveaux d'expression génique avec le gène ribosomique de référence protéine, Grand, P0 (RPLP0). Effectuer les calculs avec le 2 - formule AACtOù AACt = ACt de l'état différencié - signifie ACt de condition de commande, et chaque ACt représente le CT du gène d'intérêt - le CT du gène de référence (RPLP0).
- Déterminer les mesures statistiques comme les valeurs moyennes ± l'écart-type de la moyenne (SEM). Effectuer l'analyse avec n ≥ 2 expériences indépendantes. Utilisez le test t de Student pour analyser les différences statistiques entre les granulés centrifugés et magnétiques (* fusions p <0,05). Déterminer l'importance avec pour analyser les différences statistiques entre les échafauds différenciés et avec l'échafaudage de contrôle test de Kruskal-Wallis (une ANOVA non paramétrique) (* p <0,05).
6. Analyse anatomopathologique
- Rincer les échafaudages cellularisées ou d'agrégats avec 1 x PBS stérile, les fixer dans 10% de solution de formaline pendant 1 h à température ambiante, puis rincer avec 1 x PBS.
- Retirez le PBS, intégrer les échantillons dans cuttin optimaleg composé de température (OCT), et les congeler dans un bain d'isopentane immergé dans de l'azote liquide. Conserver l'échantillon à -20 ° C. Couper les échantillons avec un cryostat pour obtenir 8 um cryosections pour les agrégats ou de 12 pm pour les échafaudages cellularisées.
- Colorer les cryosections avec une solution de bleu de toluidine à 0,5% pendant 2 minutes, rincer à l'eau du robinet, déshydrater avec 100% d'éthanol, en utilisant du toluène clarifier, et monter les lames avec un support de montage pour la microscopie optique.
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Representative Results
Tout d' abord, les agrégats peuvent être formés individuellement à l' aide des micro-aimants par dépôt de 2,5 x 10 5 cellules souches marquées (Figure 2A). Ces agrégats individuels (~ 0,8 mm de diamètre) peuvent ensuite être fusionnées dans des structures plus grandes, grâce à la fusion séquentielle, induite magnétiquement. Par exemple, le jour 8 de maturation chondrogénique, les agrégats ont été placés en contact deux à deux pour former des doublets; quadruplets ont été assemblés au jour 11 en fusionnant 2 doublets; et enfin, le jour 15, les 4 quadruplets sont fusionnées pour former une construction 3D contenant 16 des agrégats formés initialement, avec un total de 4 x 10 6 cellules (~ 4 mm) (Figure 2B). En second lieu, la même technique d'attraction magnétique a été utilisé pour former des agrégats de cellules dans échafauds. Les échafaudages ont été ensemencées sur le dispositif magnétique et ont montré une forte densité de cellules condensés dans les pores de l'échafaudage, à des endroits précis de micro-aimants (figure 2C). En revanche, lorsque les cellules ont été ensemencées dans un échafaudage sans attraction magnétique (ensemencement passif), ils se sont révélés être répartis uniformément. Échafaudages cellularisées ont été ensuite insérés dans des cages (figure 3a) fixée à la chambre du bioréacteur pour effectuer le processus chondrogénique dans des conditions de maturation dynamique (figure 3B). Un tel bioréacteur améliore les échanges de nutriments et de gaz et fournit une stimulation mécanique par transduction. La vitesse de rotation des deux bras et la chambre a été ajustée à 5 tours par minute, comme recommandé par le constructeur pour la régénération des tissus mous 3D. Une pompe péristaltique qui assure une alimentation continue de milieu a été réglée à 10 tours par minute.
Pour toutes les conditions d'organisation cellulaire (agrégats fusionnés et l'ensemencement à l'intérieur des échafaudages) et la maturation des tissus (à l'intérieur ou sans un bioréacteur), l'expression des gènes a été analysée au jour 25. Le tissu formé par fusion magnétique a montré une signiaugmentation de ficant dans l' expression du collagène II par rapport au culot obtenu par centrifugation (figure 4A), avec une tendance à l' augmentation de l' expression de l' aggrécane. Pour échafauds cellularisées, nous avons obtenu une augmentation de aggrécane et d'expression significative collagène de type II pour le collagène II-magnétique lorsque l'ensemencement a été utilisé, par rapport aux échafauds ensemencés sans forces magnétiques. En outre, l'expression des deux gènes était beaucoup plus élevée (significatif pour Col II) lors de l' ensemencement magnétique a été combiné avec la différenciation dynamique (figure 4B).
Des analyses histologiques ont également été réalisées, par exemple en utilisant une tache bleue toluidine pour révéler les glycosaminoglycanes (GAG). La fusion magnétique séquentielle des 16 agrégats présentait un dépôt abondant de GAG, comme en témoigne la couleur bleu-violet (figure 5A). Pour les échafauds, seuls les tête de série magnétique ont été colorées avec du bleu de toluidine. GAG content était plus élevé lorsque les échafauds ont été différenciés dans un bioréacteur (figure 5B) plutôt que statique (figure 5C). Pris ensemble, ces résultats démontrent le potentiel d'agrégation magnétique et l'ensemencement magnétique dans échafauds pour améliorer chondrogenèse. Il indique également que les conditions de maturation dynamique au sein du bioréacteur sont beaucoup plus favorables à la différenciation efficace.
Figure 1. La construction des dispositifs magnétiques. (A) Exemple d'un dispositif magnétique pour la formation d' agrégats: la plaque d'aluminium a été foré des trous (0,8 um de diamètre) et de conseil ont été insérés dans chaque trou et ensuite placé sur un aimant néodyme permanent, qui assure l' aimantation à saturation. (B) Dispositif magnétique pour ensemencer le squelette: polystyrène dur (24 mm 2) avec 9 trous réalisés à la main étaitplacé sur un aimant néodyme permanent, qui assure l'aimantation à saturation. Les petits aimants (3 mm de diamètre) ont ensuite été introduits dans chaque trou pour former le dispositif. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2. marquage magnétique des cellules souches et l' ensemencement. (A) Les cellules souches sont marquées par des nanoparticules d'oxyde de fer pendant 30 min à 37 ° C. (B) sphéroïdes ont été formés à partir de cellules marquées attirés par un réseau de 16 micro-aimants. Les agrégats ont été fusionnés en quadruplets le jour 11 par fusion des doublets formés 3 jours avant. Les quadruplets ont été ensuite fusionnées sur 15 jours pour construire le génie tissulaire finale. (C) Un échafaudage, placés dans un plat à fond de verre, a été ensemencée avec ousur les forces magnétiques. Le jour 4, les taches de cellules souches compactés ont été observées dans l'échafaudage magnétique tête de série, tandis que les cellules semblaient réparties uniformément dans l'échafaudage tête de série sans aimant. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3. maturation dynamique des échafauds cellularisées. (A) Après l' ensemencement magnétique ou passive, échafauds cellularisées ont été mis dans des cages afin d' éviter des perturbations. (B) Cages fixes, en utilisant les aiguilles de la capsule, ont été placés dans la cuve du bioréacteur rempli avec un milieu chondrogénique. Le bioréacteur appliqué rotation biaxiale à une vitesse contrôlée de façon indépendante (1 à 12 tours par minute et de 1 à 35 tours par minute pour le bras et la chambre, respectivement). Une pompe péristaltique fournie en continu médium. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4. Expression de gènes spécifiques sur chondrogéniques jour 25. (A) La fusion induite magnétiquement de sphéroïdes MSC a montré une augmentation significative du collagène de type II par rapport au culot formé par centrifugation. * Indique une différence statistique en utilisant le test t de Student (valeur p <0,05). (B) L'expression de l' aggrécane et le collagène II sont nettement augmenté dans les échafaudages différenciés avec une combinaison de semis magnétique et la maturation dynamique dans un bioréacteur. L'expression génique a été normalisée à l'ARNm RPLP0 et exprimée en unités arbitraires par rapport au contrôle (~ 1 ± SEM). Les résultats sont présentés en moyenne ± SEM de deux à quatre expériences indépendantes. * denoTES une différence statistique en utilisant le test de Kruskal-Wallis (à une voie ANOVA non paramétrique essai) (p <0,05). (-): semis sans aimant; (+): Ensemencement avec des forces magnétiques. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5. anatomopathologique coloration des glycosaminoglycanes le jour 25. dépôts glycosaminoglycanes (GAG) sont attestés par coloration bleu-violet. (A) Une tache de bleu de toluidine positive a été observée dans les cryosections 8 um de la structure cartilagineuse finale obtenue à partir de la fusion séquentielle de 16 agrégats. Les magnétiquement cryosections des échafaudages 12 um ensemencés après statique (B) ou des conditions dynamiques (C) ont clairement montréque la teneur en GAG était plus élevée dans échafauds différenciés dans un bioréacteur. Les flèches indiquent des agrégats de cellules différenciées. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Tout d'abord, parce que les techniques présentées ici reposent sur l'intériorisation de nanoparticules magnétiques, une question importante est le résultat des nanoparticules une fois qu'ils se localisent dans les cellules. Il est vrai que les nanoparticules de fer peuvent déclencher une toxicité potentielle ou la capacité de différenciation réduite en fonction de leur taille, le revêtement et le temps d'exposition 19, 22. Cependant, plusieurs études ont montré aucun impact sur la physiologie cellulaire lorsque des nanoparticules de fer encapsulées ont été utilisés 23 sous la forme d'magnetoferritin, une nanoparticule magnétique biologique 24 ou ont été utilisés avec un simple revêtement citrate et des concentrations adéquates 18. De plus, lorsque des nanoparticules d'oxyde de fer ont été utilisés dans des conditions similaires à celles décrites dans le présent document (avec MSC et pour chondrogenèse), nous avons démontré récemment qu'une dégradation rapide et presque totale de la nanoparticules se produit dans les endosomes dans environ 10 jours après la constitution cellulaire et la formation MSC sphéroïde. Fait intéressant, cette dégradation massive a été associée au stockage efficace du fer libre dans la protéine ferritine et a eu un impact très limité sur le métabolisme du fer cellulaire, de bon augure pour les futures applications cliniques 25.
Un autre point critique est l'exigence de compactage cellulaire pour initier chondrogenèse. Généralement, la condensation de cellules est obtenue par centrifugation; toutefois, cette méthode est limitée par un faible nombre de cellules (pas plus de 2,5 x 10 5 cellules). Passé ce nombre, les nutriments et les gaz ne peuvent pas diffuser au centre des agrégats, ce qui déclenche une nécrose des cellules. Ici, la condensation magnétique de cellules souches marquées en agrégats apparaît comme une méthode importante pour former des constructions 3D pour la régénération du tissu cartilagineux. Une telle procédure magnétique a été utilisé par d'autres auteurs àconstruire sphéroïdes 3D: par lévitation magnétique avec un aimant placé sur le dessus de la plaque après la dissociation des cellules 23 avec des broches ou de fer pour localiser le champ magnétique 26. Cependant, la lévitation magnétique ne semble pas être adapté à d'autres étapes de fusion globale. En revanche, la méthode magnétique proposée ici, nous pouvons contrôler toutes les étapes de fusion pour obtenir une étape par étape la construction des tissus du cartilage. En bref, ce procédé multi-étape commence par le confinement des cellules souches dans des blocs de construction d'agrégats et est suivi par la fusion de ces blocs en une structure plus grande. Les étapes essentielles de cette tige sans échafaudage procédure d'agrégation cellulaire sont les suivantes: d'abord, on doit former chaque agrégat avec un volume aussi faible de cellules que possible et, deuxièmement, il faut contrôler les étapes de fusion pour éviter la formation d'une seule grande agrégat. Le tissu obtenu ici a été riche en collagène de type II et aggrécane. Il a présenté aussi le Advantages d'avoir la géométrie et la taille souple et d'être sans échafaudage.
L'approche magnétique a également été utilisé pour guider les cellules souches dans les échafauds épaisses et grandes; une autre alternative pour la conception de différentes formes et tailles. L'étape critique est ici pour semer les échafauds avec un volume approprié de cellules: ni trop peu pour avoir une répartition homogène globale des cellules, ni trop pour éviter toute perte de cellules. Les forces magnétiques ont déjà été utilisées pour attirer et retenir les cellules dans les échafauds et pour améliorer l' ensemencement des cellules 27, 28. Ici, la condensation cellulaire suffisante dans les pores des échafauds de polysaccharide conduit à chondrogenèse avec succès. La production de la matrice extracellulaire a été nettement améliorée lorsque les échafauds magnétiquement cellularisées ont été soumis à des stimuli de stress de transduction / de cisaillement fournis par le bioréacteur grâce à sa rotation bi-axial. Il a été démontré dans d'autres études qui Mulconditions de chargement ti-axiaux ont amélioré la qualité des tissus formés à partir de chondrocytes 29. Ce nouveau concept de bioréacteur présente un gain réel par rapport aux techniques existantes, où ne sont appliquées que les forces de compression 30, 31, 32.
En conclusion, pour la différenciation chondrocytaire, l'utilisation de confinement magnétique des cellules souches marquées pour former et manipuler des agrégats ainsi que de semences échafaudages permis la création de cartilage millimétriques taille des constructions cellulaires. En outre, la combinaison ensemencement magnétique des cellules avec une différenciation dynamique fournit un outil précieux pour les applications en médecine régénérative.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier QuinXell Technologies et CellD, en particulier Lothar Grannemann et Dominique Ghozlan pour leur aide dans le bioréacteur. Nous remercions Catherine Le Visage, qui nous a fourni les échafauds de polysaccharide pullulane / dextran. Ce travail a été soutenu par l'Union européenne (projet ERC-2014-cog MATISSE 648779) et par le AgenceNationalede la Recherche (ANR), France (projet ANR-11 MagStem SVSE5).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Iron oxide (maghemite) nanoparticules (γ-Fe2O3) | PHENIX - University Paris 6 | Made and given by C. Ménager | Mean diameter of 8.1 nm and negative surface charge |
| Polysaccharide Pullulan/Dextran scaffolds | LIOAD - University Nantes | Made and given by C. Le Visage | Prepared from a 75:25 mixture of pullulan/dextran in alkaline conditions (10 M NaOH). Porosity: 185-205 µm; Thickness: 7 mm; Surface area: 1.8 cm2. |
| TisXell Regeneration System | QuinXell Technologies | QX900-002 | Biaxial bioreactor with 500 mL culture chamber |
| Cage for scaffolds: Histosette II M492 | VWR | 720-0909 | |
| Mesenchymal Stem Cell (MSC) | Lonza | PT-2501 | Three independant batches have been used |
| MSCGM BulletKit medium | Lonza | PT-3001 | For the complete medium, add the provided BulletKit (containing serum, glutamine and antibiotics) to the MSCGM medium |
| DMEM with Glutamax I | Life Technologies | 31966-021 | No sodium pyruvate, no HEPES |
| RPMI medium 1640, no Glutamine | Life Technologies | 31870-025 | No sodium pyruvate, no HEPES |
| PBS w/o CaCl2 w/o MgCl2 | Life Technologies | 14190-094 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 25300-054 | |
| Penicillin (10,000 U/mL) / Streptomycin (10,000 µg/mL) | Life Technologies | 15140-122 | |
| ITS Premix Universal Culture Supplement (20x) | Corning | 354352 | |
| Sodium pyruvate solution 100 mM | Sigma | S8636 | |
| L-Ascorbic Acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | Prepare the concentrated solution (25 mM) in distilled water extemporaneously |
| L-Proline | Sigma | P5607 | Prepare the 175 mM stock solution diluted in distilled water and store at 4 °C |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | Prepare the 1 mM stock solution diluted in Ethanol 100% and store at -20 °C |
| TGF-beta 3 protein 10 µg | Interchim | 30R-AT028 | |
| Tri-sodium citrate | VWR | 33615.268 | Prepare the 1 M stock solution diluted in distilled water and store at 4 °C |
| Pullulanase from Bacillus acidopullulyticus | Sigma | P2986 | |
| Dextranase from Chaetomium erraticum | Sigma | D0443 | |
| NucleoSpin RNA Extraction Kit | Macherey-Nagel | 740955.5 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Life Technologies | 18064-014 | |
| Random Primer - Hexamer | Promega | C1181 | 500 µg/mL: Use diluted 1/2 and put 1 µL per sample |
| Recombinant RNAs in ribonuclease inhibitor | Promega | N2511 | 40 U/µL: put 1 µL per sample |
| PCR nucleotide dNTP mix (10 mM each) | Roche | 10842321 | |
| SyBr Green PCR Master Mix | Life Technologies | 4368708 | |
| Step One Plus Real-Time PCR System | Life Technologies | 4381792 | |
| Formalin solution 10% neutral buffered | Sigma | HT5012 | |
| OCT solution | VWR | 361603E | |
| Isopentane | Sigma | M32631 | |
| Toluidine blue O | VWR | 1.15930.0025 | |
| Ethanol absolute | VWR | 20821.310 | |
| Toluene | VWR | 1.08323.1000 | |
| Mounting medium Pertex | Histolab | 840 | |
| RPLP0 Primer for qPCR | Eurogentec | 5'-TGCATCAGTAC CCCATTCTATCAT-3'; 5'-AAGGTGTAATC CGTCTCCACAGA-3' |
|
| Aggrecan Primer for qPCR | Eurogentec | 5'-TCTACCGCTGCGAGGTGAT-3'; 3'-TGTAATGGAACACGATGCCTTT-5' | |
| Collagen II Primer for qPCR | Eurogentec | 5'-ACTGGATTGACCCCAACCAA-3'; 3'-TCCATGTTGCAGAAAACCTTCA-5' |
References
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