Here, we present a protocol for hydraulic extrusion of the spinal cord as well as identification and isolation of specific dorsal root ganglia (DRGs) in the same rodent. Compared to standard spinal cord isolation methods, this method is significantly faster and reduces the risk of tissue damage.
Traditionally, the spinal cord is isolated by laminectomy, i.e. by breaking open the spinal vertebrae one at a time. This is both time consuming and may result in damage to the spinal cord caused by the dissection process. Here, we show how the spinal cord can be extruded using hydraulic pressure. Handling time is significantly reduced to only a few minutes, likely decreasing protein damage. The low risk of damage to the spinal cord tissue improves subsequent immunohistochemical analysis. By performing hydraulic spinal cord extrusion instead of traditional laminectomy, the rodents can further be used for DRG isolation, thereby lowering the number of animals and allowing analysis across tissues from the same rodent. We demonstrate a consistent method to identify and isolate the DRGs according to their localization relative to the costae. It is, however, important to adjust this method to the particular animal used, as the number of spinal cord segments, both thoracic and lumbar, may vary according to animal type and strain. In addition, we illustrate further processing examples of the isolated tissues.
המטרה הכללית של שיטה זו היא לבודד את חוט השדרה וכן לזהות ולבודד DRGs 1, 2. שחול הידראולי של חוט השדרה היא שיטה מהירה יותר באופן משמעותי מאשר בדרך המסורתית של בידוד חוט השדרה על ידי laminectomy, כלומר על ידי שבירת חוליות עמוד השדרה אחת בכל פעם, ושיטה זו מפחיתה את הסיכון של נזק לרקמות שנגרם על ידי תהליך לנתיחה 3, 4 . DRGs עלול להיות קשה לזהות. זיהוי נכון חשוב מאוד עבור בדיקת רקמות, למשל בעקבות פציעת גיד הנשה. על ידי מספור DRGs פי ביחס לוקליזציה שלהם costae, DRGs ניתן לזהות באופן עקבי.
רקמות המבודדים על ידי הטכניקות הפגינו כאן ניתן ליישם במגוון רחב של ניתוחים כולל מערבי סופג 5,6, qPCR 7 והכתים 8 immunohistochemical.
כאשר זיהוי DRGs, חשוב לקחת בחשבון כי מספר מגזרי חוט שדרה ידוע להשתנות עם סוג חיה ומתח 9, 10, 11. היתרונות בביצוע שיטה זו בעכברים הם המספר הגבוה של הגירסות זמינות מהונדס גנטיות ואת הוצאות הדיור הנמוכות יחסית. היתרונות בשימוש חולדות הם התשואה גבוהה יחסית רקמות ואם מעורבי פציעות עצבות, ההליך יהיה הקל עם גודל.
אם עמוד השדרה מופר, למשל על ידי נקע בצוואר הרחם, חוט השדרה יהיה לפצל במהלך שחול. אם חוט השדרה לא ניתן נמתח, עמוד השדרה ניתן גזוז מעט בשני קצותיו וניסיון שהחול ניתן לחזור. במקרה חוט השדרה כולו נדרש לניתוח נוסף, כלומר מורכב של הרחבת צוואר הרחם, כמו גם את ההרחבה המותני, עמוד השדרה צריך להיות מטופח רק במעט. אם רק את ההרחבה המותני נדרשת לניתוח נוסף, חוט השדרה צריך להיות מטופח לפי הפרוטוקול הנוכחי. עמוד השדרה צריך להיות יישר באמצעות קצות האצבעות כדי להקל שחול.
הפרוטוקול הוא ישים מכרסמים מכל הגילים מודגם כאן על ידי עכבר בוגר (8 שבועות), גור עכבר (5 ימים) חולדה בוגרת (10 שבועות). בהתאם לסוג ומתח חיה, מספר סעיפים ובית החזה המותני עשוי להשתנות 9, </sup> 10, 11. בהתאם חלבונים להיות מנותח, מכרסמים מבוגרים ניתן perfused עם פתרונות אנזים-עיכוב לפני המתת חסד. אם ביצוע ניסוי מעורבים פגיעה עצבית חד צדדי, חוט השדרה ניתן לפצל הצדדים ipsilateral ו הנגדי באמצעות פינצטה Ultra- בסדר מיד לאחר שחול. יתר על כן, כל צד יכול להיות נחלק גב ועל צדדי גחון. הרקמה אז יכול להיות מעובד על ניתוחים נוספים, המערבי סופג למשל.
זלוף קיבוע transcardial עם PFA לפני שחול חוט שדרה יש להימנע, כמו זה הופך את חוט השדרה שאינו גמיש ומונע שחול הידראולי חוט שדרה. שחול חוט שדרה הידראולי יקרע את השורשים מגבים. בניסויים שבם שורשים הגבו מצורפים נחוצים, laminectomy מומלץ. יתר על כן, קרומי המוח השדרה הם איבדו ידי שחול הידראולי, אשר יכול להימנע על ידי laminectomy תקן <sup class = "Xref"> 3.
שחול הידראולי של חוט השדרה ובידוד DRG יכול גם להתבצע באמצעות מלאכותי הנוזל השדרתי מחומצן (ACSF) במקום קר כקרח PBS. שימוש ACSF מאפשר שימור של הרקמה המבודדת בסביבה פיזיולוגית טוב יותר, וזה חשוב במיוחד במקרה של הקלטות הבאות אלקטרו 12, 13. חלופה ACSF יכול להיות PBS המכיל 1 גרם / גלוקוז L עבור הדור של תרבויות DRG העיקרי 14.
שחול הידראולי של חוט השדרה היא שיטה משמעותית מהר יותר מאשר בדרך המסורתית של בידוד חוט השדרה על ידי laminectomy, צמצום זמן טיפול רקמות ולכן להקטין את הסיכון לנזק חלבון. זלוף עם מקבע לפני לבודד את חוט השדרה על ידי laminectomy עשויה להפחית את הסיכון של נזק לרקמות במהלך דיסקציה במהלך ההסרה הסופית שלחוט השדרה של עמוד השדרה. עם זאת, קיבעון רקמות מונע ישימותה ניתוחים כגון מערבי סופג. תשואות שחול הידראוליות רקמות ניזוק מבני 3 מתאימות למגוון רחב יותר של ניתוחים.
זיהוי עקבי של DRGs עלול להיות קשה. עם זאת, זה חיוני עבור בדיקת רקמות, למשל בעקבות פציעת גיד הנשה. על ידי מספור DRGs פי ביחס לוקליזציה שלהם costae, DRGs ניתן לזהות באופן עקבי. הכתמה של רקמת חוט שדרה וכן של DRGs יכולה להיות מותאמת על ידי ביצוע וריאציות טיפול רקמות המאוירות מפורטות צעד פרוטוקול 7.
The authors have nothing to disclose.
We would like to acknowledge David Kiel, Aarhus University, for filming and editing. VirtualDub software was used for processing of microscope video sequences. We thank the Danish Research Institute of Translational Neuroscience – DANDRITE, Nordic EMBL Partnership, for access to equipment and the Aarhus University Research Foundation, EU 7FP project PAINCAGE, Det Frie Forskningsrad (DFF) and The Lundbeck Foundation for funding.
Bonn scissors, extra fine, straight, 8.5 cm | F.S.C. (Fine Science Tools) | # 14084-08 | For cutting open the spinal cord prior to isolation of DRGs (adult mouse, adult rat); Other manufacturer may be used |
Centrifuge | Eppendorf | # 5427 R | For centrifugation of homogenized tissue |
Cryostat microtome | Leica Biosystems | # CM 3050 S | For cutting the embedded tissue prior to staining; Other model and manufacturer may be used |
Forceps, Dumont, # 3 | F.S.C. (Fine Science Tools) | # 11231-30 | For handling of spinal cord after extrusion; Other manufacturer/type may be used |
Forceps, Dumont, # 5 | F.S.C. (Fine Science Tools) | # 11252-20 | For isolation of DRGs (adult mouse, adult rat, pup); Other manufacturer may be used |
Isoflurane (furane) IsoFlo Vet 100 % | Abbott | # 002185 | For euthanization; Other manufacturer may be used; CAUTION: toxic |
Iso-pentane GPR rectapur | VWR chemicals | # 24872.298 | For snap-freezing of tissue; Other manufacturer may be used; CAUTION: toxic |
Microtome | Leica Biosystems | # RM 2155 | For sectioning of paraffin embedded tissue; Other model and manufacturer may be used |
Paraffin wax pellets | Sigma-Aldrich | # 76243 | For paraffin embedding; Other manufacturer may be used |
Paraffin tissue embedding station | Leica Biosystems | # EG1160 | For paraffin embedding of tissue for later sectionning; Other model and manufacturer may be used |
Pellet pestel, motor cordless | Sigma-Aldrich | # Z359971-1EA | For mechanical homogenization of isolated tissue prior to Western blotting; Other manufacturer may be used |
Petri dish, 35 mm | Thermo Fischer Scientific | # 121V | For storage of isolated DRGs; Other manufacturer and size may be used |
Petri dish, 100 mm | Sigma-Aldrich | # P7741 | For spinal cord extrusion; Other manufacturer and size may be used |
Phosphatase inhibitor, Phosstop | Sigma-Aldrich | # 04906845001 | Phosphatase inhibitor cocktail for addition to TNE-lysis buffer if needed; Other manufacturer may be used |
Pipette tip, 1-200 μl, no filter | Sarstedt | # 70.1189.105 | For hydraulic extrusion; Other manufacturer may be used |
Protease inhibitor, Complete | Sigma-Aldrich | # 05892791001 | Protease inhibitor cocktail for addition to TNE-lysis buffer if needed; Other manufacturer may be used |
RNAlater solution | Sigma-Aldrich | # R0901 | For RNA stabilization for storage; Other manufacturer may be used |
Rneasy Protect Mini KiT | Qiagen | # 74124 | For RNA isolation; Other manufacturer may be used |
Scalpel; Swann-Morton surgical blade no. 11 | Swann-Morton | # REF0203 | For isolation of spinal cord lumbar area; Other manufacturer/type may be used |
Scissors, straight, type 3, 25 mm cutting edge | Bochem | # 4070 | For isolation of spine; Other manufacturer/type may be used |
Scissors, 130 mm cutting edge | Hounisen | # 1902.0130 | For isolation of spinal cord (adult rat) |
Spring scissors, straight, 8 mm cutting edge | F.S.C. (Fine Science Tools) | # 15009-08 | For cutting open the spinal column prior to isolation of DRGs (pup) and for isolation of DRGs (adult mouse, adult rat, pup); Other manufacturer may be used |
Standard syringes, 2.5 ml, 5 ml, 10 ml | Terumo | # SS02SE1; # SS05SE1; # SS10SE1 | For hydraulic extrusion; Other manufacturer may be used |
Stereomicroscope MZ12.5 with objective 1x and eyepiece 10x | Leica | # 10446370 | Other manufacturer/type may be used |
Sterile PBS | GIBCO | # 10010-015 | For hydraulic extrusion; Can also be made according to standard protocols |
Syringe needle 23 G x 1", 0.6 x 25 mm | Terumo Neolus | # NN-2325R | For hydraulic extrusion in pups; Other manufacturer/type may be used |
Syringe needle 18 G x 1 1/2, 1.2 x 40 mm | Terumo Neolus | # NN-1838S | Alternative to pipette tip for hydraulic extrusion in adult mice; Other manufacturer may be used |
Tissue-Tek | Sakura | # 4583 | Tssue embedding material for later cryosectionning |
TNE-lysis buffer | VWR chemicals | # 10128-582 | For tissue lysis prior to Western blotting; Other manufacturer may be used; Can also be made according to standard protocols |