Systemic and localized zebrafish infection models for human influenza A virus are demonstrated. Using a systemic infection model, zebrafish can be used to screen antiviral drugs. Using a localized infection model, zebrafish can be used to characterize host immune cell responses.
Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare burden. The principle strategy to curtail infections is yearly vaccination. In individuals who have contracted influenza, antiviral drugs can mitigate symptoms. There is a clear and unmet need to develop alternative strategies to combat influenza. Several animal models have been created to model host-influenza interactions. Here, protocols for generating zebrafish models for systemic and localized human influenza A virus (IAV) infection are described. Using a systemic IAV infection model, small molecules with potential antiviral activity can be screened. As a proof-of-principle, a protocol that demonstrates the efficacy of the antiviral drug Zanamivir in IAV-infected zebrafish is described. It shows how disease phenotypes can be quantified to score the relative efficacy of potential antivirals in IAV-infected zebrafish. In recent years, there has been increased appreciation for the critical role neutrophils play in the human host response to influenza infection. The zebrafish has proven to be an indispensable model for the study of neutrophil biology, with direct impacts on human medicine. A protocol to generate a localized IAV infection in the Tg(mpx:mCherry) zebrafish line to study neutrophil biology in the context of a localized viral infection is described. Neutrophil recruitment to localized infection sites provides an additional quantifiable phenotype for assessing experimental manipulations that may have therapeutic applications. Both zebrafish protocols described faithfully recapitulate aspects of human IAV infection. The zebrafish model possesses numerous inherent advantages, including high fecundity, optical clarity, amenability to drug screening, and availability of transgenic lines, including those in which immune cells such as neutrophils are labeled with fluorescent proteins. The protocols detailed here exploit these advantages and have the potential to reveal critical insights into host-IAV interactions that may ultimately translate into the clinic.
Enligt Världshälsoorganisationen (WHO), influensavirus infekterar 5-10% av vuxna och 20-30% av barn per år och orsakar 3-5 miljoner fall av svår sjukdom och upp till 500.000 dödsfall i världen en. Årliga vaccinationer mot influensa fortfarande det bästa alternativet för att förebygga sjukdom. Ansträngningar som WHO: s globala handlingsplan har ökat säsongsvaccinanvändning, vaccin produktionskapaciteten, samt forskning och utveckling i mer potenta vaccinstrategier för att minska sjuklighet och dödlighet i samband med säsongs utbrott influensa 2. Antivirala läkemedel som neuraminidashämmare (t.ex. zanamivir och Oseltamivir) finns i vissa länder och har visat sig effektiv i förmildrande symtom, när de administreras inom de första 48 h av uppkomsten 3, 4, 5. Trots de globala ansträngningarna, inneslutning av säsongsinfluensa outbreaks fortfarande en formidabel utmaning vid denna tid, som influensavirus antigen drift överstiger ofta nuvarande förmåga att anpassa sig till förändrade virusets 6. Vaccinstrategier inriktade nya virusstammar måste utvecklas i förväg och ibland blir mindre än optimalt effektiva på grund av oförutsedda förändringar i de typer av påfrestningar som så småningom dominerar i en influensasäsong. Av dessa skäl finns det ett klart behov av att utveckla alternativa behandlingsstrategier för att innesluta infektioner och minska dödlighet. Genom att uppnå en bättre förståelse av samspelet värd virus, kan det vara möjligt att utveckla nya läkemedel mot influensa och adjuvant terapi 7, 8.
Den mänskliga värden-influensa A-virus (IAV) interaktionen är komplex. Flera djurmodeller för human IAV infektion har utvecklats för att få insikt i interaktionen värd virus, including möss, marsvin, bomullsråttor, hamstrar, illrar och makaker 9. Samtidigt som den ger viktiga data som har ökat förståelsen av värd IAV dynamik, varje modellorganism besitter betydande nackdelar som måste beaktas när man försöker översätta resultaten i humanmedicinen. Till exempel möss, som är den mest använda modellen inte lätt utveckla IAV-inducerade infektionssymtom när de infekteras med mänsklig influensa isolat 9. Detta beror på att möss saknar den naturliga tropism för humana influensaisolat sedan mus epiteliala celler uttrycker a-2,3 sialinsyra-bindningar i stället för de α-2,6 sialinsyra-bindningar som uttrycks på humana epitelceller 10. Hemagglutinin proteiner som är närvarande i humant IAV isolat gynnsamt binda och ange värdceller som bär a-2,6 sialinsyra bindningar genom receptormedierad endocytos 9, 11, </supp> 12, 13. Som en följd av detta är det nu accepterat att för att utveckla musmodeller för mänsklig influensa, måste försiktighet iakttas för att para ihop rätt stam av mus med lämplig stam av influensa i syfte att uppnå sjukdoms fenotyper som rekapitulera aspekter av mänskliga sjukdomar. I kontrast, epitelceller i övre luftvägarna hos illrar besitter a-2,6 sialinsyra-bindningar som liknar humana celler 14. Infekterade illrar delar många av de patologiska och kliniska egenskaper som observerats i den mänskliga sjukdomen, inklusive patogenicitet och överförbarhet av influensavirus 14 mänskliga och avian, 15. De är också mycket mottagliga för vaccineffektivitetsstudierna. Ändå iller modell för human influensa har flera nackdelar huvudsakligen relaterade till deras storlek och kostnad för djurhållning som gör förvärv av statistiskt signifidande uppgifter utmanande. Dessutom har illrar tidigare visade skillnader i farmakokinetik läkemedels, biotillgänglighet och toxicitet som gör att testa effekten svårt. Till exempel, illrar uppvisar toxicitet för jonkanalen hämmaren amantadin 16 M2. Således är det uppenbart att välja en djurmodell för att studera frågor om mänskliga IAV infektioner, är det viktigt att tänka på sina inneboende fördelar och begränsningar, och den del av värd virus interaktion som är under utredning.
Zebrafisk, Danio rerio, är en djurmodell som ger unika möjligheter för att undersöka mikrobiell infektion, värd immunsvar, och potentiella läkemedelsbehandlingar 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, <sup class = "xref"> 24, 25, 26, 27, 28. Närvaron av α-2,6-länkade sialinsyror på ytan av celler i zebrafisk föreslog dess känslighet för IAV, vilket bekräftades i infektionsstudier och avbildas in vivo med användning av en fluorescerande reporterstam av IAV 19. I IAV-infekterade zebrafisk, ökat uttryck av de antivirala ifnphi1 och MXA transkript indikerade att en medfödd immunsvar hade stimulerats och patologi visas av IAV-infekterade zebrafisk, inklusive ödem och vävnadsnedbrytning, liknade den som observerats i infektioner influensa hos människor . Dessutom IAV antivirala neuraminidas hämmare Zanamivir begränsad dödlighet och minskad virusreplikation i zebrafisk 19.
I denna rapport, ett protokoll för att initiera systemetic IAV infektioner hos zebrafisk embryon beskrivs. Använda Zanamivir vid kliniskt relevanta doser som en proof-of-princip är nyttan av denna zebrafisk IAV infektionsmodell för screening av föreningar för antiviral aktivitet påvisas. Dessutom, ett protokoll för att alstra en lokaliserad, epitelial IAV infektion i zebrafisk simma urinblåsan, ett organ som anses vara anatomiskt och funktionellt analog med däggdjurs lungan 21, 29, 30, 31, beskrivs. Med hjälp av denna lokaliserade IAV infektionsmodell, kan neutrofil rekrytering till infektionsstället spåras, så undersökningar roll neutrofila biologi IAV infektion och inflammation. Dessa zebrafisk modeller komplettera befintliga djurmodeller för humana IAV infektioner och är särskilt användbara för att testa små molekyler och immuncellsvar på grund av risken för förbättrad sav statistik makt, kapacitet för måttliga till hög genomströmning analyser och förmåga att spåra immun cellens beteende och funktion med ljusmikroskop.
För att maximera nyttan av att använda ett litet djur för att modellera mänskliga värd-patogen interaktioner, är det viktigt att utforma frågeställningar och testa hypoteser som kapitalisera på de inneboende fördelarna med modellsystem. Som en modell för human IAV infektion, har zebrafisk flera styrkor, inklusive hög fruktsamhet, optisk klarhet, mottaglighet för läkemedelsscreening, och tillgången av transgena linjer som märka immunceller som neutrofiler. Zebrafisk har utvecklats som en allt mer kraftful…
The authors have nothing to disclose.
The authors wish to thank Mark Nilan for zebrafish care and maintenance and Meghan Breitbach and Deborah Bouchard for propagating NS1-GFP and determining IAV titers. This research was supported by NIGMS grant NIH P20GM103534 and the Maine Agricultural and Forest Experiment Station (Publication Number 3493).
Instant Ocean | Spectrum Brands | SS15-10 | |
100 x 25 mm sterile disposable Petri dishes | VWR | 89107-632 | |
Transfer pipettes | Fisherbrand | 13-711-7M | |
Tricaine- S (MS-222) | Western Chemical | ||
Borosilicate glass capillary with filament | Sutter Instrument | BF120-69-10 | |
Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | |
Agarose | Lonza | 50004 | |
Zanamivir | AK Scientific | G939 | |
Dumont #5 forceps | Electron Microscopy Sciences | 72700-D | |
Microloader tips | Eppendorf | 930001007 | |
Microscope immersion oil | Olympus | IMMOIL-F30CC | |
Microscope stage calibration slide | AmScope | MR095 | |
MPPI-3 pressure injector | Applied Scientific Instrumentation | ||
Stereo microscope | Olympus | SZ61 | |
Back pressure unit | Applied Scientific Instrumentation | BPU | |
Micropipette holder kit | Applied Scientific Instrumentation | MPIP | |
Foot switch | Applied Scientific Instrumentation | FSW | |
Micromanipulator | Applied Scientific Instrumentation | MM33 | |
Magnetic base | Applied Scientific Instrumentation | Magnetic Base | |
Phenol red | Sigma-Aldrich | P-4758 | |
Low temperature incubator | VWR | 2020 | |
SteREO Discovery.V12 | Zeiss | ||
Illuminator | Zeiss | HXP 200C | |
Cold light source | Zeiss | CL6000 LED | |
Glass-bottom multiwell plate, 24 well | Mattek | P24G-0-13-F | |
Confocal microscope | Olympus | IX-81 with FV-1000 laser scanning confocal system | |
Fluoview software | Olympus | ||
Prism v6 | GraphPad | ||
Influenza A/PR/8/34 (H1N1) virus | Charles River | 490710 | |
Influenza A X-31, A/Aichi/68 (H3N2) | Charles River | 490715 | |
Influenza NS1-GFP | Referenced in Manicassamy et al. 2010 | ||
Tg(mpx:mCherry) | Referenced in Lam et al. 2013 |