Summary

Met behulp van zebravis modellen van menselijke influenza A-virus infecties op Bleken antivirale middelen en karakteriseren Host Immune Cell Responses

Published: January 20, 2017
doi:

Summary

Systemic and localized zebrafish infection models for human influenza A virus are demonstrated. Using a systemic infection model, zebrafish can be used to screen antiviral drugs. Using a localized infection model, zebrafish can be used to characterize host immune cell responses.

Abstract

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare burden. The principle strategy to curtail infections is yearly vaccination. In individuals who have contracted influenza, antiviral drugs can mitigate symptoms. There is a clear and unmet need to develop alternative strategies to combat influenza. Several animal models have been created to model host-influenza interactions. Here, protocols for generating zebrafish models for systemic and localized human influenza A virus (IAV) infection are described. Using a systemic IAV infection model, small molecules with potential antiviral activity can be screened. As a proof-of-principle, a protocol that demonstrates the efficacy of the antiviral drug Zanamivir in IAV-infected zebrafish is described. It shows how disease phenotypes can be quantified to score the relative efficacy of potential antivirals in IAV-infected zebrafish. In recent years, there has been increased appreciation for the critical role neutrophils play in the human host response to influenza infection. The zebrafish has proven to be an indispensable model for the study of neutrophil biology, with direct impacts on human medicine. A protocol to generate a localized IAV infection in the Tg(mpx:mCherry) zebrafish line to study neutrophil biology in the context of a localized viral infection is described. Neutrophil recruitment to localized infection sites provides an additional quantifiable phenotype for assessing experimental manipulations that may have therapeutic applications. Both zebrafish protocols described faithfully recapitulate aspects of human IAV infection. The zebrafish model possesses numerous inherent advantages, including high fecundity, optical clarity, amenability to drug screening, and availability of transgenic lines, including those in which immune cells such as neutrophils are labeled with fluorescent proteins. The protocols detailed here exploit these advantages and have the potential to reveal critical insights into host-IAV interactions that may ultimately translate into the clinic.

Introduction

Volgens de World Health Organization (WHO), influenza infecteren 5-10% van de volwassenen en 20-30% van de kinderen en veroorzaken jaarlijks 3-5.000.000 ernstig ziek maken en tot 500.000 sterfgevallen wereldwijd 1. Jaarlijkse inentingen tegen griep blijft de beste optie om de ziekte te voorkomen. Inspanningen, zoals de WHO Global Action Plan hebben seizoensgebonden vaccin gebruik, de productie van vaccins capaciteit, en onderzoek en ontwikkeling verhoogd naar meer potente vaccins strategieën om de morbiditeit en mortaliteit geassocieerd met seizoensgebonden influenza-uitbraken 2 te verminderen. Antivirale middelen zoals neuraminidase-remmers (bijv Zanamivir en Oseltamivir) zijn verkrijgbaar in sommige landen en bij het verminderen van de symptomen effectief zijn gebleken, wanneer het wordt toegediend binnen de eerste 48 uur na het optreden 3, 4, 5. Ondanks de wereldwijde inspanningen, inperking van seizoensgriep outbreaks blijft een geweldige uitdaging op dit moment, zoals influenzavirus antigene drift overschrijdt vaak actuele vermogen aan te passen aan de veranderende genoom van het virus 6. Vaccin strategieën gericht op nieuwe stammen van het virus moeten worden ontwikkeld op voorhand en zijn soms minder dan optimaal effectief gemaakt door onvoorziene veranderingen in de aard van de stammen die uiteindelijk de overhand hebben in een influenza-seizoen. Daarom is er duidelijk behoefte aan alternatieve therapeutische strategieën die infecties en vermindering van sterfte ontwikkelen. Door een beter begrip van de host-virus interactie, kan het mogelijk zijn om nieuwe anti-influenza medicijnen en adjuvante therapieën 7, 8 ontwikkelen.

De menselijke gastheer-influenza A virus (IAV) interactie complex. Verschillende diermodellen van menselijke besmetting IAV zijn ontwikkeld om inzicht te krijgen in de host-virus interactie, including muizen, cavia's, katoen ratten, hamsters, fretten, en makaken 9. Terwijl het verstrekken van belangrijke gegevens die het begrip van gastheer-IAV dynamiek hebben verbeterd, elk model organisme bezit belangrijke nadelen die moeten worden overwogen bij een poging om de bevindingen te vertalen naar de humane geneeskunde. Bijvoorbeeld, muizen, die de meest gebruikte model zijn, niet gemakkelijk te ontwikkelen IAV-geïnduceerde infectie symptomen wanneer besmet met humane influenza-isolaten 9. Dit komt omdat muizen niet de natuurlijke tropisme voor humane influenza-isolaten sinds muis epitheelcellen tot expressie α-2,3 siaalzuurkoppelingen plaats van de α-2,6 siaalzuurkoppelingen uitgedrukt op menselijke epitheelcellen 10. De hemagglutinine eiwitten die in humane isolaten IAV gunstig binden en voer gastheer cellen die α-2,6 siaalzuurkoppelingen doorgaande receptor veroorzaakte endocytose 9, 11, </sup> 12, 13. Bijgevolg wordt nu aangenomen dat bij de ontwikkeling muismodellen voor humane influenza, zorg moet worden afgegeven bij een stam van muis paren met de geschikte stam van influenza om ziekte fenotypes die aspecten van de menselijke ziekte recapituleren bereiken. Daarentegen epitheelcellen in de bovenste luchtwegen van fretten bezitten α-2,6 siaalzuurkoppelingen dat menselijke cellen 14 lijken. Geïnfecteerde fretten hebben veel van de pathologische en klinische kenmerken waargenomen in de menselijke ziekten, met inbegrip van de pathogeniteit en overdraagbaarheid van de menselijke en het vogelgriepvirus 14, 15. Ze zijn ook zeer vatbaar zijn voor werkzaamheid van het vaccin studies. Toch is de fret model voor humane influenza heeft een aantal nadelen voornamelijk verband houden met hun omvang en de kosten van de veehouderij die overname te maken van statistisch significant data uitdagend. Bovendien hebben fretten eerder weergegeven verschillen in farmacokinetica drug, biobeschikbaarheid en toxiciteit die bepaling van de doelmatigheid bemoeilijken. Bijvoorbeeld, fretten vertonen toxiciteit voor de M2 ionkanalen inhibitor amantadine 16. Aldus is het duidelijk dat de keuze van een diermodel om vragen over menselijke iav infecties te bestuderen, is het belangrijk de inherente voordelen en beperkingen, en het aspect van de host-virus interactie die wordt onderzocht overwegen.

De zebravis, Danio rerio, een diermodel dat unieke mogelijkheden biedt voor het onderzoeken van microbiële infectie, gastheer immuunrespons en potentieel geneesmiddel therapieën 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, <sup class = "xref"> 24, 25, 26, 27, 28. De aanwezigheid van α-2,6-gekoppelde siaalzuren aan het oppervlak van cellen in de zebravis voorgesteld de gevoeligheid voor IAV, die in infectie studies werd gedragen en afgebeeld in vivo onder toepassing van een fluorescerende reporter stam van IAV 19. In IAV geïnfecteerde zebravis, verhoogde expressie van de antivirale ifnphi1 en MXA transcripten aangegeven dat een aangeboren immuunreactie werd gestimuleerd en de pathologie weergegeven IAV geïnfecteerde zebravis, waaronder oedeem en weefsel, vergelijkbaar met dat voor humaan influenza . Bovendien is de IAV antivirale neuraminidase remmer Zanamivir beperkte mortaliteit en verminderde virale replicatie in de zebravis 19.

In dit rapport, een protocol voor het initiëren van het systeemic IAV infecties in de zebravis embryo's wordt beschreven. Het gebruik van zanamivir bij klinisch relevante doses als een proof-of-principle, is het nut van deze zebravis IAV infectie model voor het screenen van verbindingen voor antivirale activiteit aangetoond. Daarnaast is een protocol voor het genereren van een gelokaliseerde infectie epitheliaal IAV in de zebravis zwemblaas, een orgaan dat wordt beschouwd als anatomisch en functioneel analoog aan het zoogdier longen 21, 29, 30, 31 zijn beschreven. Gebruik van deze gelokaliseerde iav infectiemodel kunnen neutrofiel rekrutering van de plaats van infectie worden gevolgd, zodat onderzoek naar de rol van neutrofielen biologie IAV infecties en ontstekingen. Deze zebravismodellen vult bestaande diermodellen van humane IAV infecties en zijn bijzonder bruikbaar voor het testen van kleine moleculen en immuuncel respons vanwege de mogelijkheid van verhoogde sTATISTISCHE vermogen, vermogen tot matige hoge throughput assays en het vermogen om immuuncellen gedrag en functie volgen met lichtmicroscopie.

Protocol

Alle werkzaamheden moeten worden uitgevoerd met behulp bioveiligheidsniveau 2 (of BSL2) standaarden beschreven door de Amerikaanse Centers for Disease Control (CDC) en in overeenstemming met de door Institutional Animal Care en gebruik Commissies (IACUC) richtlijnen. Gelieve te overleggen met de juiste ambtenaren om de veiligheid en de naleving te waarborgen. 1. zebravis Onderhoud Paaien zebravis en verzamel het vereiste aantal embryo's voor de experimenten. Indien nodig, mass…

Representative Results

Hier elementen waaruit blijkt hoe IAV systemische infectie bij zebravis kan worden gebruikt om de werkzaamheid van geneesmiddelen (Figuur 1A) testen worden voorzien. Embryo's in 48 uur na de bevruchting zijn geïnjecteerd met APR8 (figuren 1C, 1F), X-31 (figuren 1D, 1G) of NS1-GFP (Figuur 1H-1I) via het kanaal van Cuvier een virale infectie initiëren. Een ander cohort van embryo's op 48 uur na de bevruchting wer…

Discussion

Om de voordelen verkregen uit een klein proefdiermodel voor menselijke gastheer-pathogeen interacties modelleren maximaliseren, is het belangrijk om vraagstellingen en testen hypothesen die kapitaliseren op de inherente voordelen van het modelsysteem omlijsten. Als model voor de menselijke IAV infectie, de zebravis heeft een aantal sterke punten, met inbegrip van hoge vruchtbaarheid, optische helderheid, ontvankelijkheid voor drug discovery, en de beschikbaarheid van transgene lijnen die immuuncellen zoals neutrofielen …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors wish to thank Mark Nilan for zebrafish care and maintenance and Meghan Breitbach and Deborah Bouchard for propagating NS1-GFP and determining IAV titers. This research was supported by NIGMS grant NIH P20GM103534 and the Maine Agricultural and Forest Experiment Station (Publication Number 3493).

Materials

Instant Ocean Spectrum Brands SS15-10
100 x 25 mm sterile disposable Petri dishes  VWR  89107-632
Transfer pipettes  Fisherbrand 13-711-7M
Tricaine- S (MS-222) Western Chemical
Borosilicate glass capillary with filament  Sutter Instrument  BF120-69-10
Flaming/Brown micropipette puller  Sutter Instrument  P-97
Agarose Lonza 50004
Zanamivir AK Scientific G939
Dumont #5 forceps  Electron Microscopy Sciences 72700-D
Microloader tips Eppendorf 930001007
Microscope immersion oil Olympus IMMOIL-F30CC
Microscope stage calibration slide  AmScope MR095
MPPI-3 pressure injector  Applied Scientific Instrumentation
Stereo microscope Olympus SZ61
Back pressure unit Applied Scientific Instrumentation BPU
Micropipette holder kit Applied Scientific Instrumentation MPIP
Foot switch Applied Scientific Instrumentation FSW
Micromanipulator Applied Scientific Instrumentation MM33
Magnetic base Applied Scientific Instrumentation Magnetic Base
Phenol red  Sigma-Aldrich  P-4758
Low temperature incubator VWR 2020
SteREO Discovery.V12 Zeiss
Illuminator Zeiss HXP 200C
Cold light source Zeiss  CL6000 LED
Glass-bottom multiwell plate, 24 well Mattek P24G-0-13-F
Confocal microscope Olympus IX-81 with FV-1000 laser scanning confocal system
Fluoview software Olympus
Prism v6 GraphPad
Influenza A/PR/8/34 (H1N1) virus  Charles River  490710
Influenza A X-31, A/Aichi/68 (H3N2)  Charles River  490715
Influenza NS1-GFP Referenced in Manicassamy et al. 2010
Tg(mpx:mCherry) Referenced in Lam et al. 2013

References

  1. De Clercq, E. Antiviral agents active against influenza A viruses. Nat Rev Drug Discov. 5 (12), 1015-1025 (2006).
  2. von Itzstein, M. The war against influenza: discovery and development of sialidase inhibitors. Nat Rev Drug Discov. 6 (12), 967-974 (2007).
  3. Fiore, A. E., et al. Antiviral Agents for the Treatment and Chemoprophylaxis of Influenza. Centers for Disease Control and Prevention. , 1-26 (2011).
  4. Krammer, F., Palese, P. Advances in the development of influenza virus vaccines. Nat Rev Drug Discov. 14 (3), 167-182 (2015).
  5. Ren, H., Zhou, P. Epitope-focused vaccine design against influenza A and B viruses. Curr Opin Immunol. 42, 83-90 (2016).
  6. Webster, R. G., Govorkova, E. A. Continuing challenges in influenza. Ann N Y Acad Sci. 1323, 115-139 (2014).
  7. Bouvier, N. M., Lowen, A. C. Animal Models for Influenza Virus Pathogenesis and Transmission. Viruses. 2 (8), 1530-1563 (2010).
  8. Ibricevic, A., et al. Influenza virus receptor specificity and cell tropism in mouse and human airway epithelial cells. J Virol. 80 (15), 7469-7480 (2006).
  9. Skehel, J. J., Wiley, D. C. RECEPTOR BINDING AND MEMBRANE FUSION IN VIRUS ENTRY: The Influenza Hemagglutinin. Annu Rev Biochem. 69 (1), 531 (2000).
  10. Rust, M. J., Lakadamyali, M., Zhang, F., Zhuang, X. Assembly of endocytic machinery around individual influenza viruses during viral entry. Nat Struct Mol Biol. 11 (6), 567-573 (2004).
  11. Stencel-Baerenwald, J. E., Reiss, K., Reiter, D. M., Stehle, T., Dermody, T. S. The sweet spot: defining virus-sialic acid interactions. Nature Rev Microbiol. 12 (11), 739-749 (2014).
  12. Herlocher, M. L., et al. Ferrets as a Transmission Model for Influenza: Sequence Changes in HA1 of Type A (H3N2) Virus. J Infect Dis. 184 (5), 542-546 (2001).
  13. Belser, J. A., Katz, J. M., Tumpey, T. M. The ferret as a model organism to study influenza A virus infection. Dis Model Mech. 4 (5), 575-579 (2011).
  14. Cochran, K. W., Maassab, H. F., Tsunoda, A., Berlin, B. S. Studies on the antiviral activity of amantadine hydrochloride. Ann N Y Acad Sci. 130 (1), 432-439 (1965).
  15. de Oliveira, S., Boudinot, P., Calado, A., Mulero, V. Duox1-derived H2O2 modulates Cxcl8 expression and neutrophil recruitment via JNK/c-JUN/AP-1 signaling and chromatin modifications. J Immunol. 194 (4), 1523-1533 (2015).
  16. de Oliveira, S., et al. Cxcl8 (IL-8) mediates neutrophil recruitment and behavior in the zebrafish inflammatory response. J Immunol. 190 (8), 4349-4359 (2013).
  17. Gabor, K. A., et al. Influenza A virus infection in zebrafish recapitulates mammalian infection and sensitivity to anti-influenza drug treatment. Dis Model Mech. 7 (11), 1227-1237 (2014).
  18. Galani, I. E., Andreakos, E. Neutrophils in viral infections: Current concepts and caveats. J Leukoc Biol. 98 (4), 557-564 (2015).
  19. Gratacap, R. L., Rawls, J. F., Wheeler, R. T. Mucosal candidiasis elicits NF-kappaB activation, proinflammatory gene expression and localized neutrophilia in zebrafish. Dis Model Mech. 6 (5), 1260-1270 (2013).
  20. Henry, K. M., Loynes, C. A., Whyte, M. K., Renshaw, S. A. Zebrafish as a model for the study of neutrophil biology. J Leukoc Biol. 94 (4), 633-642 (2013).
  21. Mathias, J. R., et al. Live imaging of chronic inflammation caused by mutation of zebrafish Hai1. J Cell Sci. 120 (19), 3372-3383 (2007).
  22. Shelef, M. A., Tauzin, S., Huttenlocher, A. Neutrophil migration: moving from zebrafish models to human autoimmunity. Immunol Rev. 256 (1), 269-281 (2013).
  23. Walters, K. B., Green, J. M., Surfus, J. C., Yoo, S. K., Huttenlocher, A. Live imaging of neutrophil motility in a zebrafish model of WHIM syndrome. Blood. 116 (15), 2803-2811 (2010).
  24. Yoo, S. K., et al. Differential regulation of protrusion and polarity by PI3K during neutrophil motility in live zebrafish. Dev Cell. 18 (2), 226-236 (2010).
  25. Yoo, S. K., Huttenlocher, A. Spatiotemporal photolabeling of neutrophil trafficking during inflammation in live zebrafish. J Leukoc Biol. 89 (5), 661-667 (2011).
  26. Yoo, S. K., et al. The role of microtubules in neutrophil polarity and migration in live zebrafish. J Cell Sci. 125 (23), 5702-5710 (2012).
  27. Winata, C. L., et al. Development of zebrafish swimbladder: The requirement of Hedgehog signaling in specification and organization of the three tissue layers. Dev Biol. 331 (2), 222-236 (2009).
  28. Perry, S. F., Wilson, R. J., Straus, C., Harris, M. B., Remmers, J. E. Which came first, the lung or the breath?. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 129 (1), 37-47 (2001).
  29. Gratacap, R. L., Bergeron, A. C., Wheeler, R. T. Modeling mucosal candidiasis in larval zebrafish by swimbladder injection. J Vis Exp. (93), e52182 (2014).
  30. Adatto, I., Lawrence, C., Thompson, M., Zon, L. I. A New System for the Rapid Collection of Large Numbers of Developmentally Staged Zebrafish Embryos. PLoS ONE. 6 (6), e21715 (2011).
  31. Manicassamy, B., et al. Analysis of in vivo dynamics of influenza virus infection in mice using a GFP reporter virus. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (25), 11531-11536 (2010).
  32. Lawrence, C. The husbandry of zebrafish (Danio rerio): a review. Aquaculture. 269 (1), 1-20 (2007).
  33. Lam, P. -. y., Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Heat Shock Modulates Neutrophil Motility in Zebrafish. PLoS ONE. 8 (12), e84436 (2013).
  34. Shelton, M. J., et al. Zanamivir pharmacokinetics and pulmonary penetration into epithelial lining fluid following intravenous or oral inhaled administration to healthy adult subjects. Antimicrob Agents Chemother. 55 (11), 5178-5184 (2011).
  35. Sullivan, C., Kim, C. H. Zebrafish as a model for infectious disease and immune function. Fish Shellfish Immunol. 25 (4), 341-350 (2008).
  36. MacRae, C. A., Peterson, R. T. Zebrafish as tools for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 14 (10), 721-731 (2015).
  37. Brandes, M., Klauschen, F., Kuchen, S., Germain, R. N. A systems analysis identifies a feedforward inflammatory circuit leading to lethal influenza infection. Cell. 154 (1), 197-212 (2013).
  38. Narasaraju, T., et al. Excessive neutrophils and neutrophil extracellular traps contribute to acute lung injury of influenza pneumonitis. Am J Pathol. 179 (1), 199-210 (2011).
  39. Pillai, P. S., et al. Mx1 reveals innate pathways to antiviral resistance and lethal influenza disease. Science. 352 (6284), 463-466 (2016).
  40. Stifter, S. A., et al. Functional Interplay between Type I and II Interferons Is Essential to Limit Influenza A Virus-Induced Tissue Inflammation. PLoS Pathog. 12 (1), e1005378 (2016).
  41. Vlahos, R., Stambas, J., Selemidis, S. Suppressing production of reactive oxygen species (ROS) for influenza A virus therapy. Trends Pharmacol Sci. 33 (1), 3-8 (2012).
  42. Palic, D., Andreasen, C. B., Ostojic, J., Tell, R. M., Roth, J. A. Zebrafish (Danio rerio) whole kidney assays to measure neutrophil extracellular trap release and degranulation of primary granules. J Immunol Methods. 319 (1-2), 87-97 (2007).
  43. Renshaw, S. A., et al. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
  44. Mathias, J. R., et al. Characterization of zebrafish larval inflammatory macrophages. Dev Comp Immunol. 33 (11), 1212-1217 (2009).
  45. Pase, L., et al. Neutrophil-delivered myeloperoxidase dampens the hydrogen peroxide burst after tissue wounding in zebrafish. Curr Biol. 22 (19), 1818-1824 (2012).
  46. Drescher, B., Bai, F. Neutrophil in viral infections, friend or foe?. Virus Res. 171 (1), 1-7 (2013).
  47. Iwasaki, A., Pillai, P. S. Innate immunity to influenza virus infection. Nat Rev Immunol. 14 (5), 315-328 (2014).
  48. Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nat Rev Immunol. 13 (3), 159-175 (2013).
  49. Summers, C., et al. Neutrophil kinetics in health and disease. Trends Immunol. 31 (8), 318-324 (2010).
  50. Tate, M. D., Brooks, A. G., Reading, P. C. The role of neutrophils in the upper and lower respiratory tract during influenza virus infection of mice. Respir Res. 9, 57 (2008).
  51. Tate, M. D., et al. Neutrophils ameliorate lung injury and the development of severe disease during influenza infection. J Immunol. 183 (11), 7441-7450 (2009).
  52. Tumpey, T. M., et al. Pathogenicity of influenza viruses with genes from the 1918 pandemic virus: functional roles of alveolar macrophages and neutrophils in limiting virus replication and mortality in mice. J Virol. 79 (23), 14933-14944 (2005).
  53. Wheeler, J. G., Winkler, L. S., Seeds, M., Bass, D., Abramson, J. S. Influenza A virus alters structural and biochemical functions of the neutrophil cytoskeleton. J Leukoc Biol. 47 (4), 332-343 (1990).
  54. de Oliveira, S., et al. Cxcl8-l1 and Cxcl8-l2 are required in the zebrafish defense against Salmonella Typhimurium. Dev Comp Immunol. 49 (1), 44-48 (2015).
  55. Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Neutrophils in host defense: new insights from zebrafish. J Leukoc Biol. 98 (4), 523-537 (2015).

Play Video

Cite This Article
Sullivan, C., Jurcyzszak, D., Goody, M. F., Gabor, K. A., Longfellow, J. R., Millard, P. J., Kim, C. H. Using Zebrafish Models of Human Influenza A Virus Infections to Screen Antiviral Drugs and Characterize Host Immune Cell Responses. J. Vis. Exp. (119), e55235, doi:10.3791/55235 (2017).

View Video