Systemic and localized zebrafish infection models for human influenza A virus are demonstrated. Using a systemic infection model, zebrafish can be used to screen antiviral drugs. Using a localized infection model, zebrafish can be used to characterize host immune cell responses.
Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare burden. The principle strategy to curtail infections is yearly vaccination. In individuals who have contracted influenza, antiviral drugs can mitigate symptoms. There is a clear and unmet need to develop alternative strategies to combat influenza. Several animal models have been created to model host-influenza interactions. Here, protocols for generating zebrafish models for systemic and localized human influenza A virus (IAV) infection are described. Using a systemic IAV infection model, small molecules with potential antiviral activity can be screened. As a proof-of-principle, a protocol that demonstrates the efficacy of the antiviral drug Zanamivir in IAV-infected zebrafish is described. It shows how disease phenotypes can be quantified to score the relative efficacy of potential antivirals in IAV-infected zebrafish. In recent years, there has been increased appreciation for the critical role neutrophils play in the human host response to influenza infection. The zebrafish has proven to be an indispensable model for the study of neutrophil biology, with direct impacts on human medicine. A protocol to generate a localized IAV infection in the Tg(mpx:mCherry) zebrafish line to study neutrophil biology in the context of a localized viral infection is described. Neutrophil recruitment to localized infection sites provides an additional quantifiable phenotype for assessing experimental manipulations that may have therapeutic applications. Both zebrafish protocols described faithfully recapitulate aspects of human IAV infection. The zebrafish model possesses numerous inherent advantages, including high fecundity, optical clarity, amenability to drug screening, and availability of transgenic lines, including those in which immune cells such as neutrophils are labeled with fluorescent proteins. The protocols detailed here exploit these advantages and have the potential to reveal critical insights into host-IAV interactions that may ultimately translate into the clinic.
Ifølge Verdens helseorganisasjon (WHO), influensavirus infisere 5-10% av voksne og 20-30% av barn årlig, og føre til 3-5 millioner tilfeller av alvorlig sykdom og opp til 500.000 dødsfall på verdensbasis en. Årlig vaksinasjon mot influensa er fortsatt det beste alternativet for å forebygge sykdom. Arbeidet som WHOs globale handlingsplanen har økt sesongvaksine bruk, vaksineproduksjonskapasitet, og forskning og utvikling i mer potente vaksinestrategier for å redusere sykelighet og dødelighet i forbindelse med sesonginfluensautbrudd 2. Antivirale medikamenter som neuraminidasehemmere (f.eks zanamivir og Oseltamivir) er tilgjengelig i enkelte land og har vist seg effektive i formildende symptomer, når det gis innen de første 48 timer av utbruddet 3, 4, 5. Til tross for den globale innsatsen, oppdemming av sesonginfluensa outbreaks fortsatt en formidabel utfordring på denne tiden, som influensavirus antigen drift ofte overstiger nåværende evner til å tilpasse seg skiftende genomet av viruset seks. Vaksine strategier rettet mot nye stammer av virus må utvikles på forhånd, og er noen ganger gjøres mindre enn optimalt effektiv på grunn av uforutsette endringer i hvilke typer stammer som til slutt dominerer i influensasesongen. Av disse grunner, er det et klart behov for å utvikle alternative terapeutiske strategier for inneholdende infeksjoner og redusere dødelighet. Ved å oppnå en bedre forståelse av den vert-virus interaksjon, kan det være mulig å utvikle nye anti-influensa legemidler og adjuvant terapi 7, 8.
Den menneskelige verten-influensa A virus (IAV) interaksjon er kompleks. Flere dyremodeller av menneskelig IAV infeksjon har blitt utviklet for å få innsikt i verts-virus interaksjon, inkluing mus, marsvin, bomullsrotter, hamstere, ildere, og makaker 9. Samtidig som det gir viktige data som har forbedret forståelse av verts IAV dynamikk, besitter hver modellorganisme betydelige ulemper som må vurderes når man forsøker å oversette resultatene til humanmedisin. For eksempel mus, som er den mest brukte modellen, ikke lett utvikle IAV-indusert infeksjon symptomer når infisert med menneskelig influensa isolerer 9. Dette er fordi mus mangler den naturlige tropisme for human influensa isolater, siden mus epitel-celler uttrykker a-2,3 sialinsyre-bindinger i stedet for de α-2,6 sialinsyre-bindinger uttrykt på humane epitelceller 10. Hemagglutinin proteiner tilstede i human IAV isolater gunstig å binde og gå inn vertsceller som bærer a-2,6-bindinger sialinsyre via reseptor-mediert endocytose 9, 11, </sopp> 12, 13. Som en konsekvens, er det nå akseptert at i utviklingen av musemodeller for human influensa, må man sørge for å koble den passende stamme av mus med det passende stamme av influensa for å oppnå sykdoms fenotyper som rekapitulere aspekter ved den menneskelige sykdom. I motsetning til dette, epitelceller i de øvre luftveiene hos ildere har a-2,6 sialinsyre-bindinger som ligner menneskeceller 14. Infiserte ildere deler mange av de patologiske og kliniske trekk observert i menneskelig sykdom, inkludert patogenitet og overførbarhet av menneskelige og fugleinfluensa virus 14, 15. De er også svært mottagelig for vaksine effektstudiene. Likevel ilderen modell for menneskelig influensa har flere ulemper i hovedsak knyttet til deres størrelse og kostnader for dyrehold som gjør kjøp av statistisk signifiskrånende data utfordrende. I tillegg har ildere tidligere vist forskjeller i legemiddel farmakokinetikk, biotilgjengelighet og giftighet som gjør testing effekt vanskelig. For eksempel, ildere vise giftighet for M2 ionekanal inhibitor amantadin 16. Det er således klart at ved valg av en dyremodell for å studere spørsmål om humane IAV infeksjoner, er det viktig å vurdere dens iboende fordeler og begrensninger, og den del av den vert-virus interaksjon som er under undersøkelse.
Sebrafisk, Danio rerio, er en dyremodell som gir unike muligheter for å undersøke mikrobiell infeksjon, vert immunrespons, og potensielle legemiddelterapi 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, <sup class = "xref"> 24, 25, 26, 27, 28. Tilstedeværelsen av α-2,6-bundne sialinsyrer på overflaten av celler i sebrafisk slått dens mottakelighet for IAV, som ble båret på infeksjonsstudier og avbildes in vivo ved bruk av en fluorescerende reporter stamme av IAV 19. I IAV-smittet sebrafisk, økt uttrykk av antivirale ifnphi1 og MXA transkripsjoner indikerte at en medfødt immunrespons hadde blitt stimulert, og patologi vises av IAV-infisert sebrafisk, inkludert ødem og ødeleggelse vev, var lik den som ble observert i menneskelige influensa infeksjoner . Videre IAV antiviral neuraminidase inhibitor zanamivir begrenset dødelighet og redusert virusreplikasjon i sebrafisk 19.
I denne rapporten, en protokoll for initieringssystemic IAV infeksjoner i sebrafisk embryoer er beskrevet. Ved hjelp av zanamivir ved klinisk relevante doser som et proof-of-prinsippet, er nytten av denne sebrafisk IAV infeksjonsmodell for screening forbindelser for antiviral aktivitet demonstrert. I tillegg er en protokoll for generering av en lokalisert, epitelial IAV infeksjon i sebrafisk svømmeblæren, et organ som er ansett for å være anatomisk og funksjonelt analog til pattedyr lunge 21, 29, 30, 31, er beskrevet. Ved hjelp av denne lokaliserte IAV infeksjonsmodell, kan nøytrofile rekruttering til stedet for infeksjon spores, slik undersøkelser i rollen som nøytrofile biologi i IAV infeksjon og betennelse. Disse modellene sebrafisk utfylle eksisterende dyremodeller av humane IAV infeksjoner og er særlig nyttig for å teste små molekyler og immun celle responser på grunn av muligheten for forbedrede statistical kraft, kapasitet for moderat-til high-throughput analyser, og muligheter til å spore immun celle atferd og funksjon med lys-mikroskopi.
For å maksimere nytten av å bruke et lite dyr å modellere menneskelige vert-patogen interaksjoner, er det viktig å ramme problemstillinger og teste hypoteser som kapitalisere på de iboende fordelene av modellsystemet. Som modell for menneskelig IAV infeksjon, har sebrafisk flere styrker, inkludert høy fruktbarhet, optisk klarhet, amenability til narkotika screening, og tilgjengeligheten av transgene linjer den etiketten immunceller som nøytrofile. Sebrafisk har blitt utviklet som en stadig kraftigere alternativ t…
The authors have nothing to disclose.
The authors wish to thank Mark Nilan for zebrafish care and maintenance and Meghan Breitbach and Deborah Bouchard for propagating NS1-GFP and determining IAV titers. This research was supported by NIGMS grant NIH P20GM103534 and the Maine Agricultural and Forest Experiment Station (Publication Number 3493).
Instant Ocean | Spectrum Brands | SS15-10 | |
100 x 25 mm sterile disposable Petri dishes | VWR | 89107-632 | |
Transfer pipettes | Fisherbrand | 13-711-7M | |
Tricaine- S (MS-222) | Western Chemical | ||
Borosilicate glass capillary with filament | Sutter Instrument | BF120-69-10 | |
Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | |
Agarose | Lonza | 50004 | |
Zanamivir | AK Scientific | G939 | |
Dumont #5 forceps | Electron Microscopy Sciences | 72700-D | |
Microloader tips | Eppendorf | 930001007 | |
Microscope immersion oil | Olympus | IMMOIL-F30CC | |
Microscope stage calibration slide | AmScope | MR095 | |
MPPI-3 pressure injector | Applied Scientific Instrumentation | ||
Stereo microscope | Olympus | SZ61 | |
Back pressure unit | Applied Scientific Instrumentation | BPU | |
Micropipette holder kit | Applied Scientific Instrumentation | MPIP | |
Foot switch | Applied Scientific Instrumentation | FSW | |
Micromanipulator | Applied Scientific Instrumentation | MM33 | |
Magnetic base | Applied Scientific Instrumentation | Magnetic Base | |
Phenol red | Sigma-Aldrich | P-4758 | |
Low temperature incubator | VWR | 2020 | |
SteREO Discovery.V12 | Zeiss | ||
Illuminator | Zeiss | HXP 200C | |
Cold light source | Zeiss | CL6000 LED | |
Glass-bottom multiwell plate, 24 well | Mattek | P24G-0-13-F | |
Confocal microscope | Olympus | IX-81 with FV-1000 laser scanning confocal system | |
Fluoview software | Olympus | ||
Prism v6 | GraphPad | ||
Influenza A/PR/8/34 (H1N1) virus | Charles River | 490710 | |
Influenza A X-31, A/Aichi/68 (H3N2) | Charles River | 490715 | |
Influenza NS1-GFP | Referenced in Manicassamy et al. 2010 | ||
Tg(mpx:mCherry) | Referenced in Lam et al. 2013 |