Summary

Usando modelos de Zebrafish de infecções por vírus gripe humana A para Screen antivirais e Caracterizar imune do hospedeiro respostas de células

Published: January 20, 2017
doi:

Summary

Systemic and localized zebrafish infection models for human influenza A virus are demonstrated. Using a systemic infection model, zebrafish can be used to screen antiviral drugs. Using a localized infection model, zebrafish can be used to characterize host immune cell responses.

Abstract

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare burden. The principle strategy to curtail infections is yearly vaccination. In individuals who have contracted influenza, antiviral drugs can mitigate symptoms. There is a clear and unmet need to develop alternative strategies to combat influenza. Several animal models have been created to model host-influenza interactions. Here, protocols for generating zebrafish models for systemic and localized human influenza A virus (IAV) infection are described. Using a systemic IAV infection model, small molecules with potential antiviral activity can be screened. As a proof-of-principle, a protocol that demonstrates the efficacy of the antiviral drug Zanamivir in IAV-infected zebrafish is described. It shows how disease phenotypes can be quantified to score the relative efficacy of potential antivirals in IAV-infected zebrafish. In recent years, there has been increased appreciation for the critical role neutrophils play in the human host response to influenza infection. The zebrafish has proven to be an indispensable model for the study of neutrophil biology, with direct impacts on human medicine. A protocol to generate a localized IAV infection in the Tg(mpx:mCherry) zebrafish line to study neutrophil biology in the context of a localized viral infection is described. Neutrophil recruitment to localized infection sites provides an additional quantifiable phenotype for assessing experimental manipulations that may have therapeutic applications. Both zebrafish protocols described faithfully recapitulate aspects of human IAV infection. The zebrafish model possesses numerous inherent advantages, including high fecundity, optical clarity, amenability to drug screening, and availability of transgenic lines, including those in which immune cells such as neutrophils are labeled with fluorescent proteins. The protocols detailed here exploit these advantages and have the potential to reveal critical insights into host-IAV interactions that may ultimately translate into the clinic.

Introduction

De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS), o vírus da gripe infectar 5-10% dos adultos e 20-30% das crianças anualmente e causar 3-5 milhões de casos de doença grave e até 500.000 mortes no mundo 1. vacinação anual contra a gripe continuam a ser a melhor opção para prevenir a doença. Esforços como o Plano de Acção Global da OMS têm aumentado o uso da vacina sazonal, a capacidade de produção de vacinas e pesquisa e desenvolvimento de estratégias de vacinas mais potentes, a fim de reduzir a morbilidade e mortalidade associada a surtos de gripe sazonais 2. Os medicamentos antivirais como inibidores da neuraminidase (por exemplo Zanamivir e oseltamivir) estão disponíveis em alguns países e provaram ser eficazes nos sintomas atenuantes, quando administrado nas primeiras 48 horas de início 3, 4, 5. Apesar dos esforços globais, a contenção da gripe sazonal UOtbreaks continua a ser um desafio formidável neste momento, como o vírus da gripe variação antigénica excede frequentemente capacidades actuais para se adaptar à evolução do genoma do vírus 6. estratégias de vacina visando novas estirpes do vírus devem ser desenvolvidos com antecedência e são, por vezes, tornar-se menos do que optimamente eficaz devido a mudanças imprevistas nos tipos de estirpes que, eventualmente, predominam em uma época de gripe. Por estas razões, existe uma clara necessidade de desenvolver estratégias terapêuticas alternativas para conter infecções e reduzir a mortalidade. Ao atingir uma melhor compreensão da interação vírus-hospedeiro, pode ser possível desenvolver novos medicamentos anti-gripe e terapias adjuvantes 7, 8.

O host-gripe humana A interação do vírus (IAV) é complexa. Vários modelos animais da infecção pelo IAV humana têm sido desenvolvidos, a fim de obter insights sobre a interação vírus-hospedeiro, incluing ratos, cobaias, ratos de algodão, hamsters, furões e macacos 9. Enquanto fornece dados importantes que melhoraram a compreensão da dinâmica de acolhimento-IAV, cada organismo modelo possui desvantagens significativas que devem ser considerados quando se tenta traduzir as descobertas em medicina humana. Por exemplo, os ratos, que são o modelo mais amplamente utilizado, não prontamente desenvolver sintomas de infecção induzidas IAV quando infectadas com gripe humana isola 9. Isto é porque os ratos não têm o tropismo natural para a gripe humana isolados uma vez que as células epiteliais do rato expressam ct-2,3 ligações de ácido siálico, em vez de os α-2,6 ligações de ácido siálico expressos em células epiteliais humanas 10. As proteínas hemaglutinina presentes em isolados humanos IAV favoravelmente ligar e entrar nas células hospedeiras tendo ligações de ácido siálico alfa-2,6 por meio de endocitose mediada por receptores 9, 11, </s-se> 12, 13. Como consequência, é agora aceite que no desenvolvimento de modelos de rato para a gripe humana, o cuidado deve ser tomado para emparelhar a tensão adequada de rato com a tensão adequada de gripe, de modo a alcançar fenótipos da doença que recapitulam aspectos da doença humana. Em contraste, as células epiteliais no tracto respiratório superior de furões possuem 2,6 a-ligações de ácido siálico que se assemelham a células de origem humana 14. Furões infectados compartilham muitas das características patológicas e clínicas observadas na doença humana, incluindo a patogenicidade e transmissibilidade dos vírus da gripe humanos e aviários 14, 15. Eles também são altamente passíveis de testes de eficácia da vacina. No entanto, o modelo de ferret para a gripe humana tem várias desvantagens relacionadas principalmente ao seu tamanho e custo de criação que fazem aquisição de estatisticamente signifidados signifi desafiadoras. Além disso, furões têm exibido previamente diferenças na farmacocinética dos medicamentos, biodisponibilidade e toxicidade que fazem eficácia teste difícil. Por exemplo, furões apresentar toxicidade para o M2 canal iônico amantadina inibidor 16. Assim, é claro que na escolha de um modelo animal para estudar dúvidas sobre infecções IAV humanos, é importante considerar as suas vantagens e limitações inerentes, e o aspecto da interacção hospedeiro-vírus que está sob investigação.

O peixe-zebra, Danio rerio, é um modelo animal que oferece oportunidades únicas para a investigação de infecção microbiana, resposta imune do hospedeiro, e terapias medicamentosas potenciais 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, <classe sup = "xref"> 24, 25, 26, 27, 28. A presença de ácidos siálicos α-2,6-ligadas na superfície de células do peixe-zebra sugeriu a sua susceptibilidade para IAV, o que foi confirmado em estudos de infecção e fotografada in vivo, utilizando uma estirpe repórter fluorescente de 19 IAV. Em peixes-zebra IAV-infectadas, a expressão aumentada dos antivirais ifnphi1 e MXA transcritos indicaram que uma resposta imune inata tinha sido estimulado, e a patologia exibida por peixe-zebra IAV-infectados, incluindo edema e destruição de tecidos, foi semelhante ao observado em infecções por influenza humanos . Além disso, o inibidor da neuraminidase IAV antiviral zanamivir mortalidade limitado e reduzido de replicação viral em peixes-zebra 19.

Neste relatório, um protocolo para o sistema iniciarinfecções IC IAV em embriões de peixe-zebra é descrita. Usando Zanamivir em doses clinicamente relevantes como uma prova de princípio, a utilidade deste modelo de peixe-zebra infecção IAV para rastreio de compostos para a atividade antiviral é demonstrada. Além disso, um protocolo para a geração de uma localizada, infecção epitelial IAV no peixe-zebra nadar bexiga, um órgão que é considerado anatomicamente e funcionalmente análogo ao do pulmão de mamífero 21, 29, 30, 31, é descrito. Usando este modelo de infecção localizada IAV, o recrutamento dos neutrófilos para o local da infecção podem ser rastreados, permitindo que as investigações sobre o papel dos neutrófilos em biologia IAV infecção e inflamação. Estes modelos de peixe-zebra complementar modelos animais existentes de infecções IAV humanos e são particularmente úteis para testar pequenas moléculas e as respostas de células imunitárias, devido à possibilidade de s reforçadapoder Serviço Estatístico, a capacidade de moderado a ensaios de alto rendimento, e as habilidades para rastrear o comportamento de células imunes e função com luz de microscopia.

Protocol

Todo o trabalho deve ser realizado utilizando nível de biossegurança 2 (ou BSL2) normas descritas pelos Centros de Controle de Doenças (CDC) e de acordo com as diretrizes fixadas pela Institutional Animal Care e Comitês Uso (IACUC). Por favor conferir com as autoridades apropriadas para garantir a segurança e conformidade. 1. Cuidados e Manutenção Zebrafish Gerar peixe-zebra e recolher o número necessário de embriões para as experiências. Quando necessário, os tanques …

Representative Results

Aqui, os dados que mostram como a infecção sistémica IAV no peixe-zebra pode ser usado para testar a eficácia do fármaco (Figura 1A) são fornecidos. Embriões em 48 horas pós-fertilização são injectados com APR8 (Figuras 1C, 1F), X-31 (Figuras 1E, 1G), ou NS1-GFP (Figuras 1 H-1I) através da conduta de Cuvier para iniciar uma infecção viral. Outro grupo de embriões em 48 horas pós-fertilização foram injet…

Discussion

Para maximizar os benefícios obtidos com o uso de um pequeno animal para modelar interações patógeno-hospedeiro humano, é importante para enquadrar questões de pesquisa e testar hipóteses que capitalizar sobre as vantagens inerentes do sistema modelo. Como um modelo para a infecção pelo IAV humano, o peixe-zebra tem vários pontos fortes, incluindo alta fecundidade, claridade óptica, receptividade ao rastreio de drogas, e da disponibilidade de linhas transgénicas que rotulam células do sistema imunológico, …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors wish to thank Mark Nilan for zebrafish care and maintenance and Meghan Breitbach and Deborah Bouchard for propagating NS1-GFP and determining IAV titers. This research was supported by NIGMS grant NIH P20GM103534 and the Maine Agricultural and Forest Experiment Station (Publication Number 3493).

Materials

Instant Ocean Spectrum Brands SS15-10
100 x 25 mm sterile disposable Petri dishes  VWR  89107-632
Transfer pipettes  Fisherbrand 13-711-7M
Tricaine- S (MS-222) Western Chemical
Borosilicate glass capillary with filament  Sutter Instrument  BF120-69-10
Flaming/Brown micropipette puller  Sutter Instrument  P-97
Agarose Lonza 50004
Zanamivir AK Scientific G939
Dumont #5 forceps  Electron Microscopy Sciences 72700-D
Microloader tips Eppendorf 930001007
Microscope immersion oil Olympus IMMOIL-F30CC
Microscope stage calibration slide  AmScope MR095
MPPI-3 pressure injector  Applied Scientific Instrumentation
Stereo microscope Olympus SZ61
Back pressure unit Applied Scientific Instrumentation BPU
Micropipette holder kit Applied Scientific Instrumentation MPIP
Foot switch Applied Scientific Instrumentation FSW
Micromanipulator Applied Scientific Instrumentation MM33
Magnetic base Applied Scientific Instrumentation Magnetic Base
Phenol red  Sigma-Aldrich  P-4758
Low temperature incubator VWR 2020
SteREO Discovery.V12 Zeiss
Illuminator Zeiss HXP 200C
Cold light source Zeiss  CL6000 LED
Glass-bottom multiwell plate, 24 well Mattek P24G-0-13-F
Confocal microscope Olympus IX-81 with FV-1000 laser scanning confocal system
Fluoview software Olympus
Prism v6 GraphPad
Influenza A/PR/8/34 (H1N1) virus  Charles River  490710
Influenza A X-31, A/Aichi/68 (H3N2)  Charles River  490715
Influenza NS1-GFP Referenced in Manicassamy et al. 2010
Tg(mpx:mCherry) Referenced in Lam et al. 2013

References

  1. De Clercq, E. Antiviral agents active against influenza A viruses. Nat Rev Drug Discov. 5 (12), 1015-1025 (2006).
  2. von Itzstein, M. The war against influenza: discovery and development of sialidase inhibitors. Nat Rev Drug Discov. 6 (12), 967-974 (2007).
  3. Fiore, A. E., et al. Antiviral Agents for the Treatment and Chemoprophylaxis of Influenza. Centers for Disease Control and Prevention. , 1-26 (2011).
  4. Krammer, F., Palese, P. Advances in the development of influenza virus vaccines. Nat Rev Drug Discov. 14 (3), 167-182 (2015).
  5. Ren, H., Zhou, P. Epitope-focused vaccine design against influenza A and B viruses. Curr Opin Immunol. 42, 83-90 (2016).
  6. Webster, R. G., Govorkova, E. A. Continuing challenges in influenza. Ann N Y Acad Sci. 1323, 115-139 (2014).
  7. Bouvier, N. M., Lowen, A. C. Animal Models for Influenza Virus Pathogenesis and Transmission. Viruses. 2 (8), 1530-1563 (2010).
  8. Ibricevic, A., et al. Influenza virus receptor specificity and cell tropism in mouse and human airway epithelial cells. J Virol. 80 (15), 7469-7480 (2006).
  9. Skehel, J. J., Wiley, D. C. RECEPTOR BINDING AND MEMBRANE FUSION IN VIRUS ENTRY: The Influenza Hemagglutinin. Annu Rev Biochem. 69 (1), 531 (2000).
  10. Rust, M. J., Lakadamyali, M., Zhang, F., Zhuang, X. Assembly of endocytic machinery around individual influenza viruses during viral entry. Nat Struct Mol Biol. 11 (6), 567-573 (2004).
  11. Stencel-Baerenwald, J. E., Reiss, K., Reiter, D. M., Stehle, T., Dermody, T. S. The sweet spot: defining virus-sialic acid interactions. Nature Rev Microbiol. 12 (11), 739-749 (2014).
  12. Herlocher, M. L., et al. Ferrets as a Transmission Model for Influenza: Sequence Changes in HA1 of Type A (H3N2) Virus. J Infect Dis. 184 (5), 542-546 (2001).
  13. Belser, J. A., Katz, J. M., Tumpey, T. M. The ferret as a model organism to study influenza A virus infection. Dis Model Mech. 4 (5), 575-579 (2011).
  14. Cochran, K. W., Maassab, H. F., Tsunoda, A., Berlin, B. S. Studies on the antiviral activity of amantadine hydrochloride. Ann N Y Acad Sci. 130 (1), 432-439 (1965).
  15. de Oliveira, S., Boudinot, P., Calado, A., Mulero, V. Duox1-derived H2O2 modulates Cxcl8 expression and neutrophil recruitment via JNK/c-JUN/AP-1 signaling and chromatin modifications. J Immunol. 194 (4), 1523-1533 (2015).
  16. de Oliveira, S., et al. Cxcl8 (IL-8) mediates neutrophil recruitment and behavior in the zebrafish inflammatory response. J Immunol. 190 (8), 4349-4359 (2013).
  17. Gabor, K. A., et al. Influenza A virus infection in zebrafish recapitulates mammalian infection and sensitivity to anti-influenza drug treatment. Dis Model Mech. 7 (11), 1227-1237 (2014).
  18. Galani, I. E., Andreakos, E. Neutrophils in viral infections: Current concepts and caveats. J Leukoc Biol. 98 (4), 557-564 (2015).
  19. Gratacap, R. L., Rawls, J. F., Wheeler, R. T. Mucosal candidiasis elicits NF-kappaB activation, proinflammatory gene expression and localized neutrophilia in zebrafish. Dis Model Mech. 6 (5), 1260-1270 (2013).
  20. Henry, K. M., Loynes, C. A., Whyte, M. K., Renshaw, S. A. Zebrafish as a model for the study of neutrophil biology. J Leukoc Biol. 94 (4), 633-642 (2013).
  21. Mathias, J. R., et al. Live imaging of chronic inflammation caused by mutation of zebrafish Hai1. J Cell Sci. 120 (19), 3372-3383 (2007).
  22. Shelef, M. A., Tauzin, S., Huttenlocher, A. Neutrophil migration: moving from zebrafish models to human autoimmunity. Immunol Rev. 256 (1), 269-281 (2013).
  23. Walters, K. B., Green, J. M., Surfus, J. C., Yoo, S. K., Huttenlocher, A. Live imaging of neutrophil motility in a zebrafish model of WHIM syndrome. Blood. 116 (15), 2803-2811 (2010).
  24. Yoo, S. K., et al. Differential regulation of protrusion and polarity by PI3K during neutrophil motility in live zebrafish. Dev Cell. 18 (2), 226-236 (2010).
  25. Yoo, S. K., Huttenlocher, A. Spatiotemporal photolabeling of neutrophil trafficking during inflammation in live zebrafish. J Leukoc Biol. 89 (5), 661-667 (2011).
  26. Yoo, S. K., et al. The role of microtubules in neutrophil polarity and migration in live zebrafish. J Cell Sci. 125 (23), 5702-5710 (2012).
  27. Winata, C. L., et al. Development of zebrafish swimbladder: The requirement of Hedgehog signaling in specification and organization of the three tissue layers. Dev Biol. 331 (2), 222-236 (2009).
  28. Perry, S. F., Wilson, R. J., Straus, C., Harris, M. B., Remmers, J. E. Which came first, the lung or the breath?. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 129 (1), 37-47 (2001).
  29. Gratacap, R. L., Bergeron, A. C., Wheeler, R. T. Modeling mucosal candidiasis in larval zebrafish by swimbladder injection. J Vis Exp. (93), e52182 (2014).
  30. Adatto, I., Lawrence, C., Thompson, M., Zon, L. I. A New System for the Rapid Collection of Large Numbers of Developmentally Staged Zebrafish Embryos. PLoS ONE. 6 (6), e21715 (2011).
  31. Manicassamy, B., et al. Analysis of in vivo dynamics of influenza virus infection in mice using a GFP reporter virus. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (25), 11531-11536 (2010).
  32. Lawrence, C. The husbandry of zebrafish (Danio rerio): a review. Aquaculture. 269 (1), 1-20 (2007).
  33. Lam, P. -. y., Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Heat Shock Modulates Neutrophil Motility in Zebrafish. PLoS ONE. 8 (12), e84436 (2013).
  34. Shelton, M. J., et al. Zanamivir pharmacokinetics and pulmonary penetration into epithelial lining fluid following intravenous or oral inhaled administration to healthy adult subjects. Antimicrob Agents Chemother. 55 (11), 5178-5184 (2011).
  35. Sullivan, C., Kim, C. H. Zebrafish as a model for infectious disease and immune function. Fish Shellfish Immunol. 25 (4), 341-350 (2008).
  36. MacRae, C. A., Peterson, R. T. Zebrafish as tools for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 14 (10), 721-731 (2015).
  37. Brandes, M., Klauschen, F., Kuchen, S., Germain, R. N. A systems analysis identifies a feedforward inflammatory circuit leading to lethal influenza infection. Cell. 154 (1), 197-212 (2013).
  38. Narasaraju, T., et al. Excessive neutrophils and neutrophil extracellular traps contribute to acute lung injury of influenza pneumonitis. Am J Pathol. 179 (1), 199-210 (2011).
  39. Pillai, P. S., et al. Mx1 reveals innate pathways to antiviral resistance and lethal influenza disease. Science. 352 (6284), 463-466 (2016).
  40. Stifter, S. A., et al. Functional Interplay between Type I and II Interferons Is Essential to Limit Influenza A Virus-Induced Tissue Inflammation. PLoS Pathog. 12 (1), e1005378 (2016).
  41. Vlahos, R., Stambas, J., Selemidis, S. Suppressing production of reactive oxygen species (ROS) for influenza A virus therapy. Trends Pharmacol Sci. 33 (1), 3-8 (2012).
  42. Palic, D., Andreasen, C. B., Ostojic, J., Tell, R. M., Roth, J. A. Zebrafish (Danio rerio) whole kidney assays to measure neutrophil extracellular trap release and degranulation of primary granules. J Immunol Methods. 319 (1-2), 87-97 (2007).
  43. Renshaw, S. A., et al. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
  44. Mathias, J. R., et al. Characterization of zebrafish larval inflammatory macrophages. Dev Comp Immunol. 33 (11), 1212-1217 (2009).
  45. Pase, L., et al. Neutrophil-delivered myeloperoxidase dampens the hydrogen peroxide burst after tissue wounding in zebrafish. Curr Biol. 22 (19), 1818-1824 (2012).
  46. Drescher, B., Bai, F. Neutrophil in viral infections, friend or foe?. Virus Res. 171 (1), 1-7 (2013).
  47. Iwasaki, A., Pillai, P. S. Innate immunity to influenza virus infection. Nat Rev Immunol. 14 (5), 315-328 (2014).
  48. Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nat Rev Immunol. 13 (3), 159-175 (2013).
  49. Summers, C., et al. Neutrophil kinetics in health and disease. Trends Immunol. 31 (8), 318-324 (2010).
  50. Tate, M. D., Brooks, A. G., Reading, P. C. The role of neutrophils in the upper and lower respiratory tract during influenza virus infection of mice. Respir Res. 9, 57 (2008).
  51. Tate, M. D., et al. Neutrophils ameliorate lung injury and the development of severe disease during influenza infection. J Immunol. 183 (11), 7441-7450 (2009).
  52. Tumpey, T. M., et al. Pathogenicity of influenza viruses with genes from the 1918 pandemic virus: functional roles of alveolar macrophages and neutrophils in limiting virus replication and mortality in mice. J Virol. 79 (23), 14933-14944 (2005).
  53. Wheeler, J. G., Winkler, L. S., Seeds, M., Bass, D., Abramson, J. S. Influenza A virus alters structural and biochemical functions of the neutrophil cytoskeleton. J Leukoc Biol. 47 (4), 332-343 (1990).
  54. de Oliveira, S., et al. Cxcl8-l1 and Cxcl8-l2 are required in the zebrafish defense against Salmonella Typhimurium. Dev Comp Immunol. 49 (1), 44-48 (2015).
  55. Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Neutrophils in host defense: new insights from zebrafish. J Leukoc Biol. 98 (4), 523-537 (2015).

Play Video

Cite This Article
Sullivan, C., Jurcyzszak, D., Goody, M. F., Gabor, K. A., Longfellow, J. R., Millard, P. J., Kim, C. H. Using Zebrafish Models of Human Influenza A Virus Infections to Screen Antiviral Drugs and Characterize Host Immune Cell Responses. J. Vis. Exp. (119), e55235, doi:10.3791/55235 (2017).

View Video