Summary
Gendeletionsmutanter som alstras genom homolog rekombination är guldstandarden för genfunktionsstudier. OSCAR (One Step Construction av Agrobacterium-Recombination-ready-plasmids) -metoden för snabb generering av deletionskonstruktioner beskrivs. Agrobacterium- medierad svamptransformation följer. Slutligen presenteras en PCR-baserad bekräftelsemetod av gendeletioner i svamptransformanter.
Abstract
Exakt deletion av gen (er) av intresse, medan resten av genomet oförändras, ger den idealiska produkten för att bestämma den specifika genens funktion i den levande organismen. I detta protokoll beskrivs OSCAR-metoden för exakt och snabb deletionsplasmidkonstruktion. OSCAR är beroende av kloningssystemet där en enda rekombinasreaktion utförs innehållande de renade PCR-amplifierade 5'- och 3'-flankerna av den aktuella genen och två plasmider, pA-Hyg OSCAR (markörvektorn) och pOSCAR (enheten vektor). Bekräftelse av den korrekt monterade deletionsvektorn utförs genom restriktionsmeltningskartläggning följt av sekvensering. Agrobacterium tumefaciens används sedan för att mediera införandet av deletionskonstruktionen i svampsporer (hänvisad till som ATMT). Slutligen beskrivs en PCR-analys för att bestämma om deletionskonstruktionen integreras genom homolog eller icke-homolog rekombination, indikerande gengenetion ellerEktopisk integration, respektive. Denna metod har framgångsrikt använts för att radera flera gener i Verticillium dahliae och i Fusarium verticillioides bland andra arter.
Introduction
Genetisk dissektion är en kraftfull metod för att bestämma individens funktionella betydelse eller kombinationer av gener. En standardinriktning för att förstå rollen av specifika gener är produktion av enkla genmutanter som oförändrats i någon annan gen. Det mest kraftfulla och minst potentiellt konfronterande tillvägagångssättet är fullständigt och exakt deletion av en gen av intresseens öppna läsram (GOI ORF) utan skada på någon annan genfunktion.
Eftersom standardiseringsmetoder för deletionsplasmidgenerering kräver flera steg, var det rationella för OSCAR 1 att producera en snabbare in vitro -tillvägagångssätt. Figur 1 visar monteringsprocessen i OSCAR-metoden. Förfarandet som beskrivs här har fördelen att kombinera snabb konstruktion av individuella gendeletionsvektorer i en enda multipartreaktion i kombination med efterföljande Agrobacterium tumefaciens- medierad transfoRmation (ATMT). OSCAR är mycket snabb och jämför bra med andra strategier, såsom användning av Gibson-montering i jäst 2 . OSCAR-metoden har använts framgångsrikt med flera Ascomycota-svamparter. Dessa arter inkluderar : Fusarium verticillioides (opublicerad), Verticillium dahliae 3 , Setosphaeria turcica 4 , Metarhizium robertsii 5 , Fusarium oxysporum f. sp. Vasinfectum 6 , Pestalotiopsis microspora 7 , Colletotrichum higginsianum 8 och Dothistroma septosporum 9 och Sarocladium zeae (opublicerad) .
Detta protokoll tillhandahåller steg för steg instruktion för metoden inkluderande primerdesign, flank-PCR-amplifiering, OSCAR BP-reaktion, deletionskonstruktionsbekräftelse, transformatJon av Agrobacterium med konstruktionen följt av ATMT-baserad överföring av deletionskonstruktionen i svampcellerna och slutligen differentierar svampdeletionsmutanter från de med ektopiskt integrerade deletionskonstruktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Primer Design för PCR Amplification of Gene Flanks
- Hämta till en textbehandlingsfil genom den genomiska regionen av genen av intresse (GOI) inklusive den öppna läsramen (ORF) och minst 2 kb flankera genen på varje sida från FungiDB eller annan genomisk dataförbrukning.
- Markera den ORF som är avsedd för radering och etikettstart och stoppkodon.
- Identifiera och markera angränsande ORF inom den nedladdade sekvensen.
- Använd 2-kb 5'-änden av GOI ORF och primerdesignverktyget (se Materiallista) för att designa PCR-primerparet O1 och O2 för att generera en produkt med minsta storlek på 1 kb. Var försiktig så att den inte påverkar intilliggande ORF.
- Klistra in 2 kb 5'-flanken i fönstret "Sequence Entry". Klicka på "Show Custom Parameters" rutan. Ange följande anpassade designparametrar: primer TM 58 (min), 60 (opt) och 62 (max); Primer GC 40 (min), 50 (opt) och 60 (max); Primerstorlek 22 (min), 24 (opt) och 26(Max); Amplicon Storlek 1250 (min), 1500 (opt) och 2000 (max).
- Välj det resultat som placerar den bakre primern (O2) närmast ORF. Fånga ett skärmdump av analyserna och kopiera och klistra in primersekvenserna i ordbehandlingsdokumentet.
- Upprepa processen för 3'-flanken för att generera primrarna O3 och O4, den här gången väljer resultatet att placera framåtriktaren (O3) närmast mål-ORF.
- Lägg till lämpliga fästplatser till 5'-ändarna av primrarna 1 till 4 (se tabell 1 ).
- Designa och beställa även ORF-specifika primers som ska användas för radering av radering i avsnitt 4 nedan. Parametrarna bör vara desamma som i steg 1.4.1 förutom att använda Amplicon Size 500 (min), 750 (opt) och 1000 (max) justering för längd ORF vid behov. Slutligen, för att bekräfta homologa rekombinanter, genererar 5'-ut och 3'-ut-primrar som ligger strax utanför flankerna i kromosomen. Dessa "ut" primers kommer att användas medHygR (210) respektive hygF (850) ( fig 2 ).
- Beställ primers.
2. Produktion av OSCAR Constructs
- Använda en högfärdig Taq, utföra två reaktioner, en vardera för 5'- och 3'-flanken, med användning av primers (100 μM) O1 och O2 i en reaktion och primrar O3 och O4 i den andra. Reaktionsblandningen innehåller följande: 29,5 μl sterilt destillerat vatten (SDW), 5 | il 10x LA PCR-buffert, 8 | il 2,5 mM dNTP-blandning, 5 | il 25 mM MgCl2, 1 | il mall (50 ng / Fidelity Taq , 0,5 μL Primer O1 och 0,5 μL Primer O2 för 5'-flank (eller 0,5 μL Primer O3 och 0,5 μL Primer O4 för 3'-flank) Använd reaktionsbetingelser är som följer: 94 ° C i 1 min, därefter 30 cykler av 94 ° C i 30 s, 60 ° C i 30 s, 72 ° C i 2 min, sedan slutliga steg av 72 ° C i 5 min och håll sedan obestämt vid 10 ° C.
- Kör 0,8%Agaros 1x TAE (40 mM Tris acetat pH 8,3, 1 mM EDTA) gelelektrofores för ca 125 Vh i en standard minigelapparat för bestämning av produktstorlek och relativ koncentration. Inlägg fläckar gelén med icke-etidiumfärg enligt tillverkarens instruktioner. Visualisera på en UV-belysning.
- Om 5'- och 3'-flankprodukterna är i ungefär jämn koncentration, kombinera dem och använd en affinitets-kolonnkit (eller PEG-utfällning 90 | jL kombinerad PCR-produkter, 240 | il TE buffert pH 7,5, 160 | il 30% polyetylenglykol PEG8000 30 mM MgCl 2 ) Samma renar PCR-produkterna enligt tillverkarens protokoll. Om de inte är lika koncentrerade kombinerar alla lågkoncentrationsprodukter med en beräknad lika stor mängd produkt från högre utbytesreaktionen.
- Använd en spektrofotometer för att mäta renad DNA-koncentration.
- Utför BP-reaktion genom att blanda följande: 1 μl 60 ng / μl pOSCAR, 2 μl 60 ng /ΜL pA-Hyg-OSCAR, 1 jil 60 ng / jil kombinerade flanker, 1 jil klonas. Inkubera i 16 h vid 25 ° C. Avsluta reaktionen genom att tillsätta 0,5 | il proteinas K och inkubera i 10 minuter vid 37 ° C.
- Överför hög kompetens E. Coli- celler. Både kommersiellt tillgängliga kompetenta celler och hemmagjorda DH5a CaCl2 kompetenta celler användes framgångsrikt som mottagare såsom beskrivits av tillverkarens instruktioner. Platta på låg natrium (0,5 g / 1 NaCl) LB innehållande 100 | ig / ml spektinomycin (Spec).
- Identifiera den korrekta konstruktionen genom att utföra DNA miniprepar 10 av kolonier genererade ovan. Utför dubbel digestion med Hin dIII och Kpn I enligt följande: pipett 5 μL DNA, 2 U av varje enzym, 2 μl lämplig 10x buffert med SDW till en totalvolym på 20 pl. Detta släpper in insatsen (cirka 4,5 kb med 1,5 kb genflankar) från vektorn ( ca 7 kb) och skär några platser iFlankar som kan ge förutsägbara bandstorlekar.
- Sekvens 11 väljer kloner som visar ett lämpligt bandmönster.
3. Agrobacterium tumefaciens Mediated Transformation (ATMT) av svampar
- Transformera Agrobacterium tumefaciens- stammen AGL1 med OSCAR-deletionskonstruktion 12 .
- Transform svamp med AGL1 innehållande GOI OSCAR deletionsplasmiden. Gör så här genom att göra följande:
- Förbered en svampspor suspension med sterilt vatten vid 2 x 106 sporer / ml. Kvantifiera sporer på en hemocytometer eller automatiserad cellräknare. Placera 500 μL av detta i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör. Denna inställning är för 4 transformationsplattor.
- Använd en blå steril engångsslinga för att lägga till en lätt synlig gob (bör täcka ca 20% av slingdiametern) av deletionsplasmiden innehållande AGL1 från 2-3 dagars LB-Spec 100 medium (se MAterials lista för komposition) innehållande plattor och blanda in i sporsuspensionen. Vortex till bakterieceller är väl dispergerade ( ca 5 min medelhastighet).
- Pipettera 100 μl av conidia-Agro-suspensionen i mitten av ett cellulosamembranfilter placerat på vardera av fyra 6 cm petriskålar innehållande samodlingsmedium 12 .
- Sprid suspensionen med sterila glaspärlor (ca 4) för att täcka hela membranfilterets yta. Alternativt sprida suspensionen med ett traditionellt spridarverktyg. Låt membranfiltret torka i en huva i ca 10 min, omslut med paraffinfilm. Upprepa steg 3.2.2 och 3.2.3 för att konfigurera flera transformationer.
- Inkubera plattan i 2 dagar vid rumstemperatur, inverterad.
- Överför membranfiltret på 6 cm Aspergillus selektionsmedium 12 plattor innehållande hygromycin B (Hyg) 150 μg / ml, 200 mM cefotaxim och 100 | ig / mlmoxalaktam. Inkubera vid rumstemperatur i 5-7 dagar före isolering av Hyg-resistenta kolonier.
- Med sterila tandpetare överför de förmodade transformanterna på 6 cm potatisdextrosagar (PDA) -plattor innehållande 150 μg / ml Hyg, 100 μg / ml kanamycin.
4. Deletion Mutant Identification by PCR
- Extrakt DNA för PCR från transformanter genom termolys 13 .
- När transformanter bildar kolonier på PDA från steg 3.2.7, använd en steril tandpetare för att överföra en liten mängd (2 mm x 2 mm) mycelium eller jästceller från kolonin till 100 μl lyslösning (50 mM natriumfosfat, pH 7,4, 1 mM EDTA, 5% glycerol) i ett mikrocentrifugrör.
- Inkubera blandningen vid 85-90 ° C under 20-30 minuter. Förvara det råa extraktet som innehåller genomiskt DNA vid -20 ° C tills användning i steg 4.2.
- Utför 4 PCR-reaktioner per transformant, en vardera till dEtektera homolog rekombination av respektive 5'- och 3'-flanken, en för den selekterbara markören (hygromycinfosfotransferas i detta fall) och en för GOI ORF.
OBS: Vi brukar använda billiga low-confidence Taq för dessa reaktioner. Reaktionsbetingelserna är som beskrivna i steg 2.1 ovan och innehåller SDW 20 | il, 10x Taq-buffert 2,5 | il, dNTPS (10 mM) 0,5 | il, hemgjord Taq 14 , 0,5 | il, primer A (100 | im) 0,5 | il, primer B ) 0,5 μl, mall 0,5 μl. Lägre koncentrationsprimerlager (10 | im) kan användas lika bra. - Kör en agarosgel ( t.ex. 0,8%) av PCR-produkterna. Deletionsmutanter kommer att producera Hyg-bandet men inte en ORF-produkt. Ektopiska integranter kommer att visa båda banden. Vildtyp kommer endast att producera ORF-bandet.
- Varaktigt lagra borttagningsmutanter (och en ektopisk transformant eller två för kontroller) för framtida bruk.
OBS: 15% glycerol används till sRivit våra stammar långsiktigt vid -80 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
OSCAR-metoden genererar i en enda reaktion en plasmid innehållande flankerna i målgenen som skall raderas kring den selekterbara markörkassetten. Produktionen av borttagningskonstruktioner med OSCAR är mycket effektiv. Systemet kan dock producera partiella konstruktioner innehållande vissa men inte alla tre fragmenten (de två genflankerna och den selekterbara markören). I allmänhet innehåller majoriteten av E. coli- transformanter den korrekta OSCAR-konstruktionen. Exempelvis visar Figur 2 OSCAR-deletionskonstruktionen för Verticillium dahliae- genen VDAG_06812. I detta fall saknar flankerna av VDAG_06812 Hin dIII eller Kpnl-ställen och därför bör en plasmidinsats av 4 247 bp frisättas. Figur 3 visar Hin dIII- Kpn I-restriktionsenzym-dubbel digestionsbekräftelse av den korrekta plasmidstrukturen med undantag för banor 5 och 11 som representerar anomalösa konstruktionerts. Figur 4 visar slutlig bekräftelse på två olika gendeletioner av Southern blot. Figur 5 visar ett slutgiltigt PCR-tillvägagångssätt som ett alternativ till Southern blot.
Figur 1: OSCAR-borttagningsreaktion. OSCAR-borttagningskonstruktionen innefattar separat PCR-amplifiering av 5'- och 3'-genflanken, följt av en BP-klonasreaktion med de kombinerade renade flankprodukterna och de binära och selektionsmarkörplasmiderna. B1r, B2r, B3, B4, Pl, P2r, P3, P4, Rl, R2, L3 och L4 representerar lambda-rekombinationsställen. Skriv ut med tillstånd från referens 1 .
Figur 2: OSCAR-borttagningskonstruktion för < Em> Verticillium Dahliae- genen VDAG_06812. Positioner av restriktionsenzymigenkänning och primerglödgningsställen för att verifiera korrekt deletionskonstruktionsstruktur visas. Skriv ut med tillstånd från referens 1 .
Figur 3: Restriktionsmältningsbekräftelse av deletionskonstruktionsstrukturen hos VDAG_06812 med KpnI och Hin dIII. Plasmiderna dubbelt digererades och analyserades genom gelelektrofores på en 0,8% agarosgel. Den korrekta konstruktionen alstrar två band, av ca 6,9 kb och 4,2 kb, som representerar den binära vektorns ryggraden och HygR-markören fuserad till respektive målgenflankerna. Skriv ut med tillstånd från referens 1 .
Figur 4: Southern blot hybridisering bekräftar deletion av VDAG_02161 och VDAG_09930 i V. dahliae med användning av OSCAR deletionskonstruktioner. Genomiska DNA-celler digererades med Bcl I. De probades därefter samtidigt med VDAG_02161 och VDAG_09930 ORF-prober. Hybridiseringsband är 2 757 bp och 1 426 bp för vildtyp alleler av VDAG_02161 respektive VDAG_09930. Proverna är följande: lane 1: vildtypstamme VdLs.17; Bana 2: deletionsmutantstamme 02161.1; Spår 3: deletionsmutantstamme 02161.3; Bana 4: ektopisk transformantstamme Ect 02161.2; Spår 5: deletionsmutantstamme 09930.3; Spår 6: deletionsmutantstamme 09930.10; Bana 7: ektopisk transformantstamme Ect 09930.4. Skriv ut med tillstånd från Referens 1 .
Figur 5: Deletion mutant bekräftelse med PCR. Analys av deletion och ektopiska Fusarium verticillioides transformanter för gen FVEG_13253. Banor 1 topp och botten, markör; Banor 2-6 top gel-transformant PCR 5 'ut fragment-amplifiering; Banor 7-11 topp gel ORF amplifiering; Banor 2-6 bottengel Hyg-genförstärkning; Banor 7-11 bottengel 3 'ut fragment-amplifiering. Prover är deletionsstammar 11/31 (banorna 2 och 7), 11/32 (banorna 3 och 8), 11/33 (banorna 4 och 9) och ektopiska transformanter 11/34 (banorna 5 och 10) och 11 / 35 (banorna 6 och 11).
| Primer | Använda sig av | Sekvens |
| Primer O1- (attB2r) | Amplifiering av 5'-flanken,Primer framåt | 5'-GGGGACAGCTTTCTTGTACAAAGTGGAA |
| Primer O2- (attB1r) | Förstärkning av 5'-flanken, primer omvänd | 5'-GGGGACTGCTTTTTTGTACAAACTTGT |
| Primer O3- (attB4) | Förstärkning av 3'-flanken, primer framåt | 5'-GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGTT |
| Primer O4- (attB3) | Förstärkning av 3'-flanken, primer omvänd | 5'-GGGGACAACTTTGTATAATAAAGTTGT |
Tabell 1: Specifika OSCAR-primer-5'-förlängningar tillsatta till genspecifika primersekvenser.
| Primer | Använda sig av | Sekvens |
| OSC-F | 5'-CTAGAGGCGCGCCGATATCCT | |
| OSC-R | OSCAR-omvänd sekvenseringsprimer, sekvenser antisenssträng av 5'-flanken | 5'-CGCCAATATATCCTGTCAAACACT |
| HygR (210) | Omvänd sekvenseringsprimer, sekvenser antisenssträng av 5'-flanken | 5'-GCCGATGCAAAGTGCCGATAAACA |
| HygF (850) | Framåtriktad sekvenseringsprimer, sekvenser känner sträng av 3'-flanken | 5'-AGAGCTTGGTTGACGGCAATTTCG |
| Ny Hygmarkör framåt | För att amplifiera hygromycinresistensgenen som en kontroll (tillsammans med New Hyg Marker Reverse Primer nedan) | 5'-GACAGGAACGAGGACATTATTA |
| Ny Hyg Marker Omvänd | För att förstärka hygromycinresistensgenen som en kontroll (tillsammans med New Hyg Marker Forward-primer ovan) | 5'-GCTCTGATAGAGTTGGTCAAG |
Tabell 2: Primers för analys av OSCAR deletionskonstruktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Enstegsbyggande av Agrobacterium- Recombination-ready-plasmids (OSCAR) har framgångsrikt använts med ett ständigt ökande antal Ascomycota-svampar. Metoden bör också lätt kunna tillämpas på basidiomycotan och arten från andra svampfyla (med lämpliga promotorer som driver selekterbara markörgener), förutsatt att Agrobacterium- medierad transformation och homolog rekombination är möjliga. Ytterligare markörvektorer har genererats för att diversifiera val av anti-svampförening samt tillåta produktion av dubbel- och högre-ordermutanter. Dessa inkluderar resistens mot G418, nourseotricin och nyligen har herbiciderna glufosinat ammonium och klorimuron etyl 4 .
Metoden utarbetades för användning med Verticillium dahliae, från vilken bilderna som presenteras här huvudsakligen härrör från 1 . Mer nyligen OSCAR har använts i stor utsträckning för raderingAv gener i mykotoxigena svampen Fusarium verticillioides. Över 60 deletionskonstruktioner har gjorts och deletionsmutanter för mer än 30 gener genererade (opublicerade).
I sin nuvarande iteration kräver processen ca 4-6 veckor att ha en uppsättning bekräftade deletionsmutanter i handen. Nedan följer en kort lista över de stora OSCAR-stegen och ungefärlig tid som krävs för att uppnå dem: 1) Design och upphandling av OSCAR-primers baserat på genomdata (5 dagar), 2) flankförstärkning och kloning, (2 dagar), 3) Klonbekräftelse av miniprep och sekvensering (1 vecka), 4) införande av plasmid i Agrobacterium för ATMT (4 dagar), 5) produktion av transformanter genom ATMT i Fusarium verticillioides och växa ut (2 veckor, notera att detta är beroende av tillväxthastighet Av svampen som studeras), termolys och PCR-bestämning av transformantgenotyper (2 dagar), 6) enkel spårning, genotypbekräftelse och lagring (1-2 veckor).
15 . Andra OSCAR-markörplasmider, såsom pA-Bar-OSCAR och pA-Sur-OSCAR, kan vara tillgängliga från författare 5 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja.
Acknowledgments
Författarna tackar följande grund- och gymnasieelever för deras arbete att generera OSCAR-mutanter i Fusarium verticillioiodes : Anjellica Miller, Athar Naseer, Xiu Lin, Katelyn Woodburry, Chelsea Patterson, Kathleen Robertson, Krystina Bradley, Ashton Rogers, Alexis McKensie, Manny Hernandez Ashle Crepsac, Jeff Delong, Christian King, Gi Jeong, Maria Belding, Christy Burre, Daniel O'Meara, Lauren (Victoria) Cook, Jake Goodman, Sampriti De, Oge Okoye, Alyssa Beckstead, Garrett Hibbs, Nick Goldstein, Caroline Twum , Chris Benson, Louis Stokes, Hannah Itell, Jane Hulse, Jasim Mohammed, James Loggins, Kelli Russell, Gre'Nisha Jones, Kristin Sheaffer, Mariam Hammady, Ava Wilson, Katrina Bazemore, Toney Harper, Karlin McGhee, Mohmed Momin, Rima Momin , Thi Ngoc Le och Angel Pham.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FungiDB | Database/ http://fungidb.org/fungidb/ | ||
| IDT PrimerQuest | IDT | Primer design online software/ http://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index | |
| Microsoft Word | Sequence file manipulation | ||
| Low Na LB Spec 100 medium | E. coli transformant selection, composition: 1% tryptone, 0.05% NaCl, 0.5% yeast extract, 1.5% agar if for solid medium | ||
| Co-cultivation medium | ATMT transformation induction (Reference 12) | ||
| Aspergillus minimal medium with Hygromycin | Fungal transformant selection | ||
| PDA medium | Acumedia | 7149A | Single spore slant tubes |
| PDA-Hyg-Kan medium | Fungal ransformant isolation, PDA containing 150 μg/mL hygromycin B and 100 μg/mL Kanamycin | ||
| Glass beads | Genlantis | C400100 | Plate spreading |
| Nitrocellulose filters (47 mm) | Fisher | 09-719-555 | Co-culturing for ATMT |
| Various centifuge tubes | multiple preps | ||
| Petri plates (various) | Culturing of bacteria and Fungi | ||
| pA-Hyg OSCAR | Addgene | 29640 | Selectable marker vector |
| pOSCAR | Addgene | 29639 | Assembly vector |
| DH5α One Shot Competent E. coli cells | Life Technologies | 12297-016 | BP reaction transformation |
| ccdB survival E. coli cells | Life Technologies | A10460 | Maintenance of pOSCAR |
| Wooden transfer sticks | Colony streaking | ||
| Toothpicks | Colony picking | ||
| Microcentrifuge | Pelleting Bacteria, etc. | ||
| Preparative centrifuge | Fungal spore collection | ||
| Dissecting microscope | Single spore isolation | ||
| Automated Cell Counter | Spore suspension calculation | ||
| Compound microscope | Hemocytometer cell counting | ||
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | PCR gene flank produict purification |
| TaKaRa LA Taq | Takara Bio USA | RR002A | Hi Fidelity taq polymerase for OSCAR flank generation |
| Hygromycin B | InvivoGen | ant-hg-5 | |
| Spectinomycin | Sigma | 22189-32-8 | |
| Cefotaxime | TCI America | C2224 | |
| Kanamycin | 11815032 | ||
| Moxalactam | Sigma-Aldrich | 43963 | |
| GelRed | Phenix Research Products | RGB-4103 | Post staining agarose gels |
| Qiagen QIAquick PCR Purification Kit (Cat. No. 28104) | |||
| (OneShot_ Mach1TM T1R or One Shot_ OmniMAX™ 2 T1R from Invitrogen) | Thermo Fisher Scientific | C862003 | |
| Gateway BP Clonase II Enzyme mix | Thermo Fisher Scientific | 11789020 | Used to assemble deletion construct in pOSAR |
References
- Paz, Z., García-Pedrajas, M. D., Andrews, D. L., Klosterman, S. J., Baeza-Montañez, L., Gold, S. E. One step construction of Agrobacterium-Recombination-ready-plasmids (OSCAR), an efficient and robust tool for ATMT based gene deletion construction in fungi. Fungal Genet Biol. 48 (7), 677-684 (2011).
- Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Klosterman, S. J., et al. Comparative genomics yields insights into niche adaptation of plant vascular wilt pathogens. PLoS Pathog. 7 (7), (2011).
- Xue, C., Wu, D., Condon, B. J., Bi, Q., Wang, W., Turgeon, B. G. Efficient gene knockout in the maize pathogen Setosphaeria turcica using Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. Phytopathology. 103 (6), 641-647 (2013).
- Xu, C., et al. A high-throughput gene disruption methodology for the entomopathogenic fungus Metarhizium robertsii. PloS One. 9 (9), (2014).
- Crutcher, F. K., Liu, J., Puckhaber, L. S., Stipanovic, R. D., Bell, A. A., Nichols, R. L. FUBT, a putative MFS transporter, promotes secretion of fusaric acid in the cotton pathogen Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum. Microbiology. 161, 875-883 (2015).
- Yu, X., Wang, Y., Pan, J., Wei, D., Zhu, X. High frequency of homologous gene disruption by single-stranded DNA in the taxol-producing fungus Pestalotiopsis microspora. Ann Microbiol. 65 (4), 2151-2160 (2015).
- Korn, M., Schmidpeter, J., Dahl, M., Müller, S., Voll, L. M., Koch, C. A Genetic Screen for Pathogenicity Genes in the Hemibiotrophic Fungus Colletotrichum higginsianum Identifies the Plasma Membrane Proton Pump Pma2 Required for Host Penetration. PloS One. 10 (5), e0125960 (2015).
- Chettri, P. Regulation of dothistromin toxin biosynthesis by the pine needle pathogen Dothistroma septosporum: a thesis presented in the partial fulfilment of the requirements for the degree of Doctor of Philosophy (PhD) in Genetics at Massey University, Manawatu, New Zealand . , Massey University. Manawatu, New Zealand. (2014).
- Chen Zhou,, Yujun Yang,, Jong, A. Y.
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. P Natl Acad SciUSA. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- Khang, C. H., Park, S. Y., Rho, H. S., Lee, Y. H., Kang, S. Filamentous fungi (Magnaporthe grisea and Fusarium oxysporum). Agrobacterium Protocols. Wang, K. an 2, Humana Press Inc. Totowa, NJ. 403-420 (2007).
- Zhang, Y. J., Zhang, S., Liu, X. Z., Wang Wen, H. A., M, A simple method of genomic DNA extraction suitable for analysis of bulk fungal strains. Lett Appl Microbiol. 51 (1), 114-118 (2010).
- Pluthero, F. G. Rapid purification of high-activity Taq DNA polymerase. Nucleic Acids Res. 21 (20), 4850-4851 (1993).
- McCluskey, K. Boosting Research and Industry by Providing Extensive Resources for Fungal Research. Gene Expression Systems in Fungi: Advancements and Applications. , Springer International Publishing. 361-384 (2016).
