Summary
Dieser Artikel enthält detaillierte Methodik zur Identifizierung und funktionelle T-Lymphozyten-Untergruppen, die innerhalb Maus Niere, Aorta und der Lymphknoten durch die intrazelluläre Färbung und Durchflusszytometrie zu quantifizieren. Das Modell der Angiotensin-II-induzierte Hypertonie wurde zu erklären, ausgewählt, Schritt-für-Schritt, die Verfahren und die grundlegenden Prinzipien der Durchflusszytometrie und intrazelluläre Färbung.
Introduction
Neuere Erkenntnisse zeigen , dass das adaptive Immunsystem, insbesondere T - Lymphozyten, eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung verschiedener kardiovaskulärer Erkrankungen 1,2,3,4,5 spielen. Beispielsweise im Modell der Angiotensin - II induzierten Bluthochdruck, eine Anhäufung von T - Zellen in den Gefäßen und den Nieren der Mäuse wurde 6 beschrieben. Das vaskuläre Akkumulation überwiegend in der Adventitia und des perivaskulären Fett. In der Niere akkumulieren T-Zellen sowohl in der Medulla und Nierenrinde. Je nachdem , welche Teilmenge beteiligt ist, geben diese T - Zellen zu unterschiedlichen Zytokine, vaskulären und renalen Funktion und führen zur Entwicklung der Pathologie (rezensiert von McMaster et al. 6) beeinflussen.
T - Helfer 1 (Th1), Th2, Th9, Th17, Th22, regulatorischen T (Treg - Zellen) und T follikulären Helfer (Tfh) Zellen auf der Grundlage ihrer Funktionen und Unterschrift Zyto: CD4 + T - Helfer - Lymphozyten können in mehrere Untergruppen unterteilt werdenkines 7. In ähnlicher Weise können CD8 + zytotoxische T - Zellen als Tc1, Tc2, TC17 oder Tc9 8 klassifiziert werden. Es gibt auch doppelt negative T - Zellen (dh Zellen, die die CD4 oder CD8 - T - Zell - Marker nicht exprimieren). Eine Teilmenge dieser Zellen besitzen eine alternative gamma delta T-Zellen-Rezeptor (anstelle der klassischen Alpha- und Beta-Rezeptoren) und werden deshalb nachfolgend als gamma delta T-Zellen. Die Multi-Parameter-Analyse mittels Durchflusszytometrie von Oberflächenmarker, Cytokinen und Transkriptionsfaktor bildet den besten Ansatz, um diese Zellen zu identifizieren. Obgleich dieses Verfahren weitgehend auf dem Gebiet der Immunologie verwendet wird, ist es weniger gut in festen Organen und bei der Festlegung von cardiovaskulären Erkrankungen beschrieben.
Historisch gesehen war die Identifizierung von Lymphozyten in Gewebe zu Immunhistochemie oder RT-PCR Ansätze beschränkt. Obwohl Immunhistochemie und Immunfluoreszenz sind leistungsfähige Methoden, um die Gewebeverteilung eines Antigens von int zu bestimmenerest, sie sind unzureichend phänotypisch die Untergruppen identifizieren beteiligt. Darüber hinaus, während RT-PCR-Analyse nützlich ist, die mRNA-Expression von Antigenen, Cytokinen oder Transkriptionsfaktoren zu erkennen, erlaubt es nicht die Detektion von mehreren Proteinen gleichzeitig auf der Ebene einzelner Zellen.
Das Aufkommen der Durchflusszytometrie, vor allem, wenn sie mit intrazellulären Färbung kombiniert Zytokinen und Transkriptionsfaktoren zu erfassen, stellt die Ermittler mit einer leistungsstarken Technik, die Identifizierung und Quantifizierung auf Einzelzellebene von Immunzelluntergruppen in festen Organen ermöglicht. Wir haben eine intrazelluläre Anfärbung Assay optimiert durch Durchflusszytometrie der großen T-Zell-Untergruppen, die innerhalb murine Nieren Aorta und aortic drainierenden Lymphknoten in einem Modell von Angiotensin II induzierten Bluthochdruck zu identifizieren. Die Optimierung jedes Schrittes: Gewebe Verdauung, ex vivo - Aktivierung, Permeabilisierung und Oberfläche und die intrazelluläre Färbung entsteht ein hoch wiederproduzierbar Assay, der auf andere kardiovaskuläre und renale Krankheitsmodellen angewendet werden kann.
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Protocol
Vanderbilt University Institutional Animal Care und Use Committee hat die hier beschriebenen Verfahren genehmigt. Die Mäuse werden untergebracht und versorgt in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren (National Academies Press. Überarbeitete 2010).
1. Isolierung des Aorten-Lymphknoten, Niere und Aorta von Mäusen
- Euthanize die Mäuse durch CO 2 Inhalation. Sprühen Sie die Brust mit 70% Ethanol und vorsichtig die Haut öffnen und die Brustwand mit einer Schere das Herz aussetzen.
- Um die Vaskulatur perfundieren, einen kleinen Einschnitt in den rechten Vorhof durchzuführen und kontinuierlich einzuspritzen mindestens 10 ml kaltem PBS (etwa 1 ml / sec) in die Spitze des linken Ventrikels unter Verwendung eines 21 oder 23 G-Nadel. Perfuse bis alle Organe blanchiert haben. Das Herz blanches zuerst. der Leber Blanchierens anzeigt, dass die Perfusion gut durchgeführt wurde.
- Mit Hilfe von kleinen Zange und einer feinen Schere vorsichtig aufgeschnitten und herausziehen, den Darm,Magen, Milz, Bauchspeicheldrüse und Leber, um besser die Aorta zu visualisieren.
HINWEIS: Dieser Schritt hat eine Beschädigung an den Gastrointestinaltrakt Kontamination hervorrufen kann sehr genau durchgeführt werden. - Schneiden Sie und nehmen Sie jede Lunge mit einer Schere. Spülen Sie die Brusthöhle mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), um eine nadellose Spritze verwendet wird. Entfernen Sie überschüssiges Blut und Flüssigkeit mit steriler Gaze.
- Entfernen Sie die Bauch-Aorten-Lymphknoten mit feinen Dissektionszangen. Achten Sie darauf, nicht um die Kapsel zu brechen. Entfernen Sie die restlichen Fett auf der Oberfläche jeder Lymphknoten mit den Dissektionszangen. Schneiden Sie die beiden Nieren mit einer feinen Schere.
- Präparieren Sie die gesamte Aorta (thorakalen und abdominalen Aorta) mit feinen, gebogenen Schere. Starten Sie auf der Ebene des Herzens und sorgfältig sezieren entfernt von der Speiseröhre und der Wirbel bis auf die Ebene der iliakalen Bifurkation sicherstellen, dass die umgebende perivaskulärem Fett an der Aorta befestigt zu halten.
HINWEIS: Weitere Dissektion der Aorta remove umgebenden Strukturen unter dem Mikroskop durchgeführt werden kann. Insbesondere entfernen Arterienäste (Arteria carotis, subclavia, abdominal, mesenterialen und Nierenarterien) und Lymphknoten. Halten Sie eine einheitliche Schicht von perivaskulären Fett um jede Aorta, da dies ein Ort ist, wo viele Entzündungszellen in der Einstellung der Hypertonie liegen. Legen Sie jedes Gewebe in getrennten Röhrchen mit kaltem PBS.
2. Erzeugung von Einzelzellsuspensionen aus jedem Gewebe
- Die Nieren
HINWEIS: Die Niere kann durch die Kombination von mechanischer Dissoziation und enzymatischen Verdau in eine Einzelzellsuspension dissoziiert werden.- Bereiten Sie die Niere Aufschlußlösung durch Zugabe von Kollagenase D (2 mg / ml) und DNase I (100 ug / ml) zu RPMI 1640-Medium (ergänzt mit 5% fötalem Rinderserum (FBS)). Herstellung von 10 ml pro Nierenprobe.
- Verwenden einer Pinzette die beiden Nieren in eine Dissoziation Rohr zu übertragen, die 10 ml Niere verdauenIonenlösung.
- Führen Sie die mechanische Dissoziation eines halbautomatischen Dissociator Gerät gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Nach der mechanischen Dissoziation, nehmen Sie den Schlauch aus dem Gerät und die enzymatische Verdauung durchführen. Inkubiere die Proben für 20 min bei 37 ºC unter kontinuierlicher Drehung. stoppen Sie sofort die enzymatische Verdauung von kaltem RPMI 1640-Medium, ergänzt mit 5% FBS Zugabe.
- Die Lösung wird durch Pipettieren in ein 50 ml konisches Röhrchen nach dem Filtrieren durch ein 40 um Sieb. Necken das verbleibende Gewebe auseinander, indem sie mit dem Kolben einer 1 ml-Spritze gedrückt. Pellet die Zellen (500 · g, 8 min, 4 ° C).
- Das Pellet in 3 ml 36% Dichtegradientenzentrifugation Medien. Übertragung der Suspension in einen 15 ml konischen Röhrchen. fügen Sie vorsichtig 3 ml 72% Dichtegradientenzentrifugation Medien unterhalb der 3 ml 36% ige Zellsuspension ohne Unterbrechung. Zentrifuge (1000 xg ohne Bremse, 20 min, 4 ° C). </ Li>
- Die Immunzellen an der Grenzfläche befinden. Entfernen Sie die oberste gelbliche Schicht Zelltrümmer enthält, und dann das Volumen bringen bis zu 15 ml mit kaltem PBS. Gut schütteln, um den Verlauf Zusammenbruch. Dreh die Zellen (300 · g, 8 min, 4 ° C) und das Pellet in 3 ml RPMI mit 5% FBS. Zählen Sie die Anzahl der lebenden Zellen auf einem Hämozytometer unter Verwendung von Trypanblau-Ausschluss.
- die Aorta
- Bereiten Sie die Aorta Aufschlußlösung durch Kollagenase A Zugabe (1 mg / ml), Kollagenase B (1 mg / ml) und DNase I (100 ug / ml) zu RPMI 1640-Medium (ergänzt mit 5% FBS).
- Mit einer feinen Pinzette, übertragen Sie die Aorta in ein 2-ml-Röhrchen mit 1 ml Aorta Aufschlußlösung. Mince die ganze Aorta in sehr kleine Stücke mit einer feinen Schere in der 1 ml Aufschlußlösung. Halten Sie sich auf dem Eis. Inkubiere die Proben für 30 min bei 37 ° C unter ständiger Rotation.
- Die Lösung wird in einer Gewebekulturschale und stoppen Sie die enzymatic Verdau durch Zugabe von 5-fache des Volumens von kaltem RPMI mit 5% FBS.
- Die Lösung wird durch Pipettieren in ein 50 ml konisches Röhrchen nach dem Filtrieren durch ein 40 um Sieb. Necken das verbleibende Gewebe auseinander in eine Einzelzellsuspension durch mit dem Kolben einer 1 ml-Spritze gedrückt. Spülen Sie das Sieb und Pellet die Zellen (300 · g, 8 min, 4 ° C).
- Waschen des Pellets mit 10 ml RPMI mit 5% FBS hinzugefügt wird. Dreh die Zellen (300 · g, 8 min, 4 ° C) und das Pellet in 3 ml RPMI mit 5% FBS. Zählen Sie die Anzahl der lebenden Zellen auf einem Hämozytometer unter Verwendung von Trypanblau-Ausschluss.
- Die Aorten - Lymphknoten
- Legen Sie eine 40 & mgr; m Sieb in einer Gewebekulturschale (60 mm x 15 mm). Legen Sie die Lymphknoten auf dem Sieb und necken sie auseinander in eine Einzelzellsuspension durch mit dem Kolben einer 1-ml-Spritze drücken. Spülen Sie das Sieb mit 2 ml RPMI mit 5% FBS. Sammle die Zellen in der Schale.
- Übertragungdie Zellen in einem 15 ml Falcon-Röhrchen und die Zellen Pellet (300 · g, 8 min, 4 ° C). Das Pellet in 500 ul RPMI mit 5% FBS. Zählen Sie die Anzahl der lebenden Zellen auf einem Hämozytometer unter Verwendung von Trypanblau-Ausschluss.
3. Ex - vivo - Stimulation für Zytokin - Nachweis durch Durchflusszytometrie
- Bereiten Sie die Zellkulturmedium: RPMI mit 5% FBS, 0,1 mM nicht-essentielle Aminosäuren, 50 & mgr; M β-Mercaptoethanol und 1% Penicillin / Streptomycin.
- Zentrifuge jeder Zellsuspension aus der Niere, Aorta und Lymphknoten erhalten (300 · g, 8 min, 4 ° C). Resuspendieren jedes Pellet mit dem Zellkulturmedium in einer Konzentration von 1 x 10 6 Zellen pro ml.
- Stimuliert die Zellen durch Zugabe von 2 & mgr; l der Zellaktivierung Cocktail (mit Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA), dem Calcium-Ionophor Ionomycin und dem Golgi-Inhibitor Brefeldin A) pro 1 ml der Zellkultur.
HINWEIS: Die Endkonzentrations der einzelnen Komponenten sind: 81 nM PMA, 1,33 & mgr; M Ionomycin und 5 ug / ml Brefeldin A. Behandlung mit PMA und Ionomycin aktiviert Zellen Zytokine zu produzieren. Cytokine sind sezernierte Proteine, die in den Zellen eingefangen werden müssen, erkannt werden. Brefeldin A bewirkt, dass die Anhäufung von normalerweise sekretierten Proteinen in das endoplasmatische Retikulum und den Golgi-Apparat. So beschriebene Technik hier erhöht die Nachweisbarkeit von Cytokin-produzierenden Lymphozyten mittels Durchflusszytometrie. - Platte 1 bis 2.000.000 Zellen in einer 12-Well (Aorta oder Niere) oder mit 24 Vertiefungen (Lymphknoten) geringe Haftplatten. Die Platte wird in einem 37 ° C befeuchteten CO 2 Inkubator für 3 Stunden.
HINWEIS: Die Anzahl der plattierten Zellen können von Kontrollmäusen in Lymphknoten niedriger sein. Auch hat die Zeit der Stimulation empirisch für jede Zellpopulation und Zytokinproduktion untersucht bestimmt werden. Im Falle von T-Zellen von Aorta, Niere oder Lymphknoten isoliert, empfehlen wir stimulierenden für 3 bis 4 Stunden. Eine längere Stimulation wkrank nicht die Zytokinsekretion erhöhen und eine weitere Herabregulation von mehreren T-Zell-Oberflächenmarker wie CD3, CD4 und CD8 induzieren. (Beachten Sie, dass selbst eine 3-4 Stunden Stimulation wird einige Herunterregulierung dieser Marker induzieren.)
4. Oberflächenfärbung
- Übertragen Sie die Zellen in eine Polystyrol-FACS-Röhrchen und zentrifugiert (300 · g, 8 min, 4 ° C). Wasche die Zellen zweimal mit FACS - Puffer (Ca 2+ und Mg + free PBS , enthaltend 4% FBS und 2 mM EDTA) und teilen sich die Zellsuspension gleichmäßig in verschiedene FACS - Röhrchen basierend auf der Anzahl von Antikörper - Panels gewünschten und der Anzahl der Kontrollröhrchen benötigt ( siehe unten).
- Zur Kompensation für jedes Panel ausführen, bereiten ungefärbten Kontrollröhrchen und einzelne gefärbten Röhrchen für jede Gewebeart und Antikörper-Panel. Darüber hinaus Fluoreszenz minus eins (FMO) Kontrollröhrchen für jeden Antikörper Tafel herzustellen, indem man alle bis auf einen der Antikörper hinzugefügt wird.
- Stellen Sie die Lautstärke der einzelnen Röhrchen auf 2 ml mit FACSPuffer. Centrifuge die Zellsuspension (300 · g, 8 min, 4 ° C), entfernen Sie den Überstand und Block Fc-Rezeptoren durch die Zellen Inkubation mit 0,5 ug anti-CD16 / CD32-Antikörper pro Million Zellen für 10 min auf Eis.
HINWEIS: CD16 ist eine geringe Affinität IgG-Fc-Rezeptor III (FcR III) und CD32 ist FcR II. CD16 / CD32 auf Granulozyten, Mastzellen, Monozyten / Makrophagen, natürliche Killerzellen, B-Zellen, dendritischen Zellen und einigen aktivierten reifen T-Zellen exprimiert wird. - Führen Sie die Lebensfähigkeit Färbung: Waschen Sie die Zellen mit 1x PBS, Zentrifuge (300 · g, 8 min, 4 ° C) und resuspendieren in 1000 ul 1x PBS. 1 & mgr; l eines zell impermeant aminreaktiven Farbstoff (Lebensfähigkeit stain). Inkubieren für 15 min bei 4 ° C vor Licht geschützt.
- Während der Inkubation bereiten den Cocktail von Antikörpern (für Oberflächenfärbung) in einem geeigneten Volumen von FACS-Puffer. Wasche die Zellen zweimal mit 1-2 ml FACS-Puffer, Zentrifuge (300 · g, 8 min, 4 ° C) und resuspendieren jedes Pellet mit 100 ulder Antikörpermischung. Inkubieren für 30 min bei 4 ° C vor Licht geschützt.
HINWEIS: Für jede Durchflusscytometrie-Antikörper, es ist nützlich, um die optimale Menge an Antikörper, der durch Durchführen einer Dosis Titrationskurve erforderlich zu bestimmen. - Wasche die Zellen zweimal mit 2 ml FACS-Puffer und pelletieren Sie die Zellen (300 · g, 8 min, 4 ° C).
5. Fixierung, Permeabilisierung und intrazelluläre Färbung
- Führen Sie die intrazelluläre Färbung mit einer Fixierung und Permeabilisierung Kit mit geeigneten Puffern durch den Anweisungen des Herstellers folgen. Fix und die Zellen permeabilisiert, indem sie in dem geeigneten Puffer resuspendieren. Inkubieren Proben für 40 Minuten bei 4 ° C vor Licht geschützt.
- 1 ml 1x Permeabilisierung und Waschpuffer direkt zu den festen und permeabilisierten Zellen. Zentrifuge (500 · g, 8 min, 4 ° C) und den Überstand entfernen. Das Pellet mit 2 ml 1x Waschpuffer.
- Bereiten Sie die Mischungen aus ANTIBodies (für intrazelluläre Färbung nur) in einem geeigneten Volumen 1x Waschpuffer (in der Regel 100 & mgr; l pro Röhrchen).
HINWEIS: Wie oben beschrieben, ist die optimale Antikörperkonzentration muss für jeden Antikörper in der Platte bestimmt werden. Zum Beispiel für Antikörper gegen IL-17A oder IL-17F, verwenden wir ein Verdünnungsfaktor von 1:30, aber für Antikörper gegen IFNy und T-bet, verwenden wir ein Verdünnungsfaktor von 1: 100. - Zentrifuge die Zellen (500 · g, 8 min, 4 ° C) und jedes Pellet mit 100 ul der Antikörpermischung resuspendieren. Inkubieren für 40 Minuten bei 4 ° C vor Licht geschützt.
- Waschen Sie die Zellen zweimal mit 2 ml 1x Waschpuffer und Pellet die Zellen (500 · g, 8 min, 4 ° C). Das Pellet mit 300 ul 1x Waschpuffer und zu analysieren, auf einem Durchflusszytometer mit geeigneten Filtern.
- Zur Quantifizierung der Gesamtzahl der Zellen pro Gewebeprobe, Zählen Perlen verwenden. Vor der Akquisition der empfohlenen Volumen / Anzahl der Perlen in jedes Röhrchen zu zählen.
6. Entschädigung, Gating, Normalisierungs und Tipps
- Kompensation und Gating
- Führen Sie ungefärbten und einzelne gefärbten Kontrollröhrchen zur Kompensation für die spektrale Überlappung einzustellen.
HINWEIS: Die Verwendung von Kompensations Perlen anstatt zellbasierte Kompensationssteuerungen ist notwendig in Fällen, in denen das Antigen von Interesse oder Zellpopulation in einer Probe bei so niedrigen Niveaus Zellen schwierig wird verwenden, die Kompensation vorhanden ist. Auch der Hinweis, wenn Tandem-Farbstoffe verwendet werden, ist es ratsam, Kompensationen für jedes Experiment herzustellen, da Tandem-Farbstoffe von Charge zu Charge variieren und mit jedem Tag. - Führen Sie Fluoreszenz minus eins Kontrollen (RGV) für alle Fluorophore in der Platte, wenn ein neues Mehrfarben Experiment zu starten.
HINWEIS: Die FMO Kontrollen sind Proben, die alle Antikörper in der Platte enthalten, mit Ausnahme eines. Diese Kontrollen erlauben eine genaue Unterscheidung von positiven gegenüber negativen Signale für die versäumte Antikörper richtig adjust die Tore. Diese Steuerungen sind besonders wichtig, wenn die Expressionsniveaus niedrig sind oder wenn die Trennung der Zielbevölkerung gering ist (beispielsweise, wenn das Ziel ein Cytokin oder Transkriptionsfaktor ist). Obwohl es nicht immer notwendig, in einigen Fällen Isotypkontrollen kann anstelle bevorzugt werden von FMO kontrolliert, da sie eine angemessene Entschädigung für den Antikörper-Isotyp und Fluorophor-Konjugat ohne die Spezifität des Antigens bereitzustellen. - Legen Sie die primäre Tor nach oben: justieren Forward Scatter Area (FSC-A) und Seitenstreubereich (SSC-A) Spannung, um die Leukozyten-Population zu erfassen.
- Schließen Sie die toten Zellen.
HINWEIS: Die Lebensfähigkeit Fleck reagiert mit freien Aminen vorhanden sowohl auf der Oberfläche und das Innere von Zellen. Im Gegensatz Zellen zu leben, tote Zellen (mit geschwächtem Membranen) ermöglichen es dem Farbstoff in das Zytoplasma zu geben, die Menge an Proteinmarkierung zu erhöhen. So werden tote Zellen heller als lebende Zellen ermöglicht leichte Unterscheidung. Tor auf dem LiveZellen.
HINWEIS: Die Lebensfähigkeit der Zellsuspension aus der Aorta und der Niere kann niedriger als die Lebensfähigkeit der Zellsuspensionen aus den Lymphknoten aufgrund der zusätzlichen Verdauungsschritt. - Plot Forward Scatter Area (FSC-A) [y-Achse] und Forward Scatter Höhe (FSC-H) [x-Achse]. Sonderangebot erscheinen als Diagonale auf diesem Punktdiagramm. Tor auf dieser Diagonale Dubletten auszuschließen. Dann zeichnen SSC-A [y-Achse] und CD45 [x-Achse].
- Die CD45 + Leukozytenpopulation leicht identifiziert werden können. Tor auf dieser Population. Nachfolgende Populationen können aus dieser Population identifiziert werden.
- Führen Sie ungefärbten und einzelne gefärbten Kontrollröhrchen zur Kompensation für die spektrale Überlappung einzustellen.
- Normalisierung der Zellzählungen
- Zählen Perlen haben Eigenschaften, die in niedrigen FSC und hohe SSC führen. Wenn beispielsweise 50.000 Kügelchen in 300 & mgr; l der Einzelzellsuspension zugegeben werden, die Gleichung für die Berechnung der absoluten Anzahl von beliebigen Zelltyp geben pro Röhrchen wie folgt ist:
Anzahl der Zellen per Rohr = (50.000 / Anzahl der Kügelchen gezählt vom Durchflusszytometer) gezählt x Anzahl der Zellen.
Mit Hilfe dieser Berechnung kann die absolute Anzahl von einem gegebenen Zelltyp pro Röhrchen bestimmt werden. Basierend darauf, wie viele Röhrchen aus jedem Organ erzeugt wurden, kann die Anzahl der Zellen pro Organ berechnet werden.
HINWEIS: Bewahren Sie alle Zellen und Reagenzien bei 4 ° C während des Protokolls. Vermeiden Sie heftiges Vortexen, weil sie Zellen schädigen können. Verwenden minimale Kräfte um die Zellen zu pelletieren. Vermeiden Sie Blasen in der FACS-Röhrchen zu machen, da es den Zelltod fällen kann. Nicht die Pellets zu jeder Zeit austrocknen lassen.
- Zählen Perlen haben Eigenschaften, die in niedrigen FSC und hohe SSC führen. Wenn beispielsweise 50.000 Kügelchen in 300 & mgr; l der Einzelzellsuspension zugegeben werden, die Gleichung für die Berechnung der absoluten Anzahl von beliebigen Zelltyp geben pro Röhrchen wie folgt ist:
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Representative Results
Das beschriebene Protokoll ermöglicht die Identifizierung von Oberflächen- und intrazellulären Markern in T aus murinen Nierenzellen isoliert, Aorta und aortic drainierenden Lymphknoten in einem Modell von Angiotensin II induzierten Bluthochdruck. Repräsentative Ergebnisse sind unten dargestellt.
Abbildung 1 zeigt die Gating - Strategie verwendet , um die T - Zellpopulation in einer Einzelzellsuspension aus der Aorta eines WT - Maus mit Angiotensin II Hypertonie zu induzieren infundiert hergestellt identifizieren. Eine ähnliche Strategie wird in der Niere und Lymphknoten verwendet. Der Forward Scatter Area (FSC-A) und Seitenstreubereich (SSC-A) Spannung wurde eingestellt, um die Leukozyten-Population (G1) zu erfassen und Schmutz auszuschließen. Die lebenden Zellen (G2) sind negativ für die Lebensfähigkeit Marker mit Pacific blau konjugiert. Lebende Zellen wurden dann gated auf Forward Scatter Höhe (FSC-H) und Forward Scatter Area (FSC-A) an das Gate nur auf dieSingulettpopulation (G3). Die Leukozyten wurden dann durch Gating auf SSC-A und CD45 (G4) ausgewählt. CD45 ist mit AmCyan in diesem Beispiel konjugiert. Schließlich werden T - Zellen als CD45 + CD3 + -Population (G5) gated. CD3 ist mit PerCP-Cy5.5 in diesem Beispiel konjugiert.
Um die Anwesenheit von IL-17A und IL-17F produzierenden T-Zellen in murine Nieren und der Aorta in diesem Modell, Einzelzellsuspensionen wurden gefärbt für IL-17A und IL-17F bestimmen. Figur 2 zeigt Fluoreszenz minus einer Kontrollen (RGV) für IL-17A und IL-17F - Färbung in einer Nierenprobe (konjugiert mit FITC und APC, respectively). FMO Kontrollen sind Proben, die alle Antikörper in einem Panel enthalten mit Ausnahme eines. Wie erwartet, sind sehr wenige Zellen positiv für IL-17A (2A) oder IL-17F (2B) in den FMO Kontrollen. Diese Kontrollen erlauben eine genaue Unterscheidung von positiven gegenüber negativen Signale richtig adjust die Tore der Zellen positiv für IL-17A oder IL-17F in den experimentellen Proben zu identifizieren.
Figur 3 stellt ein Beispiel für die intrazelluläre Färbung von T - Zellen aus der Niere (3A) isoliert und Aorta (3B) von WT - Mäuse infundiert mit Vehikel (Sham) oder Angiotensin II (Ang II). Tatsächlich kann eine Untergruppe von T-Zellen, die IL-17A oder IL-17F zum Ausdruck bringen in beiden Geweben in diesem Modell erfasst werden.
Figur 4 zeigt die intrazelluläre Färbung der T - Zellen in den Aorten drainierenden Lymphknoten in diesem Modell (4A). CD8 + T - Zellen wurden zuerst gated (4B). Dann wird die Expression von zwei Tc1 Marker, das Cytokin IFN & ggr; oder der Transkriptionsfaktor T-bet, wurden aus der CD8 + T - Zell - Untergruppe quantifiziert. 4C zeigt die RGV für IFN47; und T-bet-Färbung in den Lymphknotenproben (konjugiert mit FITC und PE-Cy7, respectively). 4D zeigt , dass in der Aorta drainierenden Lymphknoten von WT - Mäusen mit Angiotensin II infundiert, eine Population von CD8 + IFN & ggr; + und CD8 + T-bet + Zellen können identifiziert werden.
Abbildung 1: Die Durchflusszytometrie Gating - Strategie T - Zellen zu identifizieren. Leukozyten werden zunächst auf einer Vorwärtsstreuung / Seitenstreuung (FSC-A / SSC-A) Dot-Plot (G1) und lebende Zellen gated ausgewählt (G2). Die Zellen werden dann auf Singuletts (FSC-A / FSC-H) (G3) gated. Zellen von G3 werden durch die Expression von CD45 (G4) charakterisiert. Schließlich werden T - Zellen auf CD45 + CD3 + doppelt positiven Zellen (G5) gated. Diese Einzelzellsuspension aus einem Wildtyp getrennt von der gesamten Aorta (WT) Maus infundiert mit angiot hergestellt wurde, ensin II Hypertonie zu induzieren. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Die Fluoreszenz minus eins Kontrollen (FMO) für IL-17A und IL-17F. (A) Eine Einzelzellsuspension aus einem Angiotensin - II - behandelten murinen Nierenprobe isoliert wurde , gefärbt mit einem fixierbaren Lebensfähigkeit Marker (Pacific Blue), CD45 (AmCyan), CD3 (PerCP-Cy5.5) und IL-17F (APC). Der Antikörper für IL-17A wurde die richtige Gating für IL-17A, um zu bestimmen weggelassen. (B) Eine einzelne Zellsuspension aus einem Angiotensin - II - behandelten murinen Nierenprobe isoliert wurde , gefärbt mit einem fixierbaren Lebensfähigkeit Marker (Pacific Blue), CD45 (AmCyan), CD3 (PerCP-Cy5.5) und IL-17A (FITC). In diesem Fall wurde der Antikörper für IL-17F weggelassen.urce.jove.com/files/ftp_upload/55266/55266fig2large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Intrazelluläre Färbung von T - Zellen aus Mäuse - Nieren - und Aorta für IL-17A und IL-17F isoliert. Fließpunkt - Zytometrie Plots zeigt IL-17A und IL-17F - Expression in T - Zellen aus der Niere (A) und der Aorta (B) von Mäusen , WT infundiert mit Vehikel (Sham) oder Angiotensin II (Ang II) und zuvor gated on CD45 + CD3 + Zellen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Figur 4: Die intrazelluläre Färbung der T - Zell s aus murinen Aorten-Lymphknoten isoliert. (A) makroskopische Erscheinungen von zwei Lendenwirbel Aorten - Lymphknoten in einer WT - Maus. (B) repräsentative Durchflusscytometrie Punktplots von CD4 + und CD8 + T aus vier Aorten drainierenden Lymphknoten aus einer WT - Maus mit Angiotensin II und zuvor gated infundiert isoliert Zellen auf CD45 + CD3 + -Zellen. (C) Eine Einzelzellsuspension aus Lymphknoten isoliert gefärbt wurde eine Lebensfähigkeit Marker (Pacific Blue) verwendet, CD3 (PerCP-Cy5.5), CD4 (APC-Cy7) und CD8 (APC). FMO Kontrollen werden in dem der Antikörper für IFN & ggr; (FITC) oder T-bet (PE-Cy7) wurde die richtige Gating zu bestimmen, weggelassen sind. (D) dot Durchflusszytometrie Plots , die positive IFNy und T-bet - Expression in CD8 + Lymphknoten - T - Zellen unter Verwendung der durch die FMO Kontrollen bestimmt Tore.g "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Disclosures
MSM wird durch einen Zuschuss von Gilead Sciences Herz-Kreislauf unterstützt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von einem American Heart Association Fellowship Award (16POST29950007) bis FL, eine Ausbildung Zuschuss von der National Institutes of Health (NIH T32 HL069765) zu BLD, American Heart Association Fellowship Award (14POST20420025) zu MA Saleh unterstützt und ein NIH K08 Auszeichnung (HL121671) zu MSM. MSM wird auch durch ein Forschungsstipendium von Gilead Sciences, Inc. unterstützt
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase D | ROCHE | 11088882001 | |
| Collagenase A | ROCHE | 10103586001 | |
| Collagenase B | ROCHE | 11088815001 | |
| Dnase | ROCHE | 10104159001 | |
| 1x Red blood cell lysis buffer | eBioscience | 00-4333-57 | |
| RPMI Medium 1614 1x | Gibco | 11835-030 | |
| DPBS without calcium and magnesium | Gibco | 14190-144 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-5445-02 | For density gradient centrifugation |
| GentleMACS™ C tube | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| GentleMACS dissociator device | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Use the program SPLEEN_04 |
| Cell activation cocktail (with Brefeldin A) | Biolegend | 423303 | |
| anti-CD16/32 | eBioscience | 14-0161-81 | dilute 1:100 |
| LIVE/DEAD fixable violet dead cell stain kit | Life Technologies | L34955 | |
| Transcription factor buffer set | BD Pharmingen | 562725 | |
| OneComp eBeads | eBioscience | 01-1111-42 | |
| 123 count eBeads | eBioscience | 01-1234-42 | |
| CD45 AmCyan (clone 30-F11) | BioLegend | 103138 | |
| CD3 PerCP-Cy5.5 (clone 17A2) | BioLegend | 100218 | |
| IL-17A FITC (clone TC11-18H10.1) | BioLegend | 506910 | |
| IL-17F APC (clone 9D3.1C8) | BioLegend | 517004 | |
| CD4 APC-Cy7 (clone GK1.5) | BD Biosciences | 560181 | |
| CD8 APC (clone 53-67) | eBioscience | 17-0081-82 | |
| T-bet PE-Cy7 (clone 4B10) | BioLegend | 644823 | |
| IFNγ FITC (clone XMG1.2) | BD Biosciences | 557724 |
References
- Saleh, M. A., McMaster, W. G., Wu, J., et al. Lymphocyte adaptor protein LNK deficiency exacerbates hypertension and end-organ inflammation. J Clin Invest. 125 (3), 1189-1202 (2015).
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