Summary
Bu makalede, tanımlamak ve hücre içi boyama ile fare böbrek, aort ve lenf düğümleri içinde mevcut fonksiyonel T lenfosit alt grupları ölçmek ve akım sitometri ayrıntılı bir metodoloji sağlar. anjiotensin II hipertansiyon modeli açıklamak adım-adım, usul ve flow sitometri temel ilkelerine ve hücre içi boyama seçildi.
Introduction
Son kanıtlar, adaptif bağışıklık sisteminin, özellikle de T lenfositler, çok sayıda kalp-damar hastalıkları 1,2,3,4,5 gelişiminde önemli bir rol oynadığını göstermektedir. Örneğin, anjiyotensin II kaynaklı hipertansiyonu modelinde, gemiler ve farelerin böbreklerinde T hücrelerinin birikimi 6 tarif edilmiştir. damar birikim adventisya ve perivasküler yağ ağırlıklı olarak. Böbrekte, T hücreleri, medulla ve renal korteksten hem de birikir. Dahil olduğu alt kümesi bağlı olarak, bu T hücreleri vasküler ve böbrek fonksiyonlarını etkileyebilir ve patolojinin gelişmesine yol açabilir farklı sitokinler doğuran (McMaster ve ark., 6 tarafından gözden).
CD4 + T yardımcı lenfositler çok alt-grup halinde ayrılabilir: fonksiyonları ve imza sito göre T yardımcı 1 (Th1), Th2 Th9, Th17, Th22, regülatör T (regülatör) hücreleri ve T yardımcı foliküler (TFH) hücrelerkines 7. Benzer şekilde, CD8 + sitotoksik T hücreleri Tc1, TC2, Tc17 ya TC9 8 olarak sınıflandırılabilir. (CD4 veya CD8 T hücresi işaretlerini ifade yoktur, yani hücreleri) çift negatif T hücreleri bulunmaktadır. Bu hücrelerin bir alt alternatif bir gama delta T hücre reseptörü (yerine klasik alfa ve beta reseptörleri) sahiptirler ve bu nedenle, gama, delta T hücreleri olarak ifade edilir. yüzey işaretleyici, sitokin ve transkripsiyon faktörü flow sitometri çok parametre analizi bu hücreleri tanımlamak için en iyi yaklaşım oluşturmaktadır. Bu yöntem geniş bir immünoloji alanında kullanılmasına rağmen, bu daha az katı organlar ve kalp-damar hastalıklarının bir ortamda tarif edilmektedir.
Tarihsel olarak, dokularda lenfosit tanımlama immünohistokimya ya da RT-PCR yaklaşımlar ile sınırlı kalmıştır. immünohistokimyasal ve immünofloresan int bir antijenin doku dağılımını belirlemek için güçlü yöntemler olmasına rağmenerest, onlar fenotipik ilgili alt grupları tanımlamak için yetersiz kalmaktadır. RT-PCR analizi antijenleri, sitokinler ya da transkripsiyon faktörleri mRNA ekspresyonunu tespit etmek için yararlıdır Buna ek olarak, bu aynı zamanda tek tek hücreler seviyesinde çok proteinlerin tespiti izin vermez.
sitokinler ve transkripsiyon faktörleri tespit etmek için hücre içi boyama ile birlikte, özellikle flow sitometri gelişi, katı organlarda immün hücre alt tek hücre düzeyinde belirlenmesi ve niceliksel olanak sağlayan güçlü bir teknikle araştırmacılar sağlar. Bu, anjiyotensin II kaynaklı hipertansiyonu modelinde kemirgen böbrek, aort ve aort lenf düğümleri içinde bulunan ana T hücre alt akış sitometrisi ile tespit etmek, bir hücre içi boyama tahlili optimize ettik. Çok yeniden bir doku sindirim, ex vivo aktivasyonu, permeabilization ve yüzey ve hücre içi boyama sonuçları: her adımın optimizasyonuDiğer kardiyovasküler ve böbrek hastalığı modellerinde uygulanabilir üretilebilir deneyi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Vanderbilt Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi Burada tarif edilen prosedürler onayladı. Fareler ev sahipliği ve Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu uyarınca bakılan (Ulusal Akademiler Press. Revize 2010).
Fareler ile Aort lenf düğümleri, Böbrek ve Aort 1. İzolasyonu
- CO 2 inhalasyon fareler Euthanize. % 70 etanol ile göğüs püskürtün ve dikkatle deri ve kalp maruz makas ile göğüs duvarı açın.
- damarsal serpmek için, sağ atrium küçük bir kesi yapmak ve sürekli bir 21 ya da 23 G iğne kullanılarak sol ventrikül apeksi içine soğuk PBS (yaklaşık 1 ml / sn) en az 10 ml enjekte edilir. Tüm organlar blanched kadar serpmek. Kalp ilk blanches. karaciğer Ağartma perfüzyon iyi performans olduğunu gösterir.
- küçük forseps ve ince makas kullanarak, hafifçe, kesip ve bağırsakları dışarı çekinmide, dalak, pankreas ve karaciğer daha iyi aorta görselleştirmek için.
Not: Bu adım kontaminasyonu uyarabilir gastrointestinal hasar olarak çok hassas yapılmalıdır. - Cut out ve makasla her akciğer çıkarın. Bir iğnesiz şırınga kullanılarak, fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile göğüs boşluğunu durulayın. steril gazlı bez kullanılarak aşırı kan ve sıvı kaldırmak.
- ince diseksiyon forseps kullanılarak abdominal aort lenf düğümleri kaldırın. kapsül yırtılmasına değil emin olun. kesme forseps her lenf nodu yüzeyi üzerinde geride kalan yağ çıkarmak. ince makasla iki böbrekleri kesip.
- ince, kavisli makas ile tüm aorta (torasik ve abdominal aorta) teşrih. kalp hizasında başlayın ve dikkatle uzak yemek borusu ve aort bağlı çevreleyen perivasküler yağ tutmak için emin iliak bifurkasyona kadar aşağı omurları arasından teşrih.
NOT: Aort diseksiyonu daha fazla remoÇevredeki yapıların mikroskop altında yapılabilir ettik. Özellikle, arteriyel dalları (karotis arterler, subklavyen arter, çölyak, mezenterik ve renal arterler) ve lenf düğümleri kaldırın. Bu çok inflamatuar hücreler hipertansiyon ayarında ikamet bir site olduğundan her aort etrafında perivasküler yağ tutarlı bir tabaka tutun. soğuk PBS içeren tüplere, her doku yerleştirin.
Her bir dokudan Tek hücre süspansiyonları, 2. Üretim
- böbrekler
NOT: Böbrek mekanik ayrışma artı enzimatik sindirim birleştirerek tek bir hücre süspansiyonu ayrışmış edilebilir.- (% 5 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş) 1640 ortamı (2 mg / ml) kollajenaz D eklenmesi ve DNase I (100 ug / ml), RPMI ile Böbrek sindirim çözeltisi hazırlayın. Böbrek örnek başına 10 ml hazırlayın.
- Böbreğin sindirmek 10 ml içeren bir ayrışma tüp içine iki böbreği aktarmak için forseps kullanabiliriyon solüsyonu.
- üreticinin talimatlarına göre bir yarı-otomatik bir ayıracı cihazı kullanılarak mekanik ayrılma gerçekleştirin.
- mekanik ayrışma sonra cihazdan tüp ayırmak ve enzimatik sindirim gerçekleştirin. sürekli dönme altında 37 ° C 'de 20 dakika boyunca inkübe edin. Hemen% 5 FBS ile takviye edilmiş, soğuk RPMI 1640 ortamı eklenerek enzimatik sindirim dur.
- 40 mikron süzgeç vasıtasıyla filtreleme sonra 50 ml konik tüp içine pipetleme çözüm aktarın. 1 ml şırınga pistonu bastırarak birbirinden kalan doku alay. hücreler (500 xg, 8 dakika, 4 ° C) pelet.
- % 36 yoğunluk gradyan santrifüj ortamının 3 ml pelletini. 15 ml konik tüp içine süspansiyon aktarın. Yavaşça herhangi bir kesinti olmadan 3 ml% 36 hücre süspansiyonu altında% 72 yoğunluk gradyan santrifüj medya 3 ml ekleyin. Santrifüj (frensiz 1000 xg, 20 dakika, 4 ° C). </ Li>
- bağışıklık hücreleri arayüzünde yer alacaktır. hücresel enkaz içeren üstteki sarımsı bir tabaka çıkarın ve sonra soğuk PBS kullanarak 15 ml hacim getirmek. arıza iyice degrade sallayın. hücreler (300 xg, 8 dakika, 4 ° C) Spin ve% 5 FBS ile RPMI 3 ml pelletini. Tripan mavisi dışlama kullanarak hemasitometre canlı hücrelerinin sayısını.
- aort
- kolajenaz A (1 mg / ml), kolagenaz B (1 mg / ml) eklenerek aort sindirim çözeltisi hazırlayın ve DNase I (100 ug / ml), RPMI ile (% 5 FBS ile takviye edilmiş) 1640 ortamı.
- ince forseps kullanılarak, aort sindirim çözeltisi, 1 ml içeren 2 ml'lik bir tüp içine aort aktarın. 1 ml sindirim çözeltisi içinde ince makas ile çok küçük parçalar halinde bütün aort kıyma. buz üzerinde tutun. sürekli dönme altında 37 ° C sıcaklıkta 30 dakika boyunca inkübe edin.
- Bir doku kültürü çanak çözüm aktarın ve enzyma durdurmak% 5 FBS soğuk RPMI 5 kez hacmi eklenerek tlc sindirim.
- 40 mikron süzgeç vasıtasıyla filtreleme sonra 50 ml konik tüp içine pipetleme çözüm aktarın. 1 ml şırınga pistonu bastırarak tek bir hücre süspansiyonu içine ayrı kalan doku alay. süzgeci yıkayın ve hücreleri (300 xg, 8 dakika, 4 ° C) pelet.
- % 5 FBS ile RPMI 10 ml ekleyerek pelet yıkayın. hücreler (300 xg, 8 dakika, 4 ° C) Spin ve% 5 FBS ile RPMI 3 ml pelletini. Tripan mavisi dışlama kullanarak hemasitometre canlı hücrelerinin sayısını.
- Aort lenf düğümleri
- bir doku kültürü kabı (60 mm x 15 mm) ve 40 um süzgeç yerleştirin. süzgeç üzerinde lenf düğümlerini yerleştirin ve 1 ml şırınga pistonu bastırarak tek bir hücre süspansiyonu içine birbirinden kızdırmak. % 5 FBS ile RPMI 2 ml süzgeç yıkayın. çanak hücreleri toplamak.
- transfer15 ml'lik bir Falcon tüpü içine hücre ve pelet hücreleri (300 xg, 8 dakika, 4 ° C). % 5 FBS ile RPMI 500 ul pelletini. Tripan mavisi dışlama kullanarak hemasitometre canlı hücrelerinin sayısını.
Akış Sitometrisi ile sitokin Algılama 3. Ex Vivo Uyarım
- % 5 FBS, temel olmayan amino asitler, 0.1 mM, 50 uM β-mersaptoetanol ve% 1 penisilin / streptomisin ile RPMI: hücre kültür ortamı hazırlayın.
- Santrifüj, böbrek, aort ve lenf düğümlerinden elde edilen her hücre süspansiyonu (300 xg, 8 dakika, 4 ° C). Ml başına 1 x 10 6 hücre bir konsantrasyonda, hücre kültür ortamı, her pelletini.
- Hücre kültürünün her 1 ml (Phorbol 12-miristat 13-asetat (PMA), kalsiyum iyonofor iyonomisin ihtiva eden ve Golgi inhibitörü Brefeldin A) hücre aktivasyonu kokteyli 2 ul ekleyerek hücrelerini uyarır.
NOT: nihai konsantrasyonPMA 81 nM PMA ile Brefeldin A Tedavi ionomisin 1.33 uM ve 5 ug / ml ve iyonomisin sitokinler üretmek için hücreleri aktive eder: her bir bileşenin s bulunmaktadır. Sitokinler tespit edilecek hücrelerde sıkışıp gereken proteinleri salgılanır. Brefeldin A endoplazmik retikulum ve Golgi aygıtında normal salgılanan proteinlerin birikmesine yol açar. Bu nedenle, burada tarif edilen teknik, akış sitometrisi ile sitokin üreten limfositlerin tespit edilebilirliğini arttırır. - 12 oyuklu 2.000.000 hücre (aort veya böbrek) ya da 24 oyuklu (lenf düğümü) düşük yapışma plakaları Levha 1. 3 saat 37 ° C nemlendirilmiş CO2 kuluçka makinesi içinde plaka koyun.
Not: kaplama hücre sayısı kontrol farelerinin lenf düğümlerinde daha düşük olabilir. Ayrıca, uyarılma zaman deneysel olarak çalışılan her hücre popülasyonu ve sitokin için belirlenmelidir. aort, böbrek veya lenf düğümlerinden izole edilmiş T hücreleri durumda, 3 ila 4 saat boyunca teşvik önerilir. Daha uzun bir uyarım WHasta sitokin salgılanmasını arttırmak ve CD3, CD4 ve CD8 gibi çeşitli T hücresi yüzey markerlerine bir başka infekte hücrelerde bunu yapmaz. (Hatta 3-4 saat stimülasyon bu belirteçlerin bazı infekte hücrelerde unutmayın.)
4. Yüzey Boyama
- bir polistiren FACS tüpü ve santrifüj (300 xg, 8 dakika, 4 ° C) içine hücreleri aktarın. (FACS tamponu ile iki kez (Ca2 + ve Mg + serbest PBS% 4 FBS ve 2 mM EDTA ihtiva eden) hücreler yıkanır ve arzu edilen antikor panel sayısı ve gerekli kontrol tüplerinin sayısına bağlı olarak farklı FACS tüplere eşit hücre süspansiyonu bölmek aşağıya bakınız).
- Her panel için tazminat gerçekleştirmek için, her doku tipi ve antikor paneli için lekesiz kontrol tüpleri ve tek lekeli tüpler hazırlamak. Buna ek olarak, tüm ama antikorların birini ekleyerek her antikor paneli için floresans eksi bir (FMO) kontrol tüpleri hazırlar.
- FACS ile 2 ml her tüp ses seviyesini ayarlamakTampon. Santrifüj hücre süspansiyonu (300 xg, 8 dakika, 4 ° C), buz üzerinde 10 dakika süre ile milyon hücre başına anti-CD16 / CD32 antikorları, 0.5 ug hücrelerin inkübe edilmesi ile yüzer ve blok Fc reseptörleri çıkarın.
NOT: CD16 düşük afinite IgG Fc reseptörü III (FcR III) ve CD32 FcR II. CD16 / CD32 granülositler, mast hücreleri, monositler / makrofajlar, doğal katil hücreler, B hücreleri, dendritik hücreler ve bazı aktif, olgun T hücreleri üzerinde ifade edilir. - geçerlilik boyaması yapın: 1x PBS 1000 ul 1x PBS, santrifüj (300 xg, 8 dakika, 4 ° C) ve tekrar süspansiyon hücreleri yıkayın. hücre geçirgenliği olmayan amin reaktif boya (canlılık leke) 1 ul ekle. ışıktan korumalı 4 ° C'de 15 dakika süreyle inkübe edin.
- İnkübasyon sırasında, FACS tamponu uygun bir hacimde (yüzey boyama) antikor kokteyli hazırlanır. FACS tampon 1-2 ml hücreler iki kez yıkanır, santrifüj (300 xg, 8 dakika, 4 ° C) ve 100 ul her bir peletAntikor karışımı. ışıktan korumalı 4 ° C sıcaklıkta 30 dakika boyunca inkübe edin.
Not: antikor sitometri her bir akış sağlamak için, bir doz titrasyon eğrisi gereksinim duyulan antikor optimal miktarını belirlemek için yararlıdır. - hücreler (300 xg, 8 dakika, 4 ° C) FACS tampon, 2 ml ile iki kez hücreleri yıkayın ve pelet.
5. Sabitleme, Permeabilization ve Hücre içi Boyama
- Üreticinin talimatlarını takip ederek uygun tamponlar içeren bir tespit ve permeabilization kiti ile hücre içi boyama yapın. Fix ve uygun tampon onları resuspending hücreleri geçirgenliği. ışıktan korumalı 4 ° C'de 40 dakika boyunca inkübe edin.
- 1x Permeabilization 1 ml ekleyin ve sabit ve permeabilize hücrelere doğrudan tampon yıkayın. Santrifüj (500 xg, 8 dakika, 4 ° C) ve süpernatant kaldırmak. 1x yıkama tamponu 2 ml pelletini.
- antib karışımlarını hazırlamak1x yıkama tamponu (tüp başına genellikle 100 ul) uygun bir hacimde (hücre içi boyama için) Odies.
Not: Yukarıda tarif edildiği gibi, uygun antikor konsantrasyonu panelinde, her bir antikor için tespit edilmesi gerekmektedir. Örneğin, IL-17A veya IL-17F karşı antikorlar için, biz 1:30 bir seyreltme faktörü kullanın, ancak IFNy ve T-bahis antikorları için, biz 1 bir seyreltme faktörü kullanın: 100. - Santrifüj hücreleri (500 xg, 8 dakika, 4 ° C) ve antikor karışımı, 100 ul her pelletini. ışıktan korumalı 4 ° C'de 40 dakika süreyle inkübe edin.
- hücreler (500 xg, 8 dakika, 4 ° C) 1 x yıkama tamponu 2 ml hücreler iki kez yıkanır ve pelet. 1x yıkama tamponu 300 ul ile pelet yeniden süspanse edin ve uygun filtreler ile bir akış sitometresi üzerinde analiz.
- doku örneğinin başına toplam hücre sayısının ölçümü için sayma boncuk kullanmayın. alımı öncesinde, her tüpe boncuk sayma önerilen hacim / numara ekleyin.
6. Tazminat, Yolluk, Normalleştirme, ve İpuçları
- Tazminat ve yolluk
- tazminat çalıştırın lekesiz ve tek lekeli kontrol tüpleri spektral örtüşme ayarlamak için.
Not: dengeleme boncuklar yerine hücre bazlı dengeleme kontrol kullanımı, bir numunede ilgi veya hücre popülasyonunun bir antijen olduğu telafi zor olacak hücreler kullanılarak bu düşük seviyelerde mevcut olduğu durumlarda gereklidir. tandem boyalar kullanarak Ayrıca notun, tandem boyalar çok-çok-ve her gün değişir çünkü her bir deney için tazminat hazırlamak için tavsiye edilir. - Yeni bir renkli deney başlatırken floresan eksi panelde tüm fluorophores için bir kontrol (FMOs) çalıştırın.
NOT: FMO kontrolleri biri hariç panelde tüm antikorlar içeren örneklerdir. Bu kontroller düzgün rla ma k atlanmış antikor negatif sinyallerin karşı pozitif doğru ayrımcılığa izinKapıları t. Bu kontroller ifade seviyeleri hedef nüfusun ayrılması kötü olduğunda ya da (örneğin, zaman hedef bir sitokin veya transkripsiyon faktörüdür) düşük olduğunda özellikle önemlidir. bunlar, antijen spesifikliği olmayan antikor izotipinin ve fluorofor konjügatı için uygun telafi sağlamak gibi FMO kontrol her zaman gerekli olmasa da, bazı durumlarda, izotip kontrol yerde tercih edilebilir. - Birincil kapıyı kurmak: lökosit nüfusu tespit etmek amacıyla Forward Scatter Area (FSC-A) ve Side Scatter Area (SSC-A) Gerilimi ayarlamak.
- ölü hücreleri hariç.
NOT: canlılık leke yüzeyi ve hücrelerin iç hem de mevcut ücretsiz aminler ile reaksiyona girer. hücrelerin yaşama aksine, (tehlikeye diyaframlarla) ölü hücreler, protein etiketleme miktarının artırılması, boya sitoplazmaya girmesine izin verir. Böylece, ölü hücreler kolay ayrımcılık sağlayan canlı hücreler daha parlak olacaktır. Canlı üzerinde KapısıHücreler.
Not: aort ve böbrek hücre süspansiyonları canlılığı nedeniyle ek sindirim aşamasından lenf düğümleri hücre süspansiyonları canlılığı daha düşük olabilir. - Arsa İleri Yayılım Alanı (FSC-A) [y-ekseni] ve İleri Yayılım Yükseklik (FSC-H) [x ekseni]. Mayoları bu nokta arsa üzerinde bir diyagonal olarak görünür. Bu diyagonal Kapısı ikilileri dışlamak için. Sonra SSC-A [y ekseni] ve CD45 [x eksenini] arsa.
- CD45 + lökosit nüfus kolaylıkla tespit edilebilir. Bu nüfus Kapısı. Takip eden popülasyonlarının Bu popülasyondan tespit edilebilir.
- tazminat çalıştırın lekesiz ve tek lekeli kontrol tüpleri spektral örtüşme ayarlamak için.
- Hücre sayımlarının Normalleştirme
- Sayma boncuklar düşük FSC ve yüksek SSC neden özelliklere sahiptir. 50.000 boncuk tek bir hücre süspansiyonu 300 ul ilave edilir, aşağıdaki gibi tüp başına Örneğin, herhangi bir mutlak sayısının hesaplanması için denklemi hücre tipi vermek:
Hücre sayısı per tüp = (akış sitometresi tarafından sayılan boncuk 50,000 / sayısı) sayılan hücrelerin sayısı x.
Bu hesaplama kullanarak, tüp başına herhangi bir hücre tipinde mutlak sayısı belirlenebilir. Her organ elde kaç borular göre, organ başına hücre sayısı hesaplanabilir.
Not: protokolü 4 ° C'de tüm hücreleri ve reaktifler tutun. bu hücrelere zarar verebilir, çünkü kuvvetli vorteks kaçının. pelet hücreleri çok az güçleri kullanın. hücre ölümünü hızlandırabilir beri FACS tüp içinde kabarcıklar yapmaktan kaçının. topaklar, herhangi bir zamanda kurumasına izin vermeyin.
- Sayma boncuklar düşük FSC ve yüksek SSC neden özelliklere sahiptir. 50.000 boncuk tek bir hücre süspansiyonu 300 ul ilave edilir, aşağıdaki gibi tüp başına Örneğin, herhangi bir mutlak sayısının hesaplanması için denklemi hücre tipi vermek:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokol izin veren anjiyotensin II kaynaklı hipertansiyonu modelinde kemirgen böbrek, aort ve aort lenf düğümlerinden izole edilmiş T hücreleri yer yüzeyi ve hücre içi işaretlerinin belirlenmesi tarif edildiği. Temsilcisi sonuçları aşağıda sunulmuştur.
Şekil 1, hipertansiyon uyarılması için anjiotensin II ile aşılanmış WT fare aort hazırlanan tek bir hücre süspansiyonu olarak T hücre popülasyonu belirlemek için kullanılan yolluk strateji gösterir. Benzer bir strateji, böbrek ve lenf düğümlerinde kullanılır. İleri Yayılım Alanı (FSC-A) ve Side Scatter Alanı (SSC-A) gerilim lökosit popülasyonu (G1) tespit etmek ve enkaz dışlamak için ayarlandı. canlı hücreler (G2) Pasifik mavisi ile konjuge canlılık işareti için negatiftir. Canlı hücreler daha sonra yalnızca kapısına Forward Scatter Yükseklik (FSC-H) ve İleri Yayılım Alanı (FSC-A) kapılı edildisinglet nüfus (G3). Lökositler, SSC-A ve CD45 (G4) yolluk yolu ile seçildi. CD45 Bu örnekte AmCyan birleştirilir. Son olarak, T hücreleri, CD45 +, CD3 + popülasyon (G5) halinde kapılı. CD3 Bu örnekte PerCP Cy5.5 birleştirilir.
IL-17A ve bu modelde, murin böbrek ve aort içinde T hücrelerinin üretilmesi, IL-17F varlığını tespit etmek için, tek hücre süspansiyonları, IL-17A, IL-17F için boyandı. Şekil 2, floresans eksi, IL-17A ve böbrek örnek IL-17F boyama için bir kontrol (FMOs) (sırası ile, FITC ve APC ile konjüge edilmiş) göstermektedir. FMO kontroller biri hariç bir panelde tüm antikorlar içeren örneklerdir. Beklendiği gibi, çok az sayıda hücre FMO kontrol IL-17A (Şekil 2A) ya da IL-17F (Şekil 2B) pozitiftir. Düzgün adj için bu denetimler olumlu karşılık olumsuz sinyallerin doğru ayrımcılığa izinUst kapıları deney örnekleri, IL-17A ya da IL-17F pozitif hücreleri tanımlamak için.
Şekil 3, T böbrek (Şekil 3A) izole hücreler ve araç (sham) ya da anjiyotensin II (AngII) ile aşılanmış WT farelerin aort (Şekil 3B) hücre içi boyanması, bir örnek teşkil eder. Gerçekten de, IL-17A ya da IL-17F eksprese T hücrelerinin bir alt kümesi, bu modelde, her iki dokuda tespit edilebilir.
Şekil 4, bu modeli (Şekil 4A) aortik lenf düğümleri T hücre-hücre içi boyama göstermektedir. CD8 + T hücreleri, ilk (Şekil 4B) geçitlendi. Daha sonra, iki Tc1 markerlerinin ifadesi sitokin IFNy veya transkripsiyon faktörü, T-bahis CD8 + T hücresi alt-kümesinden ölçüldü. Şekil 4C, IFN için FMOs görüntülemektedir47; ve lenf nodu örneklerindeki T-bahis boyama (sırasıyla FITC ve PE-Cy7 ile konjüge edilmiştir). Şekil 4D WT farelerin aort lenf düğümleri anjiotensin II ile aşılanmış, CD8 + IFNy + ve CD8 + T-bahis + hücrelerinin bir popülasyonu tespit edilebilir olduğunu göstermektedir.
Şekil 1: T hücrelerini tanımlamak için yolluk stratejisi Flow sitometri. Lökositler ilk ileri dağılım / yan dağılım (FSC-A / SSC-A) nokta arsa (G1) ve canlı hücreler seçilir (G2) üzerine Geçitli. Hücreler daha sonra singletlerin (FSC-A / FSC-H) (G3) üzerine Geçitli. G3 hücreler daha CD45 (G4) ekspresyonu ile karakterize edilir. Son olarak, T hücreleri CD45 + CD3 + çift pozitif hücreler (G5) üzerine Geçitli. Bu tek bir hücre süspansiyonu, bir vahşi tip izole edilmiş bütün aort elde edilmiştir (WT) fare angiot ile aşılanmış Ensin II hipertansiyon ikna etmek. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: Flüoresan eksi bir kontrol, IL-17A ve IL-17F için (FMO). (A), bir anjiyotensin II ile tedavi edilen fare böbrek numuneden izole bir tek hücre süspansiyonu, tamir edilebilir canlılığı işaretleyici (Pasifik mavi), CD45 (AmCyan), CD3 (PerCP Cy5.5) ve IL-17F (APC) ile boyandı. IL-17A için antikor, IL-17A için uygun yolluk belirlemek için ihmal edilmiştir. (B) bir anjiyotensin II ile tedavi edilen fare böbrek numuneden izole bir tek hücre süspansiyonu, tamir edilebilir canlılığı işaretleyici (Pasifik mavi), CD45 (AmCyan), CD3 (PerCP Cy5.5) ve IL-17A (FITC) kullanılarak boyandı. Bu durumda, IL-17F antikor ihmal edildi.urce.jove.com/files/ftp_upload/55266/55266fig2large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: IL-17A, IL-17F için murin böbrek ve aort izole edilen T hücrelerinin hücre içi boyanması. Akış sitometrisi + (Ang II) ve daha önce CD45 +, CD3 kapılanan WT aracına (Sham) ile aşılanmış fareler ve anjiyotensin böbrekte (A) ve aorta (B) T hücreleri, IL-17A, IL-17F ekspresyonu gösteren grafikleri nokta hücreler. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4: T hücresinin hücre içi boyanması, murin aortik lenf düğümlerinden izole s. Bir WT fare iki lomber aort lenf düğümleri (A) makroskobik görünüşe. (B) WT fare izole dört aort lenf düğümlerinden izole edilmiş CD4 + ve CD8 + T hücrelerinin nokta diyagramları anjiyotensin II ile aşılanmış ve daha önce CD45 + CD3 + hücreleri üzerindeki kapı sitometri Örnek akışı. (C), bir lenf düğümlerinden izole edilmiş tek bir hücre süspansiyonu bir canlılığı işaretleyici (Pasifik mavi) kullanılarak boyandı, CD3 (PerCP Cy5.5), CD4 (APC Cy7) ve CD8 (APC). FMO kontroller hangi IFNy (FITC) veya T-bahis (PE-Cy7) için antikor uygun yolluk belirlemek için unutulmuş gösterilmektedir. (D) sitometrisi FMO denetimleri tarafından belirlenen kapıları kullanılarak CD8 + be lenf düğümü T-hücreleri içinde pozitif IFNy ve T-bahis ekspresyonunu gösteren grafikleri nokta akar.g "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
MSM Gilead Sciences Kardiyovasküler bir hibe ile desteklenmektedir.
Acknowledgments
Bu çalışma FL bir Amerikan Kalp Derneği Bursu Ödülü (16POST29950007), Sağlık (NIH T32 HL069765) BLD, MA Salih bir Amerikan Kalp Derneği Bursu Ödülü (14POST20420025) için National Institutes of bir eğitim hibe ve bir NIH tarafından desteklenen K08 ödülü MSM (HL121671). MSM de Gilead Sciences, Inc. bir araştırma bursu ile desteklenmektedir
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase D | ROCHE | 11088882001 | |
| Collagenase A | ROCHE | 10103586001 | |
| Collagenase B | ROCHE | 11088815001 | |
| Dnase | ROCHE | 10104159001 | |
| 1x Red blood cell lysis buffer | eBioscience | 00-4333-57 | |
| RPMI Medium 1614 1x | Gibco | 11835-030 | |
| DPBS without calcium and magnesium | Gibco | 14190-144 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-5445-02 | For density gradient centrifugation |
| GentleMACS™ C tube | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| GentleMACS dissociator device | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Use the program SPLEEN_04 |
| Cell activation cocktail (with Brefeldin A) | Biolegend | 423303 | |
| anti-CD16/32 | eBioscience | 14-0161-81 | dilute 1:100 |
| LIVE/DEAD fixable violet dead cell stain kit | Life Technologies | L34955 | |
| Transcription factor buffer set | BD Pharmingen | 562725 | |
| OneComp eBeads | eBioscience | 01-1111-42 | |
| 123 count eBeads | eBioscience | 01-1234-42 | |
| CD45 AmCyan (clone 30-F11) | BioLegend | 103138 | |
| CD3 PerCP-Cy5.5 (clone 17A2) | BioLegend | 100218 | |
| IL-17A FITC (clone TC11-18H10.1) | BioLegend | 506910 | |
| IL-17F APC (clone 9D3.1C8) | BioLegend | 517004 | |
| CD4 APC-Cy7 (clone GK1.5) | BD Biosciences | 560181 | |
| CD8 APC (clone 53-67) | eBioscience | 17-0081-82 | |
| T-bet PE-Cy7 (clone 4B10) | BioLegend | 644823 | |
| IFNγ FITC (clone XMG1.2) | BD Biosciences | 557724 |
References
- Saleh, M. A., McMaster, W. G., Wu, J., et al. Lymphocyte adaptor protein LNK deficiency exacerbates hypertension and end-organ inflammation. J Clin Invest. 125 (3), 1189-1202 (2015).
- Madhur, M. S., Lob, H. E., McCann, L. A., et al. Interleukin 17 promotes angiotensin II-induced hypertension and vascular dysfunction. Hypertension. 55 (2), 500-507 (2010).
- Laroumanie, F., Douin-Echinard, V., Pozzo, J., et al. CD4+ T Cells Promote the Transition From Hypertrophy to Heart Failure During Chronic Pressure Overload. Circulation. 129 (21), 2111-2124 (2014).
- Guzik, T. J., Hoch, N. E., Brown, K. A., et al. Role of the T cell in the genesis of angiotensin II induced hypertension and vascular dysfunction. J Exp Med. 204 (10), 2449-2460 (2007).
- Ketelhuth, D. F. J., Hansson, G. K. Adaptive Response of T and B Cells in Atherosclerosis. Circ Res. 118 (4), 668-678 (2016).
- McMaster, W. G., Kirabo, A., Madhur, M. S., Harrison, D. G. Inflammation, Immunity, and Hypertensive End-Organ Damage. Circ Res. (6), 1022-1033 (2015).
- Luckheeram, R. V., Zhou, R., Verma, A. D., et al. CD4+T Cells: Differentiation and Functions. Clin Dev Immunol. 2012, 1-12 (2012).
- Mittrücker, H. -W., Visekruna, A., Huber, M. Heterogeneity in the differentiation and function of CD8+ T cells. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 62 (6), 449-458 (2014).
- Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. Eur J Microbiol Immunol (Bp). 2 (2), 112-120 (2012).
- Finak, G., Langweiler, M., Jaimes, M., et al. Standardizing Flow Cytometry Immunophenotyping Analysis from the Human ImmunoPhenotyping Consortium. Sci Rep. 6, 20686 (2016).
- Herzenberg, L. A., Parks, D., Sahaf, B., Perez, O., Roederer, M., Herzenberg, L. A. The history and future of the fluorescence activated cell sorter and flow cytometry: a view from Stanford. Clin Chem. 48 (10), 1819-1827 (2002).
- Hrvatin, S., Deng, F., O'Donnell, C. W., Gifford, D. K., Melton, D. A. MARIS: method for analyzing RNA following intracellular sorting. PLoS One. 9 (3), 89459 (2014).
- Kalisky, T., Quake, S. R.
- Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Cytometry: Today's technology and tomorrow's horizons. Methods. 57 (3), 251-258 (2012).
- Jiang, L., Tixeira, R., Caruso, S., et al. Monitoring the progression of cell death and the disassembly of dying cells by flow cytometry. Nat Protoc. 11 (4), 655-663 (2016).
- Lemoine, S., Jaron, B., Tabka, S., et al. Dectin-1 activation unlocks IL12A expression and reveals the TH1 potency of neonatal dendritic cells. J Allergy Clin Immunol. 136 (5), 1355-1368 (2015).
- Gaublomme, J. T., Yosef, N., Lee, Y., et al. Single-Cell Genomics Unveils Critical Regulators of Th17 Cell Pathogenicity. Cell. 163 (6), 1400-1412 (2015).
