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Immunology and Infection

Intracellular धुंधला और फ्लो का उच्च रक्तचाप के एक मॉडल में murine महाधमनी, किडनी और लिम्फ नोड्स के भीतर लिम्फोसाइट सबसेट की पहचान करने के लिए

Published: January 28, 2017 doi: 10.3791/55266
Automatic Translation
1, 2, 3, 1
1Department of Medicine, Division of Clinical Pharmacology, Vanderbilt University Medical Center, 2Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University, 3Department of Pharmacology and Toxicology, Faculty of Pharmacy, Mansoura University

Summary

इस लेख की पहचान करने और कार्यात्मक टी लिम्फोसाइट intracellular धुंधला द्वारा murine गुर्दे, महाधमनी और लिम्फ नोड्स के भीतर मौजूद सबसेट यों और प्रवाह cytometry करने के लिए विस्तृत कार्यप्रणाली प्रदान करता है। एंजियोटेनसिन द्वितीय प्रेरित उच्च रक्तचाप के मॉडल, समझा कदम-दर-कदम है, प्रक्रियाओं और प्रवाह cytometry के मौलिक सिद्धांतों और intracellular धुंधला करने के लिए चुना गया था।

Introduction

हाल ही में सबूत यह दर्शाता है कि अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली, विशेष रूप से टी lymphocytes, कई हृदय रोगों 1,2,3,4,5 के विकास में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। उदाहरण के लिए, एंजियोटेनसिन द्वितीय प्रेरित उच्च रक्तचाप के मॉडल में, बर्तन और चूहों के गुर्दे में टी कोशिकाओं का एक संग्रह 6 वर्णित किया गया है। संवहनी संचय adventitia और परिवाहकीय वसा में मुख्य रूप से है। गुर्दे में, टी कोशिकाओं दोनों मज्जा और गुर्दे कोर्टेक्स में जमा है। पर जो सबसेट शामिल है निर्भर करता है, इन टी कोशिकाओं अलग साइटोकिन्स कि नाड़ी और गुर्दे समारोह को प्रभावित और विकृति के विकास के लिए नेतृत्व कर सकते हैं को जन्म दे (मैकमास्टर एट अल। 6 द्वारा समीक्षा)।

सीडी 4+ टी सहायक लिम्फोसाइटों कई सबसेट में बांटा जा सकता है: टी सहायक 1 (Th1), Th2, Th9, Th17, Th22, टी नियामक (Treg) कोशिकाओं, और टी कूपिक सहायक (Tfh) उनके कार्यों और हस्ताक्षर Cyto के आधार पर कोशिकाओंkines 7। इसी तरह, सीडी 8 + साइटोटोक्सिक टी कोशिकाओं TC1, TC2, Tc17 या TC9 8 के रूप में वर्गीकृत किया जा सकता है। वहाँ भी डबल नकारात्मक टी कोशिकाओं (यानी कोशिकाओं है कि सीडी 4 या सीडी 8 टी सेल मार्कर व्यक्त नहीं करते) हैं। इन कोशिकाओं के एक सबसेट एक वैकल्पिक गामा डेल्टा टी सेल रिसेप्टर (बजाय शास्त्रीय अल्फा और बीटा रिसेप्टर्स) के अधिकारी और इसलिए गामा डेल्टा टी कोशिकाओं के रूप में करने के लिए भेजा जाता है। सतह मार्कर, साइटोकाइन और प्रतिलेखन कारक के प्रवाह cytometry द्वारा मल्टी पैरामीटर विश्लेषण सबसे अच्छा तरीका इन कोशिकाओं की पहचान करने का गठन किया। हालांकि इस पद्धति बड़े पैमाने पर इम्यूनोलॉजी के क्षेत्र में प्रयोग किया जाता है, यह कम अच्छी तरह से ठोस अंगों में और हृदय रोगों की स्थापना में वर्णित है।

ऐतिहासिक दृष्टि से, ऊतकों में लिम्फोसाइट की पहचान immunohistochemistry या आरटी पीसीआर दृष्टिकोण तक ही सीमित था। हालांकि immunohistochemistry और immunofluorescence शक्तिशाली तरीकों int के एक प्रतिजन के ऊतक वितरण निर्धारित कर रहे हैंerest, वे phenotypically शामिल सबसेट की पहचान करने के लिए अपर्याप्त हैं। इसके अलावा, जबकि आरटी पीसीआर विश्लेषण एंटीजन, साइटोकिन्स या प्रतिलेखन कारक के mRNA अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए उपयोगी है, यह कई प्रोटीन का पता लगाने के साथ-साथ व्यक्ति की कोशिकाओं के स्तर पर अनुमति नहीं है।

प्रवाह के आगमन cytometry, खासकर जब intracellular धुंधला के साथ संयुक्त साइटोकिन्स और प्रतिलेखन कारक पता लगाने के लिए एक शक्तिशाली तकनीक है कि ठोस अंगों में प्रतिरक्षा सेल सबसेट के एकल कोशिका के स्तर पर पहचान और मात्रा का ठहराव की अनुमति देता है के साथ जांचकर्ताओं प्रदान करता है। हम प्रमुख टी सेल एंजियोटेनसिन द्वितीय प्रेरित उच्च रक्तचाप के एक मॉडल में murine गुर्दे, महाधमनी और महाधमनी draining लिम्फ नोड्स के भीतर मौजूद सबसेट प्रवाह cytometry द्वारा की पहचान के लिए एक intracellular धुंधला परख अनुकूलित है। प्रत्येक चरण के अनुकूलन: ऊतक पाचन, पूर्व vivo सक्रियण, permeabilization, और सतह और intracellular धुंधला परिणामों में एक अत्यधिक फिर सेproducible परख है कि अन्य हृदय और गुर्दे की बीमारी के मॉडल को लागू किया जा सकता है।

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Protocol

वेंडरबिल्ट विश्वविद्यालय के संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति प्रक्रियाओं यहाँ बताया मंजूरी दी है। चूहे रखे और देखभाल और प्रयोगशाला पशु के उपयोग के लिए गाइड के अनुसार के लिए परवाह कर रहे हैं (राष्ट्रीय अकादमियों प्रेस। संशोधित 2010)।

1. महाधमनी draining लिम्फ नोड्स, किडनी और चूहों से महाधमनी के अलगाव

  1. सीओ 2 साँस लेना द्वारा चूहों euthanize। 70% इथेनॉल के साथ छाती स्प्रे और ध्यान से त्वचा और कैंची से छाती दीवार दिल को बेनकाब करने के लिए खुला।
  2. वाहिका छिड़कना, सही आलिंद में एक छोटा सा चीरा प्रदर्शन और तेजी से बाएं वेंट्रिकल एक 21 या 23 जी सुई का उपयोग करने का सर्वोच्च में ठंड पीबीएस (लगभग 1 मिलीग्राम / सेक) के कम से कम 10 मिलीलीटर इंजेक्षन। छिड़कना जब तक सभी अंगों blanched है। दिल पहले Blanches। जिगर की blanching इंगित करता है कि छिड़काव अच्छी तरह से प्रदर्शन किया गया है।
  3. छोटे संदंश और ठीक कैंची का प्रयोग, धीरे दूर कटौती और आंतों बाहर खींच,पेट, प्लीहा, अग्न्याशय और जिगर बेहतर महाधमनी कल्पना करने के लिए।
    नोट: यह कदम जठरांत्र संबंधी मार्ग को क्षति के रूप में बहुत ठीक किया जा करने के लिए प्रदूषण को प्रेरित कर सकता है।
  4. बाहर कट और कैंची के साथ प्रत्येक फेफड़ों को हटा दें। फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के साथ छाती गुहा एक needleless सिरिंज का उपयोग कर कुल्ला। अतिरिक्त रक्त और तरल पदार्थ को हटाने बाँझ धुंध का उपयोग कर।
  5. ठीक विदारक संदंश का उपयोग उदर महाधमनी draining लिम्फ नोड्स निकालें। कैप्सूल टूटना करने के लिए नहीं सुनिश्चित करें। विदारक संदंश के साथ प्रत्येक लिम्फ नोड की सतह पर शेष वसा निकालें। ठीक कैंची के साथ दोनों गुर्दे बाहर कट।
  6. ठीक है, घुमावदार कैंची के साथ पूरे महाधमनी (वक्ष और उदर महाधमनी) काटना। दिल के स्तर पर शुरू और ध्यान से घेघा और श्रोणिफलक आसपास के परिवाहकीय वसा महाधमनी से जुड़ी रखने के लिए सुनिश्चित करने के विभाजन के स्तर तक नीचे कशेरुकाओं से दूर काटना।
    नोट: महाधमनी के आगे विच्छेदन रेमो कोve आसपास के ढांचे एक खुर्दबीन के तहत किया जा सकता है। विशेष रूप से, धमनी शाखाओं (मन्या धमनियों, subclavian धमनियों, सीलिएक, mesenteric, और गुर्दे की धमनियों) और लिम्फ नोड्स को हटा दें। प्रत्येक महाधमनी के आसपास परिवाहकीय वसा के अनुरूप एक परत रखना है क्योंकि यह एक साइट है जहाँ कई भड़काऊ कोशिकाओं उच्च रक्तचाप की स्थापना में रहते हैं। ठंड पीबीएस युक्त अलग ट्यूबों में प्रत्येक ऊतक रखें।

2. प्रत्येक ऊतक से एकल कक्ष निलंबन की पीढ़ी

  1. गुर्दे
    नोट: गुर्दा यांत्रिक हदबंदी प्लस enzymatic पाचन के संयोजन के द्वारा एक एकल कक्ष निलंबन में अलग किया जा सकता है।
    1. collagenase डी (2 मिलीग्राम / एमएल) और उनका कहना है 1640 मध्यम (5% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ पूरक) DNase मैं (100 माइक्रोग्राम / एमएल) RPMI करने से गुर्दे की पाचन समाधान तैयार है। गुर्दे नमूना प्रति 10 मिलीलीटर की तैयारी।
    2. गुर्दे को पचाने के 10 मिलीग्राम से युक्त एक हदबंदी ट्यूब में दो गुर्दे हस्तांतरण करने के लिए संदंश का प्रयोग करेंआयन समाधान।
    3. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक अर्द्ध स्वचालित dissociator डिवाइस का उपयोग यांत्रिक हदबंदी प्रदर्शन करना।
    4. यांत्रिक हदबंदी के बाद, डिवाइस से अलग और ट्यूब enzymatic पाचन प्रदर्शन करते हैं। निरंतर रोटेशन के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए नमूने सेते हैं। तुरंत ठंडे RPMI 1640 मध्यम 5% FBS के साथ पूरक जोड़कर enzymatic पाचन बंद करो।
    5. एक 40 माइक्रोन झरनी के माध्यम से छानने के बाद एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में pipetting द्वारा समाधान स्थानांतरण। 1 मिलीलीटर सिरिंज के सवार के साथ दबाकर अलावा शेष ऊतक को छेड़ो। कोशिकाओं (500 XG, 8 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस) गोली।
    6. 36% घनत्व ढाल centrifugation मीडिया के 3 मिलीलीटर में गोली Resuspend। एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में निलंबन स्थानांतरण। धीरे किसी व्यवधान के बिना 3 मिलीग्राम 36% सेल निलंबन के नीचे 72% घनत्व ढाल centrifugation मीडिया के 3 मिलीलीटर जोड़ें। अपकेंद्रित्र (ब्रेक के बिना 1,000 XG, 20 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस)। </ Li>
    7. प्रतिरक्षा कोशिकाओं इंटरफेस में स्थित हो जाएगा। सर्वोच्च पीले रंग की परत सेलुलर मलबे से युक्त निकालें और फिर ठंड पीबीएस का उपयोग कर 15 मिलीलीटर मात्रा को लाने के लिए। टूटने के लिए अच्छी तरह से ढाल हिला। कोशिकाओं (300 XG, 8 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस) स्पिन और 5% FBS के साथ RPMI के 3 मिलीलीटर में गोली resuspend। एक hemocytometer Trypan नीले बहिष्कार का उपयोग करने पर जीवित कोशिकाओं की संख्या की गणना।
  2. महा धमनी
    1. कोलैजिनेज़ ए (1 मिलीग्राम / एमएल), कोलैजिनेज़ बी (1 मिलीग्राम / एमएल) जोड़कर महाधमनी पाचन समाधान तैयार है, और DNase मैं (100 माइक्रोग्राम / एमएल) RPMI 1640 के लिए मध्यम (5% FBS के साथ पूरक)।
    2. ठीक संदंश का प्रयोग, महाधमनी पाचन समाधान के 1 मिलीलीटर युक्त एक 2 मिलीलीटर ट्यूब में महाधमनी हस्तांतरण। 1 मिलीलीटर पाचन समाधान में ठीक कैंची के साथ बहुत छोटे टुकड़ों में पूरे महाधमनी कीमा। बर्फ पर रखें। निरंतर रोटेशन के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए नमूने सेते हैं।
    3. एक टिशू कल्चर डिश के लिए समाधान स्थानांतरण और enzyma रोक5% FBS के साथ 5 बार ठंड RPMI की मात्रा जोड़कर टिक पाचन।
    4. एक 40 माइक्रोन झरनी के माध्यम से छानने के बाद एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में pipetting द्वारा समाधान स्थानांतरण। 1 मिलीलीटर सिरिंज के सवार के साथ दबाकर एक एकल कक्ष निलंबन में अलग से शेष ऊतक को छेड़ो। झरनी फ्लश और कोशिकाओं (300 XG, 8 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस) गोली।
    5. 5% FBS के साथ RPMI के 10 मिलीलीटर जोड़कर गोली धो लें। कोशिकाओं (300 XG, 8 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस) स्पिन और 5% FBS के साथ RPMI के 3 मिलीलीटर में गोली resuspend। एक hemocytometer Trypan नीले बहिष्कार का उपयोग करने पर जीवित कोशिकाओं की संख्या की गणना।
  3. महाधमनी draining लिम्फ नोड्स
    1. एक टिशू कल्चर पकवान (60 मिमी x 15 मिमी) में एक 40 माइक्रोन झरनी रखें। झरनी पर लिम्फ नोड्स की जगह और 1 मिलीलीटर सिरिंज के सवार के साथ दबाकर एक एकल कक्ष निलंबन में उन्हें अलग तंग। 5% FBS के साथ RPMI के 2 मिलीलीटर के साथ झरनी फ्लश। डिश में कोशिकाओं को ले लीजिए।
    2. हस्तांतरणएक 15 मिलीलीटर बाज़ ट्यूब में कोशिकाओं और गोली कोशिकाओं (300 XG, 8 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस)। 5% FBS के साथ RPMI के 500 μl में गोली Resuspend। एक hemocytometer Trypan नीले बहिष्कार का उपयोग करने पर जीवित कोशिकाओं की संख्या की गणना।

साइटोकाइन जांच से फ्लो द्वारा लिए 3. पूर्व विवो उत्तेजना

  1. 5% FBS, गैर आवश्यक अमीनो एसिड 0.1 मिमी, 50 माइक्रोन के β-mercaptoethanol और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ RPMI: सेल संस्कृति मीडिया तैयार करें।
  2. अपकेंद्रित्र प्रत्येक कोशिका निलंबन गुर्दे, महाधमनी और लिम्फ नोड्स से प्राप्त (300 XG, 8 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस)। मिलीलीटर प्रति 1 एक्स 10 6 कोशिकाओं की एकाग्रता में सेल संस्कृति मीडिया के साथ प्रत्येक गोली Resuspend।
  3. सेल संस्कृति के हर 1 मिलीलीटर के लिए सेल सक्रियण कॉकटेल (phorbol 12 myristate 13-एसीटेट (पीएमए), कैल्शियम ionophore ionomycin युक्त, और Golgi अवरोध Brefeldin ए) के 2 μl जोड़कर कोशिकाओं को उत्तेजित।
    नोट: अंतिम एकाग्रताप्रत्येक घटक की एस रहे हैं: पीएमए के 81 एनएम, पीएमए के साथ Brefeldin ए उपचार के 1.33 सुक्ष्ममापी ionomycin की और 5 माइक्रोग्राम / एमएल और ionomycin कोशिकाओं को सक्रिय साइटोकिन्स का उत्पादन। साइटोकिन्स प्रोटीन है कि कोशिकाओं में फंस जाना चाहिए पता लगाया जा स्रावित होते हैं। Brefeldin एक जालिका और Golgi तंत्र में सामान्य रूप से स्रावित प्रोटीन का संचय का कारण बनता है। इस प्रकार, तकनीक यहाँ वर्णित प्रवाह cytometry द्वारा साइटोकाइन उत्पादन लिम्फोसाइटों के detectability को बढ़ाता है।
  4. प्लेट 1 12 अच्छी तरह से 2 मिलियन कोशिकाओं (महाधमनी या गुर्दे) या 24 अच्छी तरह से (लिम्फ नोड) कम पालन प्लेटों के लिए। 3 घंटे के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस humidified सीओ 2 इनक्यूबेटर में थाली रखें।
    नोट: चढ़ाया कोशिकाओं की संख्या को नियंत्रित चूहों से लिम्फ नोड्स में कम हो सकता है। इसके अलावा, उत्तेजना के समय अनुभव से प्रत्येक कोशिका जनसंख्या और साइटोकाइन अध्ययन के लिए निर्धारित किया है। महाधमनी, गुर्दे या लिम्फ नोड्स से अलग टी कोशिकाओं के मामले में, हम 3 से 4 घंटे के लिए उत्तेजक सलाह देते हैं। एक लंबे समय तक उत्तेजना wबीमार साइटोकाइन स्राव में वृद्धि नहीं और CD3, सीडी 4 और सीडी 8 की तरह कई टी कोशिका की सतह मार्कर का एक और डाउनरेगुलेशन प्रेरित करेगा। (ध्यान दें कि यह भी एक 3-4 मानव संसाधन उत्तेजना इन मार्करों के कुछ डाउनरेगुलेशन प्रेरित करेगा।)

4. सतह धुंधला

  1. एक polystyrene FACS ट्यूब और सेंट्रीफ्यूज (300 XG, 8 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस) में कोशिकाओं स्थानांतरण। कोशिकाओं (सीए 2 और मिलीग्राम + मुक्त पीबीएस 4% FBS और 2 मिमी EDTA युक्त) FACS बफर के साथ दो बार धोएं और विभिन्न FACS वांछित एंटीबॉडी पैनलों की संख्या और नियंत्रण की जरूरत ट्यूब की संख्या के आधार पर ट्यूबों में समान रूप से सेल निलंबन विभाजित ( निचे देखो)।
  2. प्रत्येक पैनल के लिए मुआवजे का प्रदर्शन करने के लिए, प्रत्येक ऊतक प्रकार और एंटीबॉडी के पैनल के लिए बेदाग नियंत्रण ट्यूब और एकल दाग ट्यूबों तैयार। इसके अलावा, सभी लेकिन एंटीबॉडी के एक जोड़कर प्रत्येक एंटीबॉडी पैनल के लिए प्रतिदीप्ति शून्य से एक (FMO) नियंत्रण ट्यूबों तैयार करते हैं।
  3. FACS के साथ 2 मिलीलीटर के लिए प्रत्येक ट्यूब की मात्रा समायोजित करेंबफर। सेल निलंबन अपकेंद्रित्र (300 XG, 8 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस), तैरनेवाला और ब्लॉक एफसी रिसेप्टर्स कोशिकाओं incubating द्वारा विरोधी CD16 / CD32 एंटीबॉडी के साथ 0.5 ग्राम प्रति मिलियन कोशिकाओं बर्फ पर 10 मिनट के लिए हटा दें।
    नोट: CD16 कम आत्मीयता के आईजीजी एफसी रिसेप्टर III (एफसीआर तृतीय) है और CD32 एफसीआर द्वितीय है। CD16 / CD32 granulocytes, मस्तूल कोशिकाओं, monocytes / मैक्रोफेज, प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं बी कोशिकाओं, वृक्ष के समान कोशिकाओं और कुछ सक्रिय परिपक्व टी कोशिकाओं पर व्यक्त कर रहे हैं।
  4. व्यवहार्यता धुंधला प्रदर्शन करना: 1x पीबीएस के 1,000 μl में 1x पीबीएस, अपकेंद्रित्र (300 XG, 8 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस) और resuspend के साथ कोशिकाओं को धो लें। एक सेल impermeant एमाइन प्रतिक्रियाशील डाई (व्यवहार्यता दाग) की 1 μl जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के प्रकाश से सुरक्षित लिए सेते हैं।
  5. ऊष्मायन के दौरान, FACS बफर का एक उचित मात्रा में एंटीबॉडी (सतह धुंधला के लिए) का कॉकटेल तैयार करते हैं। कोशिकाओं FACS बफर के 1-2 मिलीलीटर के साथ दो बार धोएं, सेंट्रीफ्यूज (300 XG, 8 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस) और 100 μl के साथ प्रत्येक गोली resuspendएंटीबॉडी मिश्रण की। 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के प्रकाश से सुरक्षित लिए सेते हैं।
    नोट: एंटीबॉडी cytometry प्रत्येक प्रवाह के लिए, यह एक खुराक अनुमापन वक्र प्रदर्शन से जरूरत एंटीबॉडी की अधिकतम राशि निर्धारित करने के लिए उपयोगी है।
  6. कोशिकाओं (300 XG, 8 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस) FACS बफर के 2 मिलीलीटर के साथ दो बार कोशिकाओं को धो लें और गोली।

5. फिक्सेशन, Permeabilization और intracellular धुंधला

  1. एक निर्धारण और permeabilization निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए उचित buffers युक्त किट के साथ intracellular धुंधला प्रदर्शन करना। फिक्स और उन्हें उचित बफर में resuspending द्वारा कोशिकाओं permeabilize। 4 डिग्री सेल्सियस पर 40 मिनट के प्रकाश से सुरक्षित करने के लिए नमूने सेते हैं।
  2. 1x permeabilization के 1 मिलीलीटर जोड़ें और तय की और permeabilized कोशिकाओं को सीधे बफर धो लें। अपकेंद्रित्र (500 XG, 8 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस) और सतह पर तैरनेवाला हटा दें। 1x धो बफर के 2 मिलीलीटर के साथ गोली Resuspend।
  3. antib का मिश्रण तैयार करेंodies 1x धो बफर (ट्यूब प्रति आमतौर पर 100 μl) के एक उचित मात्रा में (intracellular केवल धुंधला के लिए)।
    नोट: ऊपर वर्णित है, इष्टतम एंटीबॉडी एकाग्रता पैनल में प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, आईएल 17A या आईएल 17F के लिए एंटीबॉडी के लिए, हम 1:30 के एक कमजोर पड़ने कारक का उपयोग करें, लेकिन IFNγ और टी-शर्त करने के लिए एंटीबॉडी के लिए, हम 1 के कमजोर पड़ने कारक का उपयोग करें: 100।
  4. अपकेंद्रित्र कोशिकाओं (500 XG, 8 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस) और एंटीबॉडी के मिश्रण के 100 μl के साथ प्रत्येक गोली resuspend। 4 डिग्री सेल्सियस पर 40 मिनट के प्रकाश से सुरक्षित लिए सेते हैं।
  5. कोशिकाओं (500 XG, 8 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस) 1x धो बफर के 2 मिलीलीटर के साथ दो बार कोशिकाओं को धो लें और गोली। 1x धो बफर के 300 μl के साथ गोली Resuspend और उचित फिल्टर के साथ एक प्रवाह cytometer पर विश्लेषण।
  6. ऊतक का नमूना प्रति कोशिकाओं की कुल संख्या की मात्रा का ठहराव, के लिए गिनती मोती का उपयोग करें। अधिग्रहण से पहले, प्रत्येक ट्यूब मोतियों की गिनती की सिफारिश की मात्रा / संख्या जोड़ सकते हैं।

6. मुआवजा, गेटिंग, सामान्य, और टिप्स

  1. मुआवजा और gating
    1. मुआवजे के लिए भागो बेदाग और एकल दाग नियंत्रण ट्यूबों वर्णक्रमीय ओवरलैप के लिए समायोजित करने के लिए।
      नोट: सेल आधारित मुआवजा नियंत्रण मुआवजा मोतियों के बजाय का उपयोग मामलों में जहां ब्याज या एक नमूने में सेल की आबादी के प्रतिजन इस तरह के कम स्तर है कि मुआवजे की कोशिकाओं का उपयोग मुश्किल हो जाएगा पर मौजूद है में आवश्यक है। नोट के अलावा, जब मिलकर रंगों का उपयोग कर, यह उचित एक प्रयोग के लिए तैयार करने के लिए मुआवजा के बाद से मिलकर रंगों बहुत कुछ करने वाली बहुत कुछ है और प्रत्येक दिन के साथ बदलती है।
    2. प्रतिदीप्ति शून्य से पैनल में सभी fluorophores के लिए एक नियंत्रण (FMOs) चलाने के लिए जब एक नया प्रयोग शुरू बहुरंगा।
      नोट: FMO नियंत्रण के नमूने है कि एक को छोड़कर पैनल में सभी एंटीबॉडी होते हैं। इन नियंत्रणों का लोप एंटीबॉडी को ठीक से adjus के लिए बनाम नकारात्मक संकेतों के सकारात्मक की सटीक भेदभाव की अनुमतिफाटक टी। इन नियंत्रणों को विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, जब अभिव्यक्ति के स्तर को कम कर रहे हैं या जब लक्षित जनसंख्या की जुदाई गरीब है (उदाहरण के लिए, जब लक्ष्य एक साइटोकाइन या प्रतिलेखन कारक है) कर रहे हैं। हालांकि हमेशा जरूरी नहीं है, कुछ मामलों में, निर्धारण नियंत्रण जगह में पसंद किया जा सकता की FMO को नियंत्रित करता है के रूप में वे एंटीबॉडी निर्धारण और fluorophore साधना प्रतिजन की विशिष्टता के बिना के लिए उचित मुआवजा प्रदान करते हैं।
    3. प्राथमिक गेट सेट करें: समायोजित आगे तितर बितर क्षेत्र (एफएससी-ए) और पक्ष तितर बितर क्षेत्र (एसएससी-ए) वोल्टेज आदेश ल्युकोसैट आबादी का पता लगाने के लिए।
    4. मृत कोशिकाओं को बाहर।
      नोट: व्यवहार्यता दाग मुक्त दोनों सतह और कोशिकाओं के इंटीरियर पर उपस्थित amines साथ प्रतिक्रिया करता है। इसके विपरीत कोशिकाओं जीने के लिए, मृत कोशिकाओं (समझौता झिल्ली) के साथ प्रोटीन लेबलिंग की मात्रा बढ़ रही है, डाई कोशिका द्रव्य में प्रवेश करने की अनुमति देते हैं। इस प्रकार, मृत कोशिकाओं को आसान भेदभाव की इजाजत दी जीवित कोशिकाओं की तुलना में उज्जवल होगा। Live पर गेटकोशिकाओं।
      नोट: महाधमनी और गुर्दे से सेल निलंबन की व्यवहार्यता अतिरिक्त पाचन कदम के कारण लिम्फ नोड्स से सेल निलंबन की व्यवहार्यता की तुलना में कम हो सकता है।
    5. प्लॉट आगे तितर बितर क्षेत्र (एफएससी-ए) [वाई अक्ष] और आगे तितर बितर ऊंचाई (एफएससी-एच) [एक्स अक्ष]। Singlets इस डॉट भूखंड पर एक विकर्ण रूप में दिखाई देते हैं। गेट इस विकर्ण पर दोहरी बाहर करने के लिए। तब एसएससी-ए [वाई अक्ष] और CD45 [एक्स अक्ष] साजिश है।
    6. CD45 + ल्युकोसैट आबादी को आसानी से पहचाना जा सकता है। इस आबादी पर गेट। इसके बाद आबादी इस आबादी से पहचाना जा सकता है।
  2. सेल की गिनती के सामान्यीकरण
    1. गिनती मोती विशेषताओं है कि कम एफएससी और उच्च एसएससी में परिणाम है। उदाहरण के लिए, यदि 50,000 मोती एकल कक्ष निलंबन के 300 μl में जोड़ रहे हैं, किसी भी निरपेक्ष संख्या की गणना के लिए समीकरण सेल प्रकार देने के प्रति ट्यूब इस प्रकार है:
      कोशिकाओं की संख्या पीएर ट्यूब = (प्रवाह द्वारा गिना मोतियों की 50,000 / संख्या) गिना कोशिकाओं की संख्या एक्स।
      इस गणना का उपयोग करना, ट्यूब प्रति किसी भी प्रकार की कोशिका की निरपेक्ष संख्या निर्धारित किया जा सकता है। कितने ट्यूबों के प्रत्येक अंग से उत्पन्न किया गया के आधार पर, अंग प्रति कोशिकाओं की संख्या की गणना की जा सकती है।
      नोट: प्रोटोकॉल के दौरान 4 डिग्री सेल्सियस पर सभी कोशिकाओं और अभिकर्मकों रखें। जोरदार vortexing से बचें क्योंकि यह कोशिकाओं को नुकसान पहुंचा सकते हैं। गोली कोशिकाओं के लिए कम से कम बलों का प्रयोग करें। FACS ट्यूब के बाद से यह कोशिका मृत्यु तेज़ कर सकते हैं में बुलबुले बनाने से बचें। छर्रों किसी भी समय बाहर सूखी मत देना।

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Representative Results

प्रोटोकॉल परमिट एंजियोटेनसिन द्वितीय प्रेरित उच्च रक्तचाप के एक मॉडल में murine गुर्दे, महाधमनी और महाधमनी draining लिम्फ नोड्स से अलग टी कोशिकाओं में सतह और intracellular मार्कर की पहचान का वर्णन किया। प्रतिनिधि परिणाम नीचे प्रस्तुत कर रहे हैं।

चित्रा 1 gating एक WT माउस उच्च रक्तचाप के लिए प्रेरित करने एंजियोटेनसिन द्वितीय के साथ संचार की महाधमनी से तैयार एक एकल कक्ष निलंबन में टी सेल की आबादी की पहचान करने के लिए इस्तेमाल की रणनीति को दर्शाता है। एक समान रणनीति गुर्दे और लिम्फ नोड्स में प्रयोग किया जाता है। आगे तितर बितर क्षेत्र (एफएससी-ए) और पक्ष तितर बितर क्षेत्र (एसएससी-ए) वोल्टेज ल्युकोसैट आबादी (G1) पता लगाने के लिए और मलबे को बाहर करने के लिए समायोजित किया गया। जीवित कोशिकाओं (G2) व्यवहार्यता मार्कर प्रशांत ब्लू के साथ संयुग्मित के लिए नकारात्मक हैं। लाइव कोशिकाओं तो केवल पर फाटक के लिए पर आगे तितर बितर ऊंचाई (एफएससी-एच) और आगे तितर बितर क्षेत्र (एफएससी-ए) gated थेस्वेटर आबादी (G3)। ल्यूकोसाइट्स तो एसएससी-ए और CD45 (जी -4) पर gating द्वारा चयन किया गया था। CD45 इस उदाहरण में AmCyan साथ संयुग्मित है। अंत में, टी कोशिकाओं CD45 + CD3 + आबादी (g5) के रूप में gated हैं। CD3 इस उदाहरण में PerCP-Cy5.5 साथ संयुग्मित है।

आईएल 17A और आईएल 17F murine गुर्दे और इस मॉडल में महाधमनी के भीतर टी कोशिकाओं के उत्पादन की उपस्थिति निर्धारित करने के लिए, एकल कक्ष निलंबन आईएल 17A और आईएल 17F के लिए दाग रहे थे। चित्रा 2 दिखाता है प्रतिदीप्ति शून्य से आईएल 17A और एक गुर्दा नमूने में आईएल 17F धुंधला के लिए एक नियंत्रण (FMOs) (क्रमश: FITC और एपीसी के साथ संयुग्मित)। FMO नियंत्रण के नमूने है कि एक को छोड़कर एक पैनल में सभी एंटीबॉडी होते हैं। जैसी कि उम्मीद थी, बहुत कुछ कोशिकाओं FMO नियंत्रण में आईएल 17A (2A चित्रा) या आईएल 17F (चित्रा 2 बी) के लिए सकारात्मक रहे हैं। ठीक से adj करने के लिए इन नियंत्रणों सकारात्मक बनाम नकारात्मक संकेतों के सटीक भेदभाव की अनुमतिअस्ट फाटक कोशिकाओं प्रयोगात्मक नमूनों में आईएल 17A या आईएल 17F के लिए सकारात्मक पहचान के लिए।

चित्रा 3 गुर्दा (चित्रा 3) से अलग टी कोशिकाओं और वाहन (शाम) या एंजियोटेनसिन द्वितीय (आंग द्वितीय) के साथ संचार WT चूहों की महाधमनी (चित्रा 3 बी) के intracellular धुंधला का एक उदाहरण है। दरअसल, कि आईएल 17A या आईएल 17F को व्यक्त टी कोशिकाओं की एक सबसेट इस मॉडल में दोनों के ऊतकों में पाया जा सकता है।

चित्रा 4 इस मॉडल (चित्रा 4 ए) में महाधमनी draining लिम्फ नोड्स के भीतर टी कोशिकाओं के intracellular धुंधला हो जाना दिखाता है। सीडी 8 + टी कोशिकाओं पहले (चित्रा 4 बी) gated थे। फिर, दो TC1 मार्करों की अभिव्यक्ति, साइटोकाइन IFNγ या प्रतिलेखन कारक टी शर्त, सीडी 8 + टी सेल सबसेट से मात्रा गया। चित्रा 4C IFN के लिए FMOs दिखाता है47; और लिम्फ नोड के नमूनों में टी-शर्त धुंधला (FITC और पीई Cy7 के साथ संयुग्मित, क्रमशः)। चित्रा 4D पता चलता है कि में WT चूहों की महाधमनी draining लिम्फ नोड्स एंजियोटेनसिन द्वितीय के साथ संचार, सीडी 8 + IFNγ + और सीडी 8 + टी-शर्त + कोशिकाओं की आबादी की पहचान की जा सकती है।

आकृति 1
चित्रा 1: gating रणनीति प्रवाह cytometry टी कोशिकाओं की पहचान करने के लिए। ल्यूकोसाइट्स पहले एक आगे तितर बितर / ओर तितर बितर (एफएससी-ए / एसएससी-ए) डॉट साजिश (G1), और जीवित कोशिकाओं चुने गए हैं (G2) पर gated हैं। कोशिकाओं तो singlets (एफएससी-ए / एफएससी-एच) (जी 3) पर gated हैं। जी 3 से कोशिकाओं को आगे CD45 (जी -4) की अभिव्यक्ति की विशेषता है। अंत में, टी कोशिकाओं पर CD45 + CD3 + डबल सकारात्मक कोशिकाओं (g5) gated हैं। यह एकल कक्ष निलंबन एक जंगली प्रकार से अलग पूरे महाधमनी से तैयार किया गया था (डब्ल्यूटी) माउस angiot के साथ संचार ensin द्वितीय उच्च रक्तचाप प्रेरित करने के लिए। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: प्रतिदीप्ति शून्य से एक नियंत्रण (FMO) आईएल 17A और आईएल 17F के लिए। (ए) एक एंजियोटेनसिन द्वितीय इलाज किया murine गुर्दे नमूना से अलग एक एकल कक्ष निलंबन एक फिक्स व्यवहार्यता मार्कर (प्रशांत ब्लू), CD45 (AmCyan), CD3 (PerCP-Cy5.5) और आईएल 17F (एपीसी) का उपयोग सना हुआ था। आईएल 17A के लिए एंटीबॉडी आईएल 17A के लिए उचित gating निर्धारित करने के लिए छोड़ा गया था। (बी) के एक एंजियोटेनसिन द्वितीय इलाज किया murine गुर्दे नमूना से अलग एक एकल कक्ष निलंबन एक फिक्स व्यवहार्यता मार्कर (प्रशांत ब्लू), CD45 (AmCyan), CD3 (PerCP-Cy5.5) और आईएल 17A (FITC) का उपयोग सना हुआ था। इस मामले में, आईएल 17F के लिए एंटीबॉडी छोड़ा गया था।urce.jove.com/files/ftp_upload/55266/55266fig2large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: आईएल 17A और आईएल 17F के लिए murine गुर्दे और महाधमनी से अलग टी कोशिकाओं के intracellular धुंधला हो जाना। फ्लो का गुर्दा (ए) और वाहन (शाम) के साथ संचार WT चूहों या एंजियोटेनसिन द्वितीय (आंग द्वितीय) और पहले पर CD45 + CD3 गेटेड से महाधमनी (बी) से टी कोशिकाओं में आईएल 17A और आईएल 17F अभिव्यक्ति दिखा भूखंडों डॉट + कोशिकाओं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: टी सेल के intracellular धुंधला murine महाधमनी draining लिम्फ नोड्स से अलग रहा है। (ए) Macroscopic एक WT माउस में दो काठ का महाधमनी draining लिम्फ नोड्स के दिखावे। (बी) सीडी 4 + और सीडी 8 + टी कोशिकाओं की डॉट भूखंडों चार महाधमनी draining लिम्फ एक WT माउस से अलग नोड्स से अलग एंजियोटेनसिन द्वितीय के साथ संचार और पहले पर CD45 + CD3 + कोशिकाओं gated cytometry प्रतिनिधि प्रवाह। (सी) एक एकल कोशिका लिम्फ नोड्स से अलग निलंबन एक व्यवहार्यता मार्कर (प्रशांत ब्लू) का उपयोग सना हुआ था, CD3 (PerCP-Cy5.5), सीडी 4 (एपीसी-Cy7), और सीडी 8 (एपीसी)। FMO नियंत्रण में दिखाया जाता है, जिसमें IFNγ (FITC) या टी-शर्त (पीई Cy7) के लिए एंटीबॉडी उचित gating निर्धारित करने के लिए छोड़ा गया था। (डी) cytometry FMO नियंत्रण द्वारा निर्धारित फाटकों का उपयोग सीडी 8 + लिम्फ नोड टी कोशिकाओं के भीतर सकारात्मक IFNγ और टी-शर्त अभिव्यक्ति का प्रदर्शन भूखंडों डॉट प्रवाह।जी "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Disclosures

एमएसएम गिलाद हृदय विज्ञान से अनुदान द्वारा समर्थित है।

Acknowledgments

इस काम के फ्लोरिडा में एक अमेरिकी हार्ट एसोसिएशन फैलोशिप अवार्ड (16POST29950007), स्वास्थ्य (एनआईएच T32 HL069765) BLD, एमए सालेह के लिए एक अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन फैलोशिप अवार्ड (14POST20420025) के राष्ट्रीय संस्थानों से एक प्रशिक्षण अनुदान, और एक एनआईएच द्वारा समर्थित किया गया K08 पुरस्कार एमएसएम के लिए (HL121671)। एमएसएम भी गिलाद विज्ञान, इंक से एक शोध अनुदान द्वारा समर्थित है

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collagenase D ROCHE 11088882001
Collagenase A ROCHE 10103586001
Collagenase B ROCHE 11088815001
Dnase ROCHE 10104159001
1x Red blood cell lysis buffer eBioscience 00-4333-57
RPMI Medium 1614 1x Gibco 11835-030
DPBS without calcium and magnesium Gibco 14190-144
Percoll GE Healthcare 17-5445-02 For density gradient centrifugation
GentleMACS™ C tube Miltenyi Biotec 130-096-334
GentleMACS dissociator device Miltenyi Biotec 130-093-235 Use the program SPLEEN_04
Cell activation cocktail (with Brefeldin A) Biolegend 423303
anti-CD16/32 eBioscience 14-0161-81 dilute 1:100
LIVE/DEAD fixable violet dead cell stain kit Life Technologies L34955
Transcription factor buffer set BD Pharmingen 562725
OneComp eBeads  eBioscience 01-1111-42
123 count eBeads eBioscience 01-1234-42
CD45 AmCyan (clone 30-F11) BioLegend 103138
CD3 PerCP-Cy5.5 (clone 17A2) BioLegend 100218
IL-17A FITC (clone TC11-18H10.1) BioLegend 506910
IL-17F APC (clone 9D3.1C8) BioLegend 517004
CD4 APC-Cy7 (clone GK1.5) BD Biosciences 560181
CD8 APC (clone 53-67) eBioscience 17-0081-82
T-bet PE-Cy7 (clone 4B10) BioLegend 644823
IFNγ FITC (clone XMG1.2) BD Biosciences 557724

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References

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इम्यूनोलॉजी अंक 119 intracellular धुंधला प्रवाह cytometry टी कोशिकाओं लिम्फोसाइट कैंपेन्स साइटोकिन्स उच्च रक्तचाप
Intracellular धुंधला और फ्लो का उच्च रक्तचाप के एक मॉडल में murine महाधमनी, किडनी और लिम्फ नोड्स के भीतर लिम्फोसाइट सबसेट की पहचान करने के लिए
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Laroumanie, F., Dale, B. L., Saleh, M. A., Madhur, M. S. Intracellular Staining and Flow Cytometry to Identify Lymphocyte Subsets within Murine Aorta, Kidney and Lymph Nodes in a Model of Hypertension. J. Vis. Exp. (119), e55266, doi:10.3791/55266 (2017).

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