Intracelular Coloração e Citometria de Fluxo para identificar linfócitos subconjuntos dentro Murino Aorta, rim e linfonodos em um modelo de hipertensão

Fanny Laroumanie; Bethany L. Dale; Mohamed A. Saleh; Meena S. Madhur

doi:10.3791/55266

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Artigo de método

Intracelular Coloração e Citometria de Fluxo para identificar linfócitos subconjuntos dentro Murino Aorta, rim e linfonodos em um modelo de hipertensão

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DOI:

10.3791/55266

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28 de janeiro de 2017

Fanny Laroumanie¹ , Bethany L. Dale² , Mohamed A. Saleh³ , Meena S. Madhur¹

¹Department of Medicine, Division of Clinical Pharmacology, Vanderbilt University Medical Center, ²Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University, ³Department of Pharmacology and Toxicology, Faculty of Pharmacy, Mansoura University

Neste artigo

Resumo

Este artigo fornece metodologia detalhada para identificar e quantificar os subconjuntos de linfócitos T funcionais presentes dentro de rim murino, aorta e linfonodos por coloração intracelular e citometria de fluxo. O modelo de hipertensão induzida por angiotensina II foi escolhido para explicar, passo-a-passo, os procedimentos e os princípios fundamentais da citometria de fluxo e coloração intracelular.

Resumo

Sabe-se hoje que os linfócitos T desempenham um papel crítico no desenvolvimento de várias doenças^{cardiovasculares1,2,3,4,5}. Por exemplo, estudos de nosso grupo mostraram que a hipertensão está associada a um acúmulo excessivo de células T nos vasos e rins durante o desenvolvimento da hipertensão experimental⁶. Uma vez nesses tecidos, as células T produzem várias citocinas que afetam a função vascular e renal, levando à vasoconstrição e retenção de sódio e água^1,2. Para entender completamente como as células T causam doenças cardiovasculares e renais, é importante ser capaz de identificar e quantificar os subconjuntos específicos de células T presentes nesses tecidos. Os subconjuntos de células T são definidos por uma combinação de marcadores de superfície, as citocinas que secretam e os fatores de transcrição que expressam. A complexidade da população de células T torna a citometria de fluxo e a coloração intracelular uma técnica inestimável para dissecar os fenótipos dos linfócitos presentes nos tecidos. Aqui, fornecemos um protocolo detalhado para identificar os marcadores de superfície e intracelulares (citocinas e fatores de transcrição) em células T isoladas de rins murinos, aorta e linfonodos de drenagem aórtica em um modelo de hipertensão induzida por angiotensina II. As seguintes etapas são descritas em detalhes: isolamento dos tecidos, geração das suspensões unicelulares, estimulação ex vivo, fixação, permeabilização e coloração. Além disso, vários princípios fundamentais das análises de citometria de fluxo, incluindo a escolha dos controles adequados e estratégias de gating apropriadas, são discutidos.

Introdução

Evidências recentes demonstram que o sistema imunitário adaptativo, em particular linfócitos T, desempenham um papel crítico no desenvolvimento de várias doenças cardiovasculares ^1,2,3,4,5. Por exemplo, no modelo de hipertensão induzida por angiotensina II, uma acumulação de células T nos vasos e nos rins de ratinhos foi descrito ^6. A acumulação vascular é predominantemente na adventícia ea gordura perivascular. No rim, as células T acumular tanto na medula e no córtex renal. Dependendo de qual subconjunto está envolvida, estas células T dar origem a diferentes citocinas que podem afectar a função renal e vascular e conduzem ao desenvolvimento d....