Summary
وتنص هذه المادة منهجية مفصلة لتحديد وقياس وظيفية فرعية T اللمفاوية موجودة داخل الكلى الفئران، الشريان الأورطي والغدد الليمفاوية عن طريق تلطيخ الخلايا والتدفق الخلوي. وقد تم اختيار نموذج أنجيوتنسين الثاني وارتفاع ضغط الدم الناجم عن لشرح، خطوة بخطوة، والإجراءات والمبادئ الأساسية للالتدفق الخلوي وتلطيخ الخلايا.
Introduction
وتفيد أحدث البيانات أن نظام المناعة على التكيف، وخاصة الخلايا الليمفاوية T، تلعب دورا حاسما في تطوير العديد من الأمراض القلبية الوعائية 1،2،3،4،5. على سبيل المثال، في نموذج أنجيوتنسين الثاني وارتفاع ضغط الدم الناجم، وقد وصفت تراكم خلايا T في الأوعية والكلى من الفئران 6. تراكم الأوعية الدموية في الغالب في البرانية والدهون ماحول الأوعية. في الكلى، وخلايا T تتراكم في كل من النخاع والقشرة الكلوية. اعتمادا على مجموعة فرعية تشارك هذه الخلايا T تثير السيتوكينات المختلفة التي يمكن أن تؤثر على وظيفة الأوعية الدموية والكلى ويؤدي إلى تطوير علم الأمراض (التي استعرضتها ماكماستر وآخرون. 6).
ويمكن تقسيم CD4 + T الخلايا الليمفاوية المساعدة إلى عدة مجموعات فرعية: T المساعد 1 (TH1)، TH2، Th9، Th17، Th22، تي التنظيمية (Treg) الخلايا، وتي المساعد الجريبي (مرفأ تونس المالي) الخلايا استنادا مهامهم وخلوي توقيعkines 7. وبالمثل، خلايا CD8 + التائية السامة يمكن أن تصنف على أنها TC1، TC2، Tc17 أو Tc9 8. وهناك أيضا مزدوجة خلايا T السلبية (أي الخلايا التي لا تعبر عن CD4 أو علامات الخلية التائية CD8). مجموعة فرعية من هذه الخلايا تمتلك لجاما دلتا مستقبلات الخلايا التائية البديل (بدلا من الكلاسيكية ألفا ومستقبلات بيتا)، وبالتالي يشار اليها على أنها جاما دلتا خلايا تي. تحليل متعددة المعلمة بواسطة التدفق الخلوي من علامة السطح، خلوى وعامل النسخ يشكل أفضل نهج لتحديد هذه الخلايا. على الرغم من أن استخدام هذا الأسلوب على نطاق واسع في مجال علم المناعة، فإنه يوصف بشكل أقل في الأجهزة الصلبة وفي تحديد أمراض القلب والأوعية الدموية.
تاريخيا، وتحديد الخلايا الليمفاوية في الأنسجة اقتصر على المناعية أو النهج RT-PCR. على الرغم من أن المناعية والمناعي وطرق قوية لتحديد توزيع الأنسجة من مستضد من كثافة العملياتerest، فهي غير كافية لتحديد النمط الظاهري المجموعات الفرعية المعنية. وبالإضافة إلى ذلك، في حين أن تحليل RT-PCR هو مفيد للكشف عن التعبير مرنا من المستضدات، السيتوكينات أو عوامل النسخ، فإنه لا يسمح للكشف عن البروتينات متعددة في وقت واحد على مستوى الخلايا الفردية.
ظهور التدفق الخلوي، وخصوصا عندما يقترن تلطيخ الخلايا للكشف عن السيتوكينات وعوامل النسخ، ويقدم المحققون مع تقنية قوية تسمح بتحديد وتقدير على مستوى خلية واحدة من مجموعات فرعية الخلايا المناعية في الأعضاء الصلبة. لقد الأمثل مقايسة تلطيخ الخلايا لتحديد التدفق الخلوي مجموعات فرعية الخلايا التائية الكبرى موجودة داخل الكلى الفئران، الشريان الأورطي والشريان الأبهر تصريف الغدد الليمفاوية في نموذج للأنجيوتنسين الثاني وارتفاع ضغط الدم الناجم. الاستفادة المثلى من كل خطوة: الهضم الأنسجة، خارج الحي التنشيط، permeabilization، والسطحية والنتائج تلطيخ الخلايا في إعادة للغايةفحص producible التي يمكن تطبيقها على نماذج مرض القلب والأوعية الدموية والكلى أخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وافقت لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي جامعة فاندربيلت الإجراءات الموضحة في هذه الوثيقة. ويعيش الفئران ويعتني به وفقا لدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية (مطبعة الأكاديميات القومية. المنقحة 2010).
1. عزل من الأورطي تصريف الغدد الليمفاوية، الكلى والشريان الأورطي من الفئران
- الموت ببطء الفئران عن طريق CO 2 الاستنشاق. رش الصدر مع 70٪ من الإيثانول وفتح بعناية الجلد وجدار الصدر مع مقص لفضح القلب.
- ليروي الأوعية الدموية، إجراء شق صغير في الأذين الأيمن وحقن بثبات لا يقل عن 10 مل من البرد PBS (حوالي 1 مل / ثانية) في قمة البطين الأيسر باستخدام 21 أو 23 G إبرة. يروي حتى المقشر جميع الأجهزة. قلب يبيض أولا. ابيضاض الكبد يدل على أن نضح تم أداء جيدا.
- باستخدام ملقط صغير ومقص غرامة، وقطع بلطف بعيدا وسحب الأمعاء،المعدة والطحال والبنكرياس والكبد لتصور أفضل الشريان الأورطي.
ملاحظة: هذه الخطوة لابد من القيام به على وجه التحديد للغاية حيث الأضرار التي لحقت الجهاز الهضمي يمكن أن تحفز التلوث. - قطع وإزالة كل الرئة مع مقص. شطف تجويف الصدر مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) باستخدام حقنة needleless. إزالة الدم الزائد والسوائل باستخدام شاش معقم.
- إزالة الأورطي الغدد الليمفاوية استنزاف البطن باستخدام ملقط تشريح غرامة. تأكد من عدم تمزق الكبسولة. إزالة الدهون المتبقية على سطح كل العقدة الليمفاوية مع ملقط تشريح. قطع الكليتين مع مقص غرامة.
- تشريح الشريان الأورطي بأكمله (الشريان الأورطي الصدري والبطن) مع غرامة مقص منحني. تبدأ على مستوى القلب وتشريح بعناية بعيدا عن المريء وفقرات وصولا الى مستوى التشعب الحرقفي والتأكد من الحفاظ على الدهون ماحول الأوعية المحيطة تعلق على الشريان الأورطي.
ملاحظة: مزيد من تشريح الشريان الأورطي إلى ريمولقد الهياكل المحيطة بها ويمكن أن يتم تحت المجهر. على وجه التحديد، وإزالة الفروع الشريانية (الشرايين السباتية، الشرايين تحت الترقوة، الاضطرابات الهضمية، المساريقي، والشرايين الكلوية) والغدد الليمفاوية. لا تبقي طبقة ثابتة من الدهون ماحول الأوعية حول كل الشريان الأورطي لأن هذا هو موقع حيث توجد العديد من الخلايا الالتهابية في حالة ارتفاع ضغط الدم. ضع كل الأنسجة في أنابيب منفصلة تحتوي على برنامج تلفزيوني الباردة.
2. توليد تعليق خلية واحدة من كل الأنسجة
- الكلى
ملاحظة: يمكن فصلها الكلى في تعليق خلية واحدة من خلال الجمع بين التفكك الميكانيكية بالإضافة إلى الهضم الأنزيمي.- إعداد الحل الهضم الكلى عن طريق إضافة كولاجيناز D (2 ملغ / مل)، والدناز الأول (100 ميكروغرام / مل) إلى المتوسط 1640 RPMI (تستكمل مع 5٪ مصل بقري جنيني (FBS)). إعداد 10 مل لكل عينة الكلى.
- استخدام ملقط لنقل الكليتين في أنبوب تفارق تحتوي على 10 مل من الكلى الهضمحل أيون.
- أداء التفكك الميكانيكي باستخدام جهاز الآلي شبه dissociator وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
- بعد تفكك الميكانيكية، وفصل أنبوب من الجهاز وتنفيذ عملية الهضم الأنزيمي. احتضان هذه العينات لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية تحت دوران مستمر. على الفور وقف عملية الهضم الأنزيمي بإضافة البارد المتوسط 1640 RPMI تستكمل مع 5٪ FBS.
- نقل الحل من قبل pipetting إلى 50 مل أنبوب مخروطي بعد تصفية من خلال مصفاة 40 ميكرون. ندف الأنسجة المتبقية بعيدا عن طريق الضغط مع المكبس من حقنة 1 مل. بيليه الخلايا (500 x ج، 8 دقائق، 4 درجة مئوية).
- resuspend الكرية إلى 3 مل من 36٪ كثافة التدرج وسائل الإعلام الطرد المركزي. نقل تعليق في أنبوب مخروطي 15 مل. إضافة بلطف 3 مل من 72٪ سائل الإعلام التدرج الكثافة الطرد المركزي تحت تعليق خلية 3 مل 36٪ من دون أي انقطاع. أجهزة الطرد المركزي (1000 x ج من دون فرامل، 20 دقيقة، 4 درجات مئوية). </ لى>
- سوف يكون موجودا في الخلايا المناعية في واجهة. إزالة أعلى طبقة صفراء تحتوي على الحطام الخلوي وثم جعل حجم ما يصل الى 15 مل باستخدام برنامج تلفزيوني الباردة. يهز جيدا إلى انهيار التدرج. تدور الخلايا (300 x ج، 8 دقائق، 4 ° C) و resuspend بيليه في 3 مل من RPMI مع FBS 5٪. حساب عدد الخلايا الحية على عدادة الكريات باستخدام التريبان الأزرق الاستبعاد.
- الشريان الأبهر
- إعداد الحل الهضم الأبهر عن طريق إضافة كولاجيناز ألف (1 ملغ / مل)، كولاجيناز B (1 ملغ / مل)، والدناز الأول (100 ميكروغرام / مل) إلى المتوسط 1640 RPMI (تستكمل مع 5٪ FBS).
- باستخدام ملقط غرامة، ونقل الشريان الأورطي في أنبوب 2 مل تحتوي على 1 مل من محلول الشريان الأورطي الهضم. تخطر على الشريان الأورطي كله إلى قطع صغيرة جدا مع مقص الجميلة في حل الهضم 1 مل. الحفاظ على الجليد. احتضان هذه العينات لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية تحت دوران مستمر.
- نقل الحل على طبق زراعة الأنسجة ووقف enzymaالهضم عرة بإضافة 5 أضعاف حجم RPMI الباردة مع 5٪ FBS.
- نقل الحل من قبل pipetting إلى 50 مل أنبوب مخروطي بعد تصفية من خلال مصفاة 40 ميكرون. ندف الأنسجة المتبقية بعيدا في تعليق وحيد الخلية عن طريق الضغط مع المكبس من حقنة 1 مل. تدفق مصفاة وبيليه الخلايا (300 x ج، 8 دقائق، 4 درجة مئوية).
- يغسل بيليه بإضافة 10 مل من RPMI مع FBS 5٪. تدور الخلايا (300 x ج، 8 دقائق، 4 ° C) و resuspend بيليه في 3 مل من RPMI مع FBS 5٪. حساب عدد الخلايا الحية على عدادة الكريات باستخدام التريبان الأزرق الاستبعاد.
- والأبهر تصريف الغدد الليمفاوية
- وضع مصفاة 40 ميكرومتر في طبق زراعة الأنسجة (60 ملم × 15 ملم). وضع الغدد الليمفاوية على مصفاة وندف بينهما في تعليق وحيد الخلية عن طريق الضغط مع المكبس من حقنة 1 مل. تدفق مصفاة مع 2 مل من RPMI مع FBS 5٪. جمع الخلايا في الطبق.
- تحويلخلايا في أنبوب الصقر 15 مل وبيليه الخلايا (300 x ج، 8 دقائق، 4 درجة مئوية). Resuspend وبيليه في 500 ميكرولتر من RPMI مع FBS 5٪. حساب عدد الخلايا الحية على عدادة الكريات باستخدام التريبان الأزرق الاستبعاد.
3. فيفو السابقين تحفيز للكشف خلوى بواسطة التدفق الخلوي
- إعداد وسائل الإعلام ثقافة الخلية: RPMI مع FBS 5٪، 0.1 ملم من الأحماض الأمينية غير الأساسية، 50 ميكرومتر β-المركابتويثانول و 1٪ البنسلين / الستربتومايسين.
- أجهزة الطرد المركزي كل تعليق خلية تم الحصول عليها من الكلى، الشريان الأورطي والغدد الليمفاوية (300 x ج، 8 دقائق، 4 درجة مئوية). resuspend كل بيليه مع وسائل الإعلام ثقافة الخلية بتركيز 1 × 10 6 خلايا لكل مل.
- تحفيز الخلايا عن طريق إضافة 2 ميكرولتر من الكوكتيل تنشيط الخلايا (التي تحتوي على Phorbol 12 ميريستيت 13-خلات (سلطة النقد الفلسطينية)، وionomycin حامل الأيون الكالسيوم، والمانع جولجي Brefeldin أ) لكل 1 مل من ثقافة الخلية.
ملاحظة: التركيز النهائيالصورة من كل مكون و: 81 نانومتر من سلطة النقد الفلسطينية، 1.33 ميكرومتر من ionomycin و 5 ميكروغرام / مل من Brefeldin A. المعاملة مع سلطة النقد الفلسطينية وionomycin ينشط الخلايا لإنتاج السيتوكينات. تفرز السيتوكينات البروتينات التي يجب أن المحاصرين في الخلايا ليتم الكشف. Brefeldin ويتسبب في تراكم البروتينات يفرز عادة في أجهزة شبكية وجولجي اندوبلازمية. وهكذا، فإن تقنية الموضحة هنا يعزز الكشف عن الخلايا الليمفاوية المنتجة للخلوى بواسطة التدفق الخلوي. - لوحة 1-2000000 الخلايا في 12 كذلك (الشريان الأورطي أو الكلى) أو 24-جيدا (العقدة الليمفاوية) لوحات-الالتزام المنخفض. وضع لوحة في 37 درجة مئوية ترطيب CO 2 الحاضنة لمدة 3 ساعة.
ملاحظة: قد يكون عدد الخلايا مطلي أقل في الغدد الليمفاوية من السيطرة على الفئران. أيضا، فإن الوقت من التحفيز لابد من تحديد تجريبيا لكل سكان الخلية وخلوى دراستها. في حالة الخلايا T معزولة من الشريان الأورطي، الكلى أو الغدد الليمفاوية، ونحن نوصي تحفيز لمدة 3 إلى 4 ساعات. أطول التحفيز ثسوء لا يزيد من إفراز السيتوكينات وسوف تحفز على downregulation مزيد من العديد من علامات سطح الخلية التائية مثل CD3، CD4 و CD8. (لاحظ أنه حتى التحفيز 3-4 ساعة من شأنها أن تحفز بعض downregulation من هذه العلامات.)
تلطيخ 4. السطح
- نقل الخلايا في أنبوب البوليسترين FACS وأجهزة الطرد المركزي (300 x ج، 8 دقائق، 4 درجة مئوية). غسل الخلايا مرتين مع العازلة FACS (الكالسيوم والمغنيسيوم 2+ + مجانا برنامج تلفزيوني يحتوي على 4٪ FBS و2mm و EDTA) وتقسيم الخلية تعليق على قدم المساواة في أنابيب نظام مراقبة الأصول الميدانية المختلفة استنادا إلى عدد من لوحات الأجسام المضادة المطلوبة وعدد من أنابيب السيطرة الحاجة ( انظر أدناه).
- لأداء التعويض عن كل لوحة، وإعداد أنابيب تحكم غير ملوثين وأنابيب الملون واحدة لكل نوع الأنسجة ولوحة الأجسام المضادة. وبالإضافة إلى ذلك، وإعداد أنابيب تحكم مضان ناقص واحد (FMO) لكل لوحة الضد بإضافة لكن كل واحد من الأجسام المضادة.
- ضبط مستوى الصوت من كل أنبوب إلى 2 مل مع نظام مراقبة الأصول الميدانيةمتعادل. الطرد المركزي تعليق خلية (300 x ج، 8 دقائق، 4 ° C)، وإزالة طاف وكتلة التيسير مستقبلات التي يحتضنها الخلايا مع 0.5 ميكروغرام من الأجسام المضادة لمكافحة CD16 / CD32 لكل مليون خلايا لمدة 10 دقيقة على الجليد.
ملاحظة: CD16 منخفضة تقارب مفتش التيسير مستقبلات الثالث (FCR الثالث) وCD32 هو FCR الثاني. يتم التعبير عن CD16 / CD32 على المحببة، الخلايا البدينة، وحيدات / الضامة، الخلايا القاتلة الطبيعية، الخلايا البائية، والخلايا الجذعية وبعض خلايا ناضجة تي تفعيلها. - أداء الجدوى تلطيخ: غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني 1X، الطرد المركزي (300 x ج، 8 دقائق، 4 ° C) و resuspend في 1000 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1X. إضافة 1 ميكرولتر من-أمين رد الفعل صبغ (الملاءمة وصمة عار) خلايا impermeant. احتضان لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية محمية من الضوء.
- أثناء الحضانة، وإعداد مزيج من الأجسام المضادة (لتلطيخ السطح) في حجم مناسب من العازلة FACS. غسل الخلايا مرتين مع 1-2 مل من FACS العازلة، الطرد المركزي (300 x ج، 8 دقائق، 4 ° C) و resuspend كل بيليه مع 100 ميكرولترمن خليط الأضداد. احتضان لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية محمية من الضوء.
ملاحظة: للحصول على كل التدفق الخلوي الأجسام المضادة، فإنه من المفيد لتحديد المبلغ الأمثل من الأجسام المضادة اللازمة عن طريق إجراء منحنى الجرعة المعايرة. - غسل الخلايا مرتين مع 2 مل من العازلة FACS وبيليه الخلايا (300 x ج، 8 دقائق، 4 درجة مئوية).
5. التثبيت، Permeabilization وبين الخلايا تلطيخ
- أداء تلطيخ الخلايا مع مجموعة التثبيت وpermeabilization تحتوي على مخازن مناسبة باتباع إرشادات الشركة المصنعة. إصلاح وpermeabilize الخلايا عن طريق إعادة التعليق عليها في العازلة المناسبة. احتضان العينات لمدة 40 دقيقة في 4 درجات مئوية محمية من الضوء.
- إضافة 1 مل من 1X permeabilization وغسل العازلة مباشرة إلى الخلايا الثابتة وpermeabilized. أجهزة الطرد المركزي (500 x ج، 8 دقائق، 4 ° C) وإزالة طاف. Resuspend وبيليه مع 2 مل من 1X العازلة يغسل.
- إعداد خليط من antibodies (لتلطيخ الخلايا فقط) في حجم مناسب من غسل العازلة 1X (عادة 100 ميكرولتر في الأنبوب).
ملاحظة: كما هو موضح أعلاه، يجب أن يتم تحديدها لكل الأجسام المضادة في لوحة تركيز الأجسام المضادة الأمثل. على سبيل المثال، عن الأجسام المضادة لIL-17A أو IL-17F، ونحن نستخدم عامل التخفيف من 01:30، ولكن لأجسام مضادة لIFNγ وتي الرهان، ونحن نستخدم عامل التخفيف من 1: 100. - الطرد المركزي الخلايا (500 x ج، 8 دقائق، 4 ° C) و resuspend كل بيليه مع 100 ميكرولتر من خليط الأضداد. احتضان لمدة 40 دقيقة في 4 درجات مئوية محمية من الضوء.
- غسل الخلايا مرتين مع 2 مل من غسل العازلة 1X و بيليه الخلايا (500 x ج، 8 دقائق، 4 درجة مئوية). resuspend الكرية مع 300 ميكرولتر من غسل العازلة 1X وتحليل على تدفق عداد الكريات مع الفلاتر المناسبة.
- لالكمي من العدد الكلي للخلايا لكل عينة الأنسجة، واستخدام الخرز العد. قبل الشراء، إضافة أوصى حجم / عدد من عد حبات لكل أنبوب.
6. التعويض، المحاصرة، التطبيع، ونصائح
- التعويض والمحاصرة
- تشغيل أنابيب التحكم الملون غير ملوثين واحدة للحصول على تعويضات لضبط التداخل الطيفي.
ملاحظة: إن استخدام حبات التعويض بدلا من ضوابط التعويض على أساس خلية ضروري في الحالات التي يكون فيها مستضد من الفائدة أو السكان الخلية في عينة موجود في مثل هذه المستويات المنخفضة التي التعويض باستخدام خلايا سيكون صعبا. ومن الجدير ذكره أنه عند استخدام الأصباغ جنبا إلى جنب، فإنه من المستحسن لإعداد التعويضات لكل تجربة منذ الأصباغ جنبا إلى جنب تختلف في الكثير إلى الكثير ومع كل يوم. - تشغيل مضان ناقص واحد الضوابط (FMOs) لجميع fluorophores في لوحة عند بدء التجربة متعدد الألوان الجديدة.
ملاحظة: ضوابط FMO هي العينات التي تحتوي على جميع الأجسام المضادة في لوحة باستثناء واحد. تسمح هذه الضوابط التمييز الدقيق للإيجابية مقابل إشارات سلبية على الضد أغفل موقف قابل للتعديل بشكل صحيحر البوابات. هذه الضوابط هي ذات أهمية خاصة عند مستويات التعبير منخفضة أو عند فصل السكان المستهدفين من الفقراء (على سبيل المثال، عندما يكون الهدف هو خلوى أو عامل النسخ). وإن لم يكن ذلك ضروريا دائما، في بعض الحالات، والضوابط نمط إسوي قد يكون من المفضل في مكان تسيطر FMO لأنها توفر التعويض المناسب لنمط إسوي الأجسام المضادة والمترافقة fluorophore دون خصوصية للمستضد. - إعداد البوابة الرئيسية: ضبط الأمام مبعثر المنطقة (FSC-A) والجانب مبعثر منطقة (SSC-A) الجهد من أجل الكشف عن السكان الكريات البيض.
- استبعاد الخلايا الميتة.
ملاحظة: وصمة عار الجدوى يتفاعل مع الأمينات الحرة الموجودة على كل سطح وداخل الخلايا. وعلى النقيض من العيش الخلايا والخلايا الميتة (مع الأغشية خطر) تسمح للصبغ للدخول في السيتوبلازم، وزيادة كمية من وضع العلامات البروتين. وهكذا، فإن الخلايا الميتة يكون أكثر إشراقا من الخلايا الحية مما يتيح التمييز سهلا. بوابة على الهواء مباشرةالخلايا.
ملاحظة: صلاحية تعليق خلية من الشريان الأورطي والكلى قد يكون أقل من صلاحية تعليق خلية من الغدد الليمفاوية ويرجع ذلك إلى خطوة عملية الهضم إضافية. - مؤامرة الأمام مبعثر المنطقة (FSC-A) [ص المحور] وإلى الأمام مبعثر الطول (FSC-H) [محور س]. تظهر SINGLETS كما قطري على هذه مؤامرة نقطة. البوابة على هذا قطري لاستبعاد الحلل. ثم رسم SSC-A [العمودي] وCD45 [محور س].
- وCD45 + الكريات البيض السكان يمكن التعرف عليها بسهولة. البوابة على هذه الفئة من السكان. يمكن التعرف على السكان لاحق من هذه الفئة من السكان.
- تشغيل أنابيب التحكم الملون غير ملوثين واحدة للحصول على تعويضات لضبط التداخل الطيفي.
- تطبيع عدد الخلايا
- عد حبات لها خصائص التي تؤدي إلى انخفاض SSC FSC وعالية. على سبيل المثال، إذا تم إضافة 50،000 الخرز في 300 ميكرولتر من تعليق خلية واحدة، المعادلة لحساب عدد المطلق لأي تعطي نوع من الخلايا في الأنبوب هو على النحو التالي:
عدد الخلايا صأنبوب إيه = (50000 / عدد حبات تحسب من قياس التدفق الخلوي) × عدد الخلايا فرزها.
باستخدام هذا الحساب، يمكن تحديد العدد المطلق من أي نوع خلية معينة في أنبوب. واستنادا إلى كم من الانابيب تم إنشاؤها من كل جهاز، ويمكن حساب عدد الخلايا في الجهاز.
ملاحظة: احفظ جميع الخلايا والكواشف في 4 درجات مئوية خلال البروتوكول. تجنب vortexing لقوي لأنها يمكن أن تتلف الخلايا. استخدام الحد الأدنى من القوات لخلايا بيليه. تجنب الوقوع في فقاعات في أنبوب FACS لأنها يمكن أن تتسبب في موت الخلايا. لا تدع الكريات تجف في أي وقت.
- عد حبات لها خصائص التي تؤدي إلى انخفاض SSC FSC وعالية. على سبيل المثال، إذا تم إضافة 50،000 الخرز في 300 ميكرولتر من تعليق خلية واحدة، المعادلة لحساب عدد المطلق لأي تعطي نوع من الخلايا في الأنبوب هو على النحو التالي:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وصف بروتوكول تصاريح تحديد سطح وداخل الخلايا علامات في الخلايا التائية معزولة عن الكلى الفئران، الشريان الأورطي والشريان الأبهر تصريف الغدد الليمفاوية في نموذج للأنجيوتنسين الثاني وارتفاع ضغط الدم الناجم. يتم عرض نتائج ممثل أدناه.
يوضح الشكل (1) استراتيجية النابضة تستخدم لتحديد السكان الخلايا التائية في تعليق خلية واحدة أعدت من الشريان الأورطي على الفأرة WT يملؤه أنجيوتنسين الثاني للحث على ارتفاع ضغط الدم. ويستخدم استراتيجية مماثلة في الكلى والغدد الليمفاوية. مبعثر منطقة إلى الأمام (FSC-A) والجانب مبعثر منطقة (SSC-A) الجهد تم تعديلها إلى كشف السكان الكريات البيض (G1) واستبعاد الحطام. الخلايا الحية (G2) هي السلبية للعلامة الجدوى مترافق مع الأزرق المحيط الهادئ. ثم تم بوابات الخلايا الحية في الأمام مبعثر الطول (FSC-H) وإلى الأمام مبعثر المنطقة (FSC-A) إلى البوابة فقط علىالسكان القميص (G3). ثم تم اختيار الكريات البيض التي تبوب على SSC-A و CD45 (G4). ومترافق مع CD45 AmCyan في هذا المثال. وأخيرا، هي بوابات الخلايا T والسكان CD45 + CD3 + (G5). ومترافق مع CD3 PerCP-Cy5.5 في هذا المثال.
لتحديد وجود IL-17A و IL-17F إنتاج خلايا T في الكلى الفئران والشريان الأورطي في هذا النموذج، كانت ملطخة تعليق خلية واحدة لIL-17A و IL-17F. ويوضح الشكل 2 مضان ناقص الضوابط واحد (FMOs) لIL-17A وتلطيخ IL-17F في عينة الكلى (مترافق مع FITC وAPC، على التوالي). ضوابط FMO هي العينات التي تحتوي على جميع الأجسام المضادة في لوحة باستثناء واحد. كما هو متوقع، عدد قليل جدا من الخلايا إيجابية لIL-17A (الشكل 2A) أو IL-17F (الشكل 2B) في ضوابط FMO. تسمح هذه الضوابط التمييز الدقيق للاشارات ايجابية مقابل سلبية على صفة صحيحأوست البوابات لتحديد الخلايا إيجابية لIL-17A أو IL-17F في العينات التجريبية.
ويبين الشكل 3 مثالا للتلطيخ الخلايا من خلايا تي المعزولة من الكلى (الشكل 3A) والشريان الأبهر (الشكل 3B) من الفئران WT غرست مع سيارة (شام) أو أنجيوتنسين الثاني (آنغ الثاني). في الواقع، يمكن أن يتم الكشف عن مجموعة فرعية من الخلايا التائية التي تعبر عن IL-17A أو IL-17F في كل الأنسجة في هذا النموذج.
ويوضح الشكل 4 تلطيخ الخلايا من خلايا تي في تصريف الغدد الليمفاوية الأورطي في هذا النموذج (الشكل 4A). خلايا CD8 + T وبوابات أولا (الشكل 4B). ثم، والتعبير عن اثنين من علامات TC1، خلوى IFNγ أو عامل النسخ تي الرهان، وتم قياس كمية من خلية فرعية CD8 + T. ويوضح الشكل 4C في FMOs لIFN47؛ وتي الرهان تلطيخ في العينات العقدة الليمفاوية (مترافق مع FITC و PE-Cy7، على التوالي). ويبين الشكل 4D أنه في الشريان الأبهر تصريف الغدد الليمفاوية من الفئران WT يملؤه أنجيوتنسين الثاني، ويمكن تحديد عدد سكانها CD8 + IFNγ + و CD8 + T-رهان + الخلايا.
الشكل 1: التدفق الخلوي استراتيجية النابضة لتحديد الخلايا التائية. هي بوابات الكريات البيض لأول مرة على الأمام مبعثر مبعثر / الجانب (FSC-A / SSC-A) يتم اختيار نقطة مؤامرة (G1)، والخلايا الحية (G2). ثم هي بوابات الخلايا على singlets ل(FSC-A / FSC-H) (G3). وتتميز الخلايا من G3 مزيدا من التعبير عن CD45 (G4). وأخيرا، هي بوابات الخلايا التائية على CD45 + CD3 + الخلايا ايجابية مزدوجة (G5). وقد أعد هذا تعليق خلية واحدة من الشريان الأورطي كله معزولة من النوع البري (WT) الماوس يملؤه angiot ensin الثاني للحث على ارتفاع ضغط الدم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الإسفار ناقص واحد الضوابط (FMO) لIL-17A و IL-17F. (أ) كانت ملطخة تعليق خلية واحدة معزولة من أنجيوتنسين الثاني تعامل عينة الكلى الفئران باستخدام علامة يمكن حلها الجدوى (باسيفيك بلو)، CD45 (AmCyan)، CD3 (PerCP-Cy5.5) و IL-17F (APC). تم حذف الأجسام المضادة لIL-17A لتحديد النابضة المناسب لIL-17A. كان الملون (B) وتعليق خلية واحدة معزولة من أنجيوتنسين الثاني تعامل عينة الكلى الفئران باستخدام علامة يمكن حلها الجدوى (باسيفيك بلو)، CD45 (AmCyan)، CD3 (PerCP-Cy5.5) و IL-17A (FITC). في هذه الحالة، تم حذف الأجسام المضادة لIL-17F.urce.jove.com/files/ftp_upload/55266/55266fig2large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 3: تلطيخ الخلايا من خلايا تي المعزولة من الكلى الفئران والشريان الأورطي لIL-17A و IL-17F. التدفق الخلوي دوت المؤامرات تظهر IL-17A والتعبير IL-17F في الخلايا التائية من الكلى (A) والشريان الأورطي (ب) من الفئران WT غرست مع سيارة (شام) أو أنجيوتنسين الثاني (آنغ الثاني) وسبق بوابات على CD45 + CD3 + الخلايا. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تلطيخ الخلايا من الخلايا التائية ق معزولة عن الأبهر تصريف الغدد الليمفاوية الفئران. (A) المظاهر العيانية اثنين القطني الأبهر تصريف الغدد الليمفاوية في الماوس WT. (ب) تدفق الممثل الخلوي المؤامرات نقطة من CD4 + والخلايا CD8 + T معزولة عن أربعة العقد الليمفاوية استنزاف الأورطي معزولة عن ماوس WT يملؤه أنجيوتنسين الثاني وسبق بوابات على CD45 + CD3 + الخلايا. (ج) وكانت ملطخة تعليق خلية واحدة معزولة من الغدد الليمفاوية باستخدام علامة الجدوى (باسيفيك بلو)، CD3 (PerCP-Cy5.5)، CD4 (APC-Cy7)، وCD8 (APC). ويبين الضوابط FMO التي تم حذف الأجسام المضادة لIFNγ (FITC) أو تي الرهان (PE-Cy7) لتحديد النابضة السليم. (D) التدفق الخلوي دوت المؤامرات يدل IFNγ إيجابي والتعبير تي الرهان داخل CD8 + العقدة الليمفاوية T الخلايا باستخدام البوابات التي تحددها ضوابط FMO.ز "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويدعم MSM عن طريق منحة من علوم القلب والأوعية الدموية جلعاد.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل على جائزة القلب الأمريكية جمعية زمالة (16POST29950007) إلى فلوريدا، منحة التدريب من المعاهد الوطنية للصحة (NIH T32 HL069765) إلى بناية، وهي جائزة جمعية زمالة القلب الأمريكية (14POST20420025) لMA صالح، والمعاهد الوطنية للصحة جائزة K08 (HL121671) لسوق مسقط. ويدعم MSM أيضا منحة بحثية من العلوم جلعاد، وشركة
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase D | ROCHE | 11088882001 | |
| Collagenase A | ROCHE | 10103586001 | |
| Collagenase B | ROCHE | 11088815001 | |
| Dnase | ROCHE | 10104159001 | |
| 1x Red blood cell lysis buffer | eBioscience | 00-4333-57 | |
| RPMI Medium 1614 1x | Gibco | 11835-030 | |
| DPBS without calcium and magnesium | Gibco | 14190-144 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-5445-02 | For density gradient centrifugation |
| GentleMACS™ C tube | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| GentleMACS dissociator device | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Use the program SPLEEN_04 |
| Cell activation cocktail (with Brefeldin A) | Biolegend | 423303 | |
| anti-CD16/32 | eBioscience | 14-0161-81 | dilute 1:100 |
| LIVE/DEAD fixable violet dead cell stain kit | Life Technologies | L34955 | |
| Transcription factor buffer set | BD Pharmingen | 562725 | |
| OneComp eBeads | eBioscience | 01-1111-42 | |
| 123 count eBeads | eBioscience | 01-1234-42 | |
| CD45 AmCyan (clone 30-F11) | BioLegend | 103138 | |
| CD3 PerCP-Cy5.5 (clone 17A2) | BioLegend | 100218 | |
| IL-17A FITC (clone TC11-18H10.1) | BioLegend | 506910 | |
| IL-17F APC (clone 9D3.1C8) | BioLegend | 517004 | |
| CD4 APC-Cy7 (clone GK1.5) | BD Biosciences | 560181 | |
| CD8 APC (clone 53-67) | eBioscience | 17-0081-82 | |
| T-bet PE-Cy7 (clone 4B10) | BioLegend | 644823 | |
| IFNγ FITC (clone XMG1.2) | BD Biosciences | 557724 |
References
- Saleh, M. A., McMaster, W. G., Wu, J., et al. Lymphocyte adaptor protein LNK deficiency exacerbates hypertension and end-organ inflammation. J Clin Invest. 125 (3), 1189-1202 (2015).
- Madhur, M. S., Lob, H. E., McCann, L. A., et al. Interleukin 17 promotes angiotensin II-induced hypertension and vascular dysfunction. Hypertension. 55 (2), 500-507 (2010).
- Laroumanie, F., Douin-Echinard, V., Pozzo, J., et al. CD4+ T Cells Promote the Transition From Hypertrophy to Heart Failure During Chronic Pressure Overload. Circulation. 129 (21), 2111-2124 (2014).
- Guzik, T. J., Hoch, N. E., Brown, K. A., et al. Role of the T cell in the genesis of angiotensin II induced hypertension and vascular dysfunction. J Exp Med. 204 (10), 2449-2460 (2007).
- Ketelhuth, D. F. J., Hansson, G. K. Adaptive Response of T and B Cells in Atherosclerosis. Circ Res. 118 (4), 668-678 (2016).
- McMaster, W. G., Kirabo, A., Madhur, M. S., Harrison, D. G. Inflammation, Immunity, and Hypertensive End-Organ Damage. Circ Res. (6), 1022-1033 (2015).
- Luckheeram, R. V., Zhou, R., Verma, A. D., et al. CD4+T Cells: Differentiation and Functions. Clin Dev Immunol. 2012, 1-12 (2012).
- Mittrücker, H. -W., Visekruna, A., Huber, M. Heterogeneity in the differentiation and function of CD8+ T cells. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 62 (6), 449-458 (2014).
- Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. Eur J Microbiol Immunol (Bp). 2 (2), 112-120 (2012).
- Finak, G., Langweiler, M., Jaimes, M., et al. Standardizing Flow Cytometry Immunophenotyping Analysis from the Human ImmunoPhenotyping Consortium. Sci Rep. 6, 20686 (2016).
- Herzenberg, L. A., Parks, D., Sahaf, B., Perez, O., Roederer, M., Herzenberg, L. A. The history and future of the fluorescence activated cell sorter and flow cytometry: a view from Stanford. Clin Chem. 48 (10), 1819-1827 (2002).
- Hrvatin, S., Deng, F., O'Donnell, C. W., Gifford, D. K., Melton, D. A. MARIS: method for analyzing RNA following intracellular sorting. PLoS One. 9 (3), 89459 (2014).
- Kalisky, T., Quake, S. R. Single-cell genomics. Nat Methods. 8 (4), 311-314 (2011).
- Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Cytometry: Today's technology and tomorrow's horizons. Methods. 57 (3), 251-258 (2012).
- Jiang, L., Tixeira, R., Caruso, S., et al. Monitoring the progression of cell death and the disassembly of dying cells by flow cytometry. Nat Protoc. 11 (4), 655-663 (2016).
- Lemoine, S., Jaron, B., Tabka, S., et al. Dectin-1 activation unlocks IL12A expression and reveals the TH1 potency of neonatal dendritic cells. J Allergy Clin Immunol. 136 (5), 1355-1368 (2015).
- Gaublomme, J. T., Yosef, N., Lee, Y., et al. Single-Cell Genomics Unveils Critical Regulators of Th17 Cell Pathogenicity. Cell. 163 (6), 1400-1412 (2015).
