Summary
Dit artikel bevat gedetailleerde methodologie voor het identificeren en kwantificeren van functionele T-lymfocyten subsets in muizen nieren, aorta en de lymfeklieren aanwezig door intracellulaire kleuring en flowcytometrie. Het model van angiotensine II geïnduceerde hypertensie werd gekozen uitleggen, stap voor stap, de procedures en de grondbeginselen van flowcytometrie en intracellulaire kleuring.
Introduction
Recent bewijs toont aan dat het adaptieve immuunsysteem, met name T-lymfocyten een cruciale rol spelen bij de ontwikkeling van verscheidene cardiovasculaire aandoeningen 1,2,3,4,5. Bijvoorbeeld, in het model van angiotensine II geïnduceerde hypertensie, een accumulatie van T-cellen in de bloedvaten en nieren van muizen is beschreven 6. De vasculaire accumulatie overwegend adventitia en de perivasculaire vet. In de nier T-cellen ophopen in zowel de medulla en renale cortex. Afhankelijk van welke subset betrokken, deze T-cellen geven aanleiding tot verschillende cytokines die invloed kunnen hebben vasculaire en renale functie en leiden tot de ontwikkeling van de pathologie (beoordeeld door McMaster et al. 6).
CD4 + T-helper lymfocyten kunnen worden onderverdeeld in verschillende subgroepen: T helper 1 (Th1), Th2, Th9, Th17, Th22, regulatoire T (Treg) cellen, folliculaire en T helper (Tfh) cellen op basis van hun functie en handtekening cytokines 7. Evenzo kunnen CD8 + cytotoxische T-cellen worden ingedeeld Tc1, Tc2, Tc17 of TC9 8. Er zijn ook een dubbele negatieve T-cellen (dwz cellen die de CD4 of CD8 T-cel markers tot expressie brengen). Een subgroep van deze cellen bezitten een alternatieve gamma delta T-celreceptor (in plaats van de klassieke alfa- en beta-receptoren) en derhalve als gamma delta T-cellen genoemd. Het multiparameter analyse met flowcytometrie van oppervlaktemerker, cytokine- en transcriptiefactor vormt de beste manier om deze cellen te identificeren. Hoewel deze methode op grote schaal wordt gebruikt op het gebied van de immunologie is het minder goed beschreven in vaste organen en bij de vaststelling van hart- en vaatziekten.
Historisch gezien is de identificatie van lymfocyten in weefsel beperkt tot immunohistochemie en RT-PCR benadering. Hoewel immunohistochemie en immunofluorescentie zijn krachtige methoden om de weefselverdeling van een antigeen int bepalenerest, ze zijn ontoereikend om de subsets betrokken fenotypisch identificeren. Bovendien, terwijl de RT-PCR is handig om mRNA expressie van antigenen, cytokinen of transcriptiefactoren sporen, het niet de detectie van meerdere eiwitten gelijktijdig kunnen op het niveau van individuele cellen.
De komst van flowcytometrie, vooral in combinatie met intracellulaire kleuring cytokinen en transcriptiefactoren detecteren, geeft onderzoekers een krachtige techniek die de identificatie en kwantificering toelaten aan de enkele cel niveau van immuuncelsubklassen in vaste organen. We hebben een intracellulaire kleuring assay te bepalen met stroomcytometrie grote T cel subsets aanwezig in nieren van muizen, aorta en aorta drainerende lymfeklieren in een model van angiotensine II geïnduceerde hypertensie geoptimaliseerd. Optimalisering van elke stap: weefsel spijsvertering, ex vivo activering, permeabilisatie en oppervlak en intracellulaire kleuring leidt tot een zeer reproduceerbaar test die kan worden toegepast op andere cardiovasculaire en renale ziekte modellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Vanderbilt University Institutional Animal Care en gebruik Comite heeft de hierin beschreven procedures goedgekeurd. Muizen worden gehuisvest en verzorgd in overeenstemming met de Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren (National Academies Press. Herziene 2010).
1. Isolatie van de Aorta drainerende lymfeklieren, nieren en Aorta van Muizen
- Euthanaseren de muizen door CO 2 inhalatie. Spray de borst met 70% ethanol en voorzichtig de huid en de borstwand met een schaar om het hart bloot te openen.
- De vasculatuur perfuseren Voer een kleine incisie in het rechter atrium en gestaag injecteren tenminste 10 ml koude PBS (ongeveer 1 ml / sec) in de apex van de linker ventrikel met een 21 of 23 G naald. Perfuseren totdat alle organen hebben geblancheerd. Het hart blanches eerste. Blancheren van de lever aangeeft dat de perfusie goed is uitgevoerd.
- Met behulp van kleine tang en fijn schaar, voorzichtig weggesneden en trek de darmen,maag, milt, pancreas en lever beter visualiseren van de aorta.
Opmerking: Deze stap moet zeer nauwkeurig worden gedaan schade aan het maagdarmkanaal kan contaminatie veroorzaken. - Knip en verwijder elke long met een schaar. Spoel de borstholte met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met een naaldloze injectiespuit. Verwijder overtollig bloed en vocht met behulp van een steriel gaasje.
- Verwijder de abdominale aorta afvoerende lymfeknopen met behulp van fijne pincet ontleden. Zorg ervoor dat de capsule niet te scheuren. Verwijder het achtergebleven vet op het oppervlak van elk lymfeklier het ontleden tang. Knip de twee nieren met een fijne schaar.
- Ontleden de gehele aorta (thoracale en abdominale aorta) met fijne, gebogen schaar. Vanaf het niveau van het hart en voorzichtig ontleden weg van de slokdarm en de wervels op het niveau van de iliacale bifurcatie zorg ervoor dat de omringende perivasculaire vet aan de aorta te houden.
OPMERKING: Verdere dissectie van de aorta Remove omgevende structuren kan onder een microscoop. Concreet verwijderen arteriële takken (halsslagaders, subclavian slagaders, coeliakie, mesenterische en nierslagaders) en de lymfeklieren. Hou een consistente laag perivasculaire vet rond elke aorta omdat dit een plaats waar veel ontstekingscellen bevinden zich in de omgeving van hypertensie. Plaats elk weefsel in aparte buizen met koude PBS.
2. Genereren van suspensies van afzonderlijke cellen van elk weefsel
- de nieren
OPMERKING: De nier kan in een enkele celsuspensie worden gedissocieerd door het combineren van mechanische dissociatie plus enzymatische digestie.- Bereid de nier digestie door toevoeging van collagenase D (2 mg / ml) en DNase I (100 ug / ml) aan RPMI 1640 medium (aangevuld met 5% foetaal runderserum (FBS)). Bereid 10 ml per nier monster.
- Tang om de twee nieren over in een dissociatie buis die 10 ml nier verterenionenoplossing.
- Voer de mechanische dissociatie met een halfautomatisch dissociator volgens instructies van de fabrikant.
- Na mechanische dissociatie, maak de buis van het apparaat en het uitvoeren van de enzymatische spijsvertering. Incubeer de monsters gedurende 20 minuten bij 37 ° C onder continue rotatie. Stop onmiddellijk de enzymatische digestie door het toevoegen van koud RPMI 1640 medium aangevuld met 5% FBS.
- Breng de oplossing door pipetteren in een 50 ml conische buis na verfijning door een 40 urn zeef. Plagen de restmateriaal elkaar door op de plunjer van een 1 ml spuit. Pellet de cellen (500 xg, 8 min, 4 ° C).
- Resuspendeer de pellet in 3 ml 36% dichtheidsgradiënt centrifugatie media. Breng de suspensie over in een 15 ml conische buis. Zachtjes voeg 3 ml van 72% dichtheidsgradiëntcentrifugatie media onder de 3 ml 36% celsuspensie zonder enige onderbreking. Centrifuge (1000 xg zonder rem, 20 min, 4 ° C). </ Li>
- De immuuncellen wordt gevestigd op het grensvlak. Verwijder de bovenste laag met gelige celafval en breng het volume tot 15 ml met koud PBS. Goed schudden om afbraak het verloop. Draai de cellen (300 xg, 8 min, 4 ° C) en resuspendeer de pellet in 3 ml RPMI met 5% FBS. Tel het aantal levende cellen op een hemocytometer gebruikt trypan blauw exclusie.
- de aorta
- Bereid de aorta digestie door toevoeging van collagenase A (1 mg / ml), collagenase B (1 mg / ml) en DNase I (100 ug / ml) aan RPMI 1640 medium (aangevuld met 5% FBS).
- Gebruik fijne tang, overdracht van de aorta in een 2 ml buisje met 1 ml aorta ontsluitingsoplossing. Hak de hele aorta in heel kleine stukjes met fijne schaar in de 1 ml spijsvertering oplossing. Houd op het ijs. Incubeer de monsters gedurende 30 minuten bij 37 ° C onder continue rotatie.
- Breng de oplossing een weefselkweekplaat en stoppen enzymatic digestie door het toevoegen van 5 keer het volume koud RPMI met 5% FBS.
- Breng de oplossing door pipetteren in een 50 ml conische buis na verfijning door een 40 urn zeef. Plagen de resterende weefsel uiteen in een enkele celsuspensie door op de plunjer van een 1 ml spuit. Spoel de zeef en pellet de cellen (300 xg, 8 min, 4 ° C).
- Was de pellet door het toevoegen van 10 ml van RPMI met 5% FBS. Draai de cellen (300 xg, 8 min, 4 ° C) en resuspendeer de pellet in 3 ml RPMI met 5% FBS. Tel het aantal levende cellen op een hemocytometer gebruikt trypan blauw exclusie.
- De aorta drainerende lymfeklieren
- Plaats een 40 urn zeef in een weefselkweek schotel (60 mm x 15 mm). Plaats de lymfeklieren op de zeef en plagen uit elkaar in een enkele celsuspensie door op de plunjer van een 1 ml spuit. Spoel het filter met 2 ml RPMI met 5% FBS. Verzamel de cellen in de schaal.
- Overdrachtde cellen in een 15 ml falcon buis en pellet de cellen (300 xg, 8 min, 4 ° C). Resuspendeer de pellet in 500 pl RPMI met 5% FBS. Tel het aantal levende cellen op een hemocytometer gebruikt trypan blauw exclusie.
3. Ex Vivo stimulatie voor Cytokine Detectie door flowcytometrie
- Bereid de celkweekmedia: RPMI met 5% FBS, 0,1 mM niet-essentiële aminozuren, 50 uM β-mercaptoethanol en 1% penicilline / streptomycine.
- Centrifugeer elke celsuspensie verkregen uit de nieren, aorta en lymfklieren (300 xg, 8 min, 4 ° C). Resuspendeer elk pellet met celkweekmedium bij een concentratie van 1 x 10 6 cellen per ml.
- Stimuleer cellen door toevoeging van 2 pi van de celactivering cocktail (die Phorbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA), calcium ionofoor ionomycine, en het Golgi remmer Brefeldine A) per 1 ml celkweek.
LET OP: De uiteindelijke concentraties van elk bestanddeel: 81 nM PMA, 1,33 uM ionomycine en 5 ug / ml Brefeldine A. behandeling met PMA en ionomycine activeert cellen om cytokinen te produceren. Cytokinen zijn uitgescheiden eiwitten die worden gevangen in de cellen te detecteren. Brefeldine A veroorzaakt de accumulatie van normaal uitgescheiden eiwitten in het endoplasmatisch reticulum en Golgi-apparaat. Dus de hier beschreven techniek verhoogt de detecteerbaarheid van cytokine-producerende lymfocyten door flowcytometrie. - Plaat 1-2.000.000 cellen in een 12 putjes (aorta of nier) of 24 putjes (lymfeklier) lage hechting platen. Plaats de plaat in een 37 ° C bevochtigde CO2 incubator gedurende 3 uur.
LET OP: Het aantal vergulde cellen kan lager in de lymfklieren zijn van controle muizen. Ook de tijd van de stimulatie moet empirisch worden bepaald voor elke celpopulatie en cytokine bestudeerd. Bij T-cellen geïsoleerd uit aorta, nier en lymfeknopen, raden wij stimulerend voor 3-4 uur. Een langere stimulatie wziek niet toeneemt cytokine secretie en een verdere neerwaartse regulatie van verschillende T cel oppervlakte markers zoals CD3, CD4 en CD8 induceren. (Merk op dat zelfs een 3-4 hr stimulatie sommige downregulatie van deze markers zal leiden.)
4. Surface kleuring
- Breng de cellen in een FACS polystyreen buis en gecentrifugeerd (300 xg, 8 min, 4 ° C). Was de cellen tweemaal met FACS-buffer (Ca + en Mg2 + vrij PBS met 4% FBS en 2 mM EDTA) en verdeel de celsuspensie even in verschillende FACS buisjes basis van het aantal gewenste antilichaam panelen en het aantal controlebuizen nodig ( zie hieronder).
- Om compensatie voor elk paneel uit te voeren, voor te bereiden ongekleurd controle buizen en enkele lood buizen voor elk type weefsel en antilichaam panel. Breng in fluorescentie min één (FMO) controlebuizen voor elk antilichaam panel door toevoeging na alle van de antilichamen.
- Regel het volume van elke buis tot 2 ml met FACSBuffer. Centrifugeer de celsuspensie (300 xg, 8 min, 4 ° C), de bovenstaande vloeistof en blok Fc receptoren door incuberen van de cellen met 0,5 ug anti-CD16 / CD32 antilichamen per miljoen cellen gedurende 10 min op ijs.
LET OP: CD16 is lage affiniteit IgG-Fc receptor III (FcR III) en CD32 is FcR II. CD16 / CD32 zijn tot expressie gebracht op granulocyten, mestcellen, monocyten / macrofagen, natural killer-cellen, B-cellen, dendritische cellen en aantal geactiveerde rijpe T-cellen. - Uitvoeren levensvatbaarheid kleuring: Was de cellen met 1x PBS, gecentrifugeerd (300 xg, 8 min, 4 ° C) en resuspendeer in 1000 pl 1x PBS. Voeg 1 ul van een cel-impermeant amine-reactieve kleurstof (levensvatbaarheid kleuring). Incubeer gedurende 15 minuten bij 4 ° C beschermd tegen licht.
- Tijdens de incubatie bereiden cocktail van antilichamen (voor oppervlakte kleuring) in een geschikt volume van FACS buffer. Was de cellen tweemaal met 1-2 ml FACS buffer, gecentrifugeerd (300 xg, 8 min, 4 ° C) en resuspendeer elke pellet met 100 ulvan het antilichaam mengsel. Incubeer gedurende 30 minuten bij 4 ° C beschermd tegen licht.
Opmerking: Voor elke flowcytometrie antilichaam, is het nuttig om de optimale hoeveelheid antilichaam die nodig door het uitvoeren van een dosistitratie ijkcurve wordt. - Was de cellen tweemaal met 2 ml FACS buffer en pellet de cellen (300 xg, 8 min, 4 ° C).
5. Fixatie, Permeabilisatie en intracellulaire kleuring
- Voer de intracellulaire kleuring met een fixatie en permeabilisatie kit bevattende geschikte buffers volgens de instructies van de fabrikant. Fix en permeabilize de cellen door te resuspenderen in de geschikte buffer. Incubeer monsters gedurende 40 min bij 4 ° C beschermd tegen licht.
- Voeg 1 ml van 1x permeabilisatie en was direct buffer op de vaste en gepermeabiliseerde cellen. Centrifuge (500 xg, 8 min, 4 ° C) en verwijder het supernatant. Resuspendeer de pellet met 2 ml 1x wasbuffer.
- Bereid de mengsels van ANTIBOdies (alleen voor intracellulaire kleuring) in een zodanige hoeveelheid van 1 x wasbuffer (meestal 100 ui per buisje).
Opmerking: Zoals hierboven beschreven, de optimale antilichaamconcentratie moet worden bepaald voor elk antilichaam in het paneel. Bijvoorbeeld voor antilichamen tegen IL-17A of IL-17F, maken we gebruik van een verdunningsfactor van 1:30, maar voor antilichamen tegen IFNy en T-bet, maken we gebruik van een verdunningsfactor van 1: 100. - Centrifugeer de cellen (500 xg, 8 min, 4 ° C) en resuspendeer elke pellet met 100 ul van het antilichaam mengsel. Incubeer gedurende 40 minuten bij 4 ° C beschermd tegen licht.
- Was de cellen tweemaal met 2 ml van 1 x wasbuffer en pellet de cellen (500 xg, 8 min, 4 ° C). Resuspendeer de pellet met 300 ul 1x wasbuffer en te analyseren op een flowcytometer met de nodige filters.
- Voor kwantificering van het totaal aantal cellen per weefselmonster Gebruik tellen van kralen. Voorafgaand aan de overname, voeg de aanbevolen hoeveelheid / aantal tellen kralen aan elke buis.
6. Compensatie, Gating, Normalisatie, en tips
- Compensatie en gating
- Run ongekleurde en single-lood controle buizen voor compensatie aan te passen voor de spectrale overlap.
Opmerking: Het gebruik van compensatie kralen plaats celgebaseerde compensatie controles noodzakelijk wanneer het antigeen van belang of celpopulatie in een monster aanwezig bij zulke lage niveaus dat compensatie middels cellen moeilijk is. Ook belangrijk bij het gebruik van tandem kleurstoffen, is het raadzaam om compensatie voor elk experiment Voorbereiden tandem kleurstoffen verschillen van batch tot batch en elke dag. - Run fluorescentie min één controles (PWV's) voor alle fluoroforen in het paneel bij het starten van een nieuwe multicolor experiment.
OPMERKING: De FMO controles zijn voorbeelden die de antilichamen in het paneel op één bevatten. Deze controles mogelijk nauwkeurige discriminatie van positieve versus negatieve signalen voor de weggelaten antilichaam om goed de rt de poorten. Deze controles zijn bijzonder belangrijk wanneer de expressieniveaus laag of wanneer de scheiding van de doelgroep arm (bijvoorbeeld wanneer het doel een cytokine of transcriptiefactor). Hoewel niet altijd noodzakelijk, in sommige gevallen, isotype controles kan de voorkeur in plaats van FMO controleert aangezien zij adequate compensatie voor het antilichaam isotype en fluorofoor conjugaat zonder de specificiteit van de antigeen. - Stel de primaire poort passen Forward Scatter Area (FSC-A) en zijwaartse verstrooiing Area (SSC-A) spanning om de leukocytpopulatie detecteren.
- Sluit de dode cellen.
OPMERKING: De levensvatbaarheid vlek reageert met aanwezig op zowel het oppervlak als het inwendige van cellen vrije aminen. In tegenstelling tot levende cellen, dode cellen (met gecompromitteerde membranen) kan de kleurstof in het cytoplasma te voeren, waardoor de hoeveelheid eiwit labeling. Zo zal dode cellen helderder dan levende cellen zodat u gemakkelijk discriminatie. Poort op de livecellen.
OPMERKING: De levensvatbaarheid van de celsuspensies van de aorta en de nieren kan lager zijn dan de levensvatbaarheid van de cel suspensies uit de lymfeklieren door de extra ontsluitingsstap. - Plot Forward Scatter Area (FSC-A) [y-as] en Forward Scatter Hoogte (FSC-H) [x-as]. Singlets verschijnen als een diagonaal op deze dot plot. Gate op deze diagonaal wambuizen uit te sluiten. Vervolgens brengen SSC-A [y-as] en CD45 [x-as].
- De CD45 + leukocytpopulatie kunnen gemakkelijk worden geïdentificeerd. Gate aan deze populatie. Daaropvolgende populaties kunnen worden geïdentificeerd uit deze populatie.
- Run ongekleurde en single-lood controle buizen voor compensatie aan te passen voor de spectrale overlap.
- Normalisering van het bloedbeeld
- Het tellen van kralen hebben eigenschappen die resulteren in een lage FSC en hoge SSC. Als bijvoorbeeld 50.000 parels worden toegevoegd aan 300 pl van de enkelvoudige celsuspensie, de vergelijking voor het berekenen van het absolute aantal van elke geven celtype per buis is als volgt:
Aantal cellen pER buis = (50.000 / aantal kralen geteld door de flowcytometer) x aantal cellen geteld.
Met behulp van deze berekening, kan het absolute aantal van een bepaald celtype per buis worden bepaald. Gebaseerd op het aantal buizen werden gegenereerd uit elk orgaan, kan het aantal cellen per orgaan worden berekend.
LET OP: Houd alle cellen en reagentia bij 4 ° C tijdens het protocol. Vermijd krachtig vortexen, omdat het cellen kunnen beschadigen. Met minimale krachten om de cellen te pelleteren. Vermijd het maken van bellen in het FACS buis omdat het celdood kan neerslaan. Laat de korrels drogen op elk moment.
- Het tellen van kralen hebben eigenschappen die resulteren in een lage FSC en hoge SSC. Als bijvoorbeeld 50.000 parels worden toegevoegd aan 300 pl van de enkelvoudige celsuspensie, de vergelijking voor het berekenen van het absolute aantal van elke geven celtype per buis is als volgt:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het protocol beschreven maakt de identificatie van oppervlakte- en intracellulaire merkers in T-cellen geïsoleerd uit muizen nieren, aorta en aorta drainerende lymfeklieren in een model van angiotensine II geïnduceerde hypertensie. Representatieve resultaten worden hieronder weergegeven.
Figuur 1 toont de gating strategie gebruikt om de T-cel populatie in slechts één enkele celsuspensie bereid uit de aorta van een WT muis doordrenkt met angiotensine II hypertensie veroorzaken. Een vergelijkbare strategie wordt gebruikt in de nier en lymfeknopen. Het Forward Scatter Area (FSC-A) en zijwaartse verstrooiing Area (SSC-A) voltage werd ingesteld op de leukocytpopulatie (G1) detecteren en vuil sluiten. De levende cellen (G2) zijn negatief voor de levensvatbaarheid marker geconjugeerd met Pacific blauw. Levende cellen werden vervolgens gesloten op Forward Scatter Hoogte (FSC-H) en Forward Scatter Area (FSC-A) tot poort alleen op desinglet populatie (G3). Leukocyten werden daarna geselecteerd door gating op SSC-A en CD45 (G4). CD45 geconjugeerd met AmCyan in dit voorbeeld. Tenslotte worden T-cellen gated als CD45 + CD3 + populatie (G5). CD3 is geconjugeerd met PerCP-Cy5.5 in dit voorbeeld.
Om de aanwezigheid van IL-17A en IL-17F producerende T-cellen in muizen nier- en aorta in dit model te bepalen werden enkele celsuspensies gekleurd voor IL-17A en IL-17F. Figuur 2 toont fluorescentie min één controle (PWV) voor IL-17A en IL-17F kleuring in een niermonster (geconjugeerd met FITC en APC, respectievelijk). FMO controles monsters die alle antilichamen in een panel op één bevatten. Zoals verwacht, zeer weinig cellen positief zijn voor IL-17A (Figuur 2A) of IL-17F (Figuur 2B) in de FMO controles. Deze controles mogelijk nauwkeurige discriminatie van positieve versus negatieve signalen naar behoren bnust de poorten van de cellen positief voor IL-17A en IL-17F in de experimentele monsters te identificeren.
Figuur 3 een voorbeeld van intracellulaire kleuring van T-cellen geïsoleerd uit de nier (figuur 3A) en aorta (figuur 3B) van WT-muizen toegediend met vehikel (Sham) of angiotensine II (Ang II). Inderdaad, kan een subset van T-cellen die IL-17A en IL-17F expressie gedetecteerd in zowel weefsels in dit model.
Figuur 4 toont de intracellulaire kleuring van T-cellen in de aorta afvoerende lymfeknopen in dit model (figuur 4A). CD8 + T-cellen werden eerst gesloten (figuur 4B). Vervolgens, de expressie van beide markers Tc1 de cytokine IFNy of transcriptiefactor T-bet, werden gekwantificeerd door de CD8 + T cel subsets. Figuur 4C illustreert het PWV voor IFN47; en T-bet kleuring in de lymfeknoop monsters (geconjugeerd met FITC en PE-Cy7, respectievelijk). Figuur 4D toont dat in de aorta drainerende lymfeknopen van WT-muizen toegediend met angiotensine II, een populatie van CD8 + IFNy + en CD8 + T-bet + cellen kunnen worden geïdentificeerd.
Figuur 1: Flowcytometrie gating strategie om T cellen te identificeren. Leukocyten eerste gated op een voorwaartse verstrooiing / zijwaartse verstrooiing (FSC-A / SSC-A) puntdiagram (G1) en levende cellen zijn geselecteerd (G2). De cellen worden vervolgens gesloten op singlets (FSC-A / FSC-H) (G3). Cellen uit G3 worden verder gekenmerkt door de expressie van CD45 (G4). Ten slotte worden T-cellen gated op CD45 + CD3 + dubbele positieve cellen (G5). Deze enkele celsuspensie werd bereid uit de gehele aorta geïsoleerd uit een wild type (WT) muizen toegediend met angiot ensin II hypertensie veroorzaken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Fluorescentie min één controles (FMO) voor IL-17A en IL-17F. (A) Een enkele celsuspensie geïsoleerd uit een angiotensine II behandelde muizen niermonster werd gekleurd met behulp van een fixeerbaar levensvatbaarheid marker (Pacific Blue), CD45 (AmCyan), CD3 (PerCP-Cy5.5) en IL-17F (APC). Het antilichaam voor IL-17A werd nagelaten de juiste gating voor IL-17A bepalen. (B) Een enkele celsuspensie geïsoleerd uit een angiotensine II behandelde muizen niermonster werd gekleurd met behulp van een fixeerbaar levensvatbaarheid marker (Pacific Blue), CD45 (AmCyan), CD3 (PerCP-Cy5.5) en IL-17A (FITC). In dit geval het antilichaam voor IL-17F werd weggelaten.urce.jove.com/files/ftp_upload/55266/55266fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Intracellulaire kleuring van T-cellen geïsoleerd uit muizen nier- en aorta voor IL-17A en IL-17F. Flowcytometrie dot plots tonen IL-17A en IL-17F expressie in T-cellen van de nier (A) en aorta (B) van WT-muizen toegediend met vehikel (Sham) of angiotensine II (Ang II) en voorheen gated op CD45 + CD3 + cellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Intracellulaire kleuring van T-cel s geïsoleerd uit muizen aorta drainerende lymfeknopen. (A) Macroscopische verschijningen van twee lumbale aorta afvoerende lymfeknopen in een WT muis. (B) Representatieve flowcytometrie puntdiagrammen van CD4 + en CD8 + T-cellen geïsoleerd uit vier aorta afvoerende lymfeknopen geïsoleerd uit een WT muis doordrenkt met angiotensine II en voorheen gated op CD45 + CD3 + cellen. (C) Een enkele celsuspensie geïsoleerd uit lymfeknopen werd gekleurd met een levensvatbaarheid marker (Pacific Blue), CD3 (PerCP-Cy5.5), CD4 (APC-Cy7) en CD8 (APC). FMO controles worden getoond waarin het antilichaam voor IFNy (FITC) of T-bet (PE-Cy7) werd nagelaten de juiste gating bepalen. (D) Flowcytometrie dot plots tonen positieve IFNy en T-bet expressie in CD8 + lymfeklier T-cellen met behulp van de poorten bepaald door de FMO controles.g "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
MSM wordt ondersteund door een subsidie van Gilead Cardiovascular Sciences.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door een American Heart Association Fellowship Award (16POST29950007) naar Florida, een opleiding subsidie van de National Institutes of Health (NIH T32 HL069765) naar BLD, een American Heart Association Fellowship Award (14POST20420025) naar MA Saleh, en een NIH K08 award (HL121671) naar MSM. MSM wordt ook ondersteund door een onderzoek subsidie van Gilead Sciences, Inc.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase D | ROCHE | 11088882001 | |
| Collagenase A | ROCHE | 10103586001 | |
| Collagenase B | ROCHE | 11088815001 | |
| Dnase | ROCHE | 10104159001 | |
| 1x Red blood cell lysis buffer | eBioscience | 00-4333-57 | |
| RPMI Medium 1614 1x | Gibco | 11835-030 | |
| DPBS without calcium and magnesium | Gibco | 14190-144 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-5445-02 | For density gradient centrifugation |
| GentleMACS™ C tube | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| GentleMACS dissociator device | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Use the program SPLEEN_04 |
| Cell activation cocktail (with Brefeldin A) | Biolegend | 423303 | |
| anti-CD16/32 | eBioscience | 14-0161-81 | dilute 1:100 |
| LIVE/DEAD fixable violet dead cell stain kit | Life Technologies | L34955 | |
| Transcription factor buffer set | BD Pharmingen | 562725 | |
| OneComp eBeads | eBioscience | 01-1111-42 | |
| 123 count eBeads | eBioscience | 01-1234-42 | |
| CD45 AmCyan (clone 30-F11) | BioLegend | 103138 | |
| CD3 PerCP-Cy5.5 (clone 17A2) | BioLegend | 100218 | |
| IL-17A FITC (clone TC11-18H10.1) | BioLegend | 506910 | |
| IL-17F APC (clone 9D3.1C8) | BioLegend | 517004 | |
| CD4 APC-Cy7 (clone GK1.5) | BD Biosciences | 560181 | |
| CD8 APC (clone 53-67) | eBioscience | 17-0081-82 | |
| T-bet PE-Cy7 (clone 4B10) | BioLegend | 644823 | |
| IFNγ FITC (clone XMG1.2) | BD Biosciences | 557724 |
References
- Saleh, M. A., McMaster, W. G., Wu, J., et al. Lymphocyte adaptor protein LNK deficiency exacerbates hypertension and end-organ inflammation. J Clin Invest. 125 (3), 1189-1202 (2015).
- Madhur, M. S., Lob, H. E., McCann, L. A., et al. Interleukin 17 promotes angiotensin II-induced hypertension and vascular dysfunction. Hypertension. 55 (2), 500-507 (2010).
- Laroumanie, F., Douin-Echinard, V., Pozzo, J., et al. CD4+ T Cells Promote the Transition From Hypertrophy to Heart Failure During Chronic Pressure Overload. Circulation. 129 (21), 2111-2124 (2014).
- Guzik, T. J., Hoch, N. E., Brown, K. A., et al. Role of the T cell in the genesis of angiotensin II induced hypertension and vascular dysfunction. J Exp Med. 204 (10), 2449-2460 (2007).
- Ketelhuth, D. F. J., Hansson, G. K. Adaptive Response of T and B Cells in Atherosclerosis. Circ Res. 118 (4), 668-678 (2016).
- McMaster, W. G., Kirabo, A., Madhur, M. S., Harrison, D. G. Inflammation, Immunity, and Hypertensive End-Organ Damage. Circ Res. (6), 1022-1033 (2015).
- Luckheeram, R. V., Zhou, R., Verma, A. D., et al. CD4+T Cells: Differentiation and Functions. Clin Dev Immunol. 2012, 1-12 (2012).
- Mittrücker, H. -W., Visekruna, A., Huber, M. Heterogeneity in the differentiation and function of CD8+ T cells. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 62 (6), 449-458 (2014).
- Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. Eur J Microbiol Immunol (Bp). 2 (2), 112-120 (2012).
- Finak, G., Langweiler, M., Jaimes, M., et al. Standardizing Flow Cytometry Immunophenotyping Analysis from the Human ImmunoPhenotyping Consortium. Sci Rep. 6, 20686 (2016).
- Herzenberg, L. A., Parks, D., Sahaf, B., Perez, O., Roederer, M., Herzenberg, L. A. The history and future of the fluorescence activated cell sorter and flow cytometry: a view from Stanford. Clin Chem. 48 (10), 1819-1827 (2002).
- Hrvatin, S., Deng, F., O'Donnell, C. W., Gifford, D. K., Melton, D. A. MARIS: method for analyzing RNA following intracellular sorting. PLoS One. 9 (3), 89459 (2014).
- Kalisky, T., Quake, S. R. Single-cell genomics. Nat Methods. 8 (4), 311-314 (2011).
- Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Cytometry: Today's technology and tomorrow's horizons. Methods. 57 (3), 251-258 (2012).
- Jiang, L., Tixeira, R., Caruso, S., et al. Monitoring the progression of cell death and the disassembly of dying cells by flow cytometry. Nat Protoc. 11 (4), 655-663 (2016).
- Lemoine, S., Jaron, B., Tabka, S., et al. Dectin-1 activation unlocks IL12A expression and reveals the TH1 potency of neonatal dendritic cells. J Allergy Clin Immunol. 136 (5), 1355-1368 (2015).
- Gaublomme, J. T., Yosef, N., Lee, Y., et al. Single-Cell Genomics Unveils Critical Regulators of Th17 Cell Pathogenicity. Cell. 163 (6), 1400-1412 (2015).
