Summary
Denne artikkelen gir detaljert metode for å identifisere og kvantifisere funksjonelle T lymfocytt undergrupper stede i murine nyre, aorta og lymfeknuter ved intracellulær farging og flowcytometri. Modellen av angiotensin II indusert hypertensjon ble valgt til å forklare, steg-for-steg, prosedyrer og grunnleggende prinsipper for flowcytometri og intracellulær farging.
Introduction
Nyere bevis viser at det adaptive immunsystemet, spesielt T-lymfocytter, spiller en avgjørende rolle i utviklingen av en rekke kardiovaskulære sykdommer 1,2,3,4,5. For eksempel, i modellen av angiotensin II-indusert hypertensjon, en akkumulering av T-celler i skip og nyrene hos mus er blitt beskrevet seks. Den vaskulære opphopning er hovedsakelig i adventitia og perivaskulær fett. I nyrene, T-celler akkumuleres i både medulla og nyrebarken. Avhengig av hvilken undergruppe er involvert, er disse T-cellene gir opphav til forskjellige cytokiner som kan påvirke vaskulær og nyrefunksjon og føre til utvikling av patologi (gjennomgått av McMaster et al. 6).
CD4 + T-hjelper-lymfocytter kan deles inn i flere undergrupper: T-hjelper 1 (Th1), Th2, Th9, Th17, Th22, T regulatoriske (treg) celler, og T-hjelper follikulær (TFH) celler basert på deres funksjoner og signatur cytomegaloviruskines 7. På samme måte kan CD8 + cytotoksiske T-celler kan klassifiseres som TC1, TC2, Tc17 eller TC9 8. Det er også doble negative T-celler (dvs. celler som ikke uttrykker CD4 eller CD8 T-cellemarkører). En undergruppe av disse cellene har en alternativ gamma delta T-celle-reseptor (i stedet for de klassiske alfa- og beta-reseptorer) og er derfor referert til som gamma delta T-celler. Den multiparametriske analyse ved flowcytometri av overflatemarkør, cytokin og transkripsjonsfaktor som utgjør den beste tilnærming for å identifisere disse celler. Selv om denne metoden er mye brukt innen immunologien, er det mindre godt beskrevet i faste organer og i innstillingen av kardiovaskulære sykdommer.
Historisk ble identifisering av lymfocytter i vev er begrenset til immunhistokjemi eller RT-PCR-metoder. Selv immunhistokjemi og immunfluorescens er kraftige metoder for å bestemme vevet distribusjon av et antigen av interest, de er utilstrekkelig for å fenotypisk identifisere undergrupper involvert. I tillegg, mens RT-PCR-analyse er nyttig for å detektere mRNA ekspresjon av antigener, cytokiner eller transkripsjonsfaktorer, det tillater ikke påvisning av multiple proteiner samtidig på nivået av individuelle celler.
Ankomsten av flowcytometri, spesielt kombinert med intracellulær farging for å påvise cytokiner og transkripsjonsfaktorer, gir etterforskere med en kraftfull teknikk som gjør identifisering og kvantifisering på celle nivå av immuncelle undergrupper i solide organer. Vi har optimalisert en intracellulær farging assay for å identifisere ved hjelp av strømningscytometri de store T-celle-undersett til stede i muse-nyre, aorta og aorta drenerende lymfeknuter i en modell av angiotensin II-indusert hypertensjon. Optimaliseringen av hvert trinn: vevsfordøyelse, ex vivo-aktivering, permeabiliseringen, og overflaten og intracellulære fargingsresultater i et høyt reproduser analyse som kan anvendes for andre kardiovaskulære og renale sykdomsmodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Vanderbilt University Institutional Animal Care og bruk komité har godkjent prosedyrene som er beskrevet her. Mus er plassert og omsorg i samsvar med Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr (National Academies Press. Revidert 2010).
1. Isolering av Aorta Drenering lymfeknuter, Nyre og Aorta fra Mus
- Avlive mus ved CO 2 innånding. Spray brystet med 70% etanol og nøye åpne huden og brystveggen med saks for å avsløre hjertet.
- For å perfuse vaskulaturen, utføre et lite snitt i den høyre atrium og jevnt injisere minst 10 ml kald PBS (ca. 1 ml / s) inn i toppen av venstre ventrikkel ved å bruke en 21 eller 23 G nål. Perfuse til alle organer har forvellet. Hjertet blanches først. Blanchering av leveren indikerer at perfusjon har blitt godt utført.
- Ved hjelp av små pinsett og fine sakser, forsiktig klippe bort og dra ut innvollene,mage, milt, bukspyttkjertel og leveren for å bedre visual aorta.
MERK: Dette trinnet må gjøres meget presist som skader på mage-tarmkanalen kan forårsake forurensning. - Klipp ut og fjerne hver lunge med saks. Skyll brysthulen med fosfatbufret saltvann (PBS) ved hjelp av en nålløs sprøyte. Fjern overflødig blod og væske ved hjelp av steril kompress.
- Fjern mage aorta drenering lymfeknuter med lekkert dissecting pinsett. Sørg for ikke å sprekke kapselen. Fjern det gjenværende fett på overflaten av hver lymfeknute med dissecting tang. Kutt ut begge nyrene med fin saks.
- Dissekere hele aorta (thorax og abdominal aorta) med fine, buede saks. Starter på nivået av hjertet og nøye dissekere bort fra spiserøret og ryggvirvlene ned til nivået for den iliac bifurkasjonen sørge for å holde den omgivende perivaskulær fett festet til aorta.
Merk: Ytterligere disseksjon av aorta til remove omkringliggende strukturer kan gjøres under et mikroskop. Spesielt fjerne arteriell grener (carotis, subclavia arterier, cøliaki, mesenteriale, og nyrearteriene) og lymfeknuter. Må holde en konsekvent lag av perivaskulær fett rundt hver aorta siden dette er et område der mange betennelsesceller bor i innstillingen av hypertensjon. Plasser hver vev i separate rør som inneholder kald PBS.
2. generasjon av enkelt celle utestengelse fra hver Tissue
- nyrene
MERK: nyre kan dissosiert til en enkelt cellesuspensjon ved å kombinere mekanisk dissosiasjon pluss enzymatisk fordøyelse.- Klargjør nyre fordøyelse oppløsningen ved tilsetning av kollagenase D (2 mg / ml) og DNase I (100 ug / ml) til RPMI 1640-medium (supplert med 5% føtalt bovint serum (FBS)). Forbered 10 ml per nyre prøve.
- Bruk pinsett til å overføre to nyrer til en dissosiasjon rør som inneholder 10 ml nyre fordøyeion-løsning.
- Utføre den mekaniske dissosiasjon ved hjelp av en semi-automatisert dissociator anordning i henhold til produsentens instruksjoner.
- Etter mekanisk dissosiasjon, løsne slangen fra apparatet og utføre den enzymatiske fordøyelsen. Prøvene inkuberes i 20 min ved 37 ° C under kontinuerlig rotasjon. Umiddelbart stoppe den enzymatiske fordøyelse ved tilsetning av kald RPMI 1640 medium supplementert med 5% FBS.
- Overfør løsningen ved pipettering inn i et 50 ml konisk rør etter filtrering gjennom et 40 um sil. Erte gjenværende vev fra hverandre ved å trykke med stempelet på en 1 ml sprøyte. Pellet cellene (500 xg, 8 min, 4 ºC).
- Resuspender pelleten i 3 ml av 36% densitetsgradientsentrifugering media. Overfør suspensjonen inn i et 15 ml konisk rør. Tilsett 3 ml 72% Densitetsgradientsentrifugering media under 3 ml 36% cellesuspensjon uten avbrudd. Sentrifuge (1000 xg uten brems, 20 min, 4 ° C). </ Li>
- Immunceller vil bli lokalisert ved grenseflaten. Fjern det øverste gulaktig lag som inneholder cellerester og deretter bringe volumet opp til 15 ml ved hjelp av kald PBS. Rist godt for å sammenbrudd graderingen. Spinn-celler (300 xg, 8 min, 4 ° C) og resuspender pelleten i 3 ml RPMI med 5% FBS. Telle antall levende celler på et hemocytometer hjelp trypanblått eksklusjon.
- aorta
- Klargjør aorta fordøyelse oppløsningen ved tilsetning av kollagenase A (1 mg / ml), kollagenase B (1 mg / ml) og DNase I (100 ug / ml) til RPMI 1640-medium (supplert med 5% FBS).
- Bruke fin pinsett, overføre aorta i en 2 ml tube inneholder 1 ml av aorta fordøyelsen løsning. Finhakk hele aorta i svært små biter med fin saks i en ml fordøyelsen løsning. Hold på is. Prøvene inkuberes i 30 minutter ved 37 ° C under kontinuerlig rotasjon.
- Overfør løsningen på en vev kultur tallerken og stoppe enzymatic fordøyelse ved tilsetning av 5 ganger volumet av kald RPMI med 5% FBS.
- Overfør løsningen ved pipettering inn i et 50 ml konisk rør etter filtrering gjennom et 40 um sil. Erte gjenværende vev fra hverandre i en enkelt cellesuspensjon ved pressing med stempelet på en 1 ml sprøyte. Skyll silen og pellet cellene (300 xg, 8 min, 4 ºC).
- Vask pelleten ved tilsetning av 10 ml RPMI med 5% FBS. Spinn-celler (300 xg, 8 min, 4 ° C) og resuspender pelleten i 3 ml RPMI med 5% FBS. Telle antall levende celler på et hemocytometer hjelp trypanblått eksklusjon.
- Aorta drenering lymfeknuter
- Plasser en 40 mikrometer sil i en vev kultur tallerken (60 mm x 15 mm). Plasser lymfeknuter på silen og erte dem fra hverandre til en enkelt cellesuspensjon ved å trykke med stempelet på en 1 ml sprøyte. Skyll silen med 2 ml RPMI med 5% FBS. Samle cellene i retten.
- Overførecellene i en 15 ml falk rør og pellet cellene (300 xg, 8 min, 4 ºC). Resuspender pelleten i 500 ul av RPMI med 5% FBS. Telle antall levende celler på et hemocytometer hjelp trypanblått eksklusjon.
3. Ex Vivo stimulering for Cytokin Detection ved flowcytometri
- Fremstille cellevekstmedium: RPMI med 5% FBS, 0,1 mM ikke-essensielle aminosyrer, 50 uM β-merkaptoetanol og 1% penicillin / streptomycin.
- Sentrifuger hver cellesuspensjon erholdt fra nyre, aorta og lymfeknuter (300 xg, 8 min, 4 ° C). Resuspender hver pellet med cellekulturmedium ved en konsentrasjon på 1 x 10 6 celler pr ml.
- Stimulere celler ved å tilsette 2 ul av celleaktivering cocktail (inneholdende Phorbol-12-myristat 13-acetat (PMA), kalsium ionofor ionomycin, og Golgi-inhibitoren Brefeldin A) for hver 1 ml av cellekultur.
MERK: Den endelige konsentrasjonens av hver komponent er: 81 nM PMA, 1,33 uM ionomycin og 5 ug / ml av Brefeldin A. Behandling med PMA og ionomycin aktiverer cellene til å produsere cytokiner. Cytokiner er utskilte proteiner som må være fanget i cellene som skal påvises. Brefeldin A forårsaker akkumulering av normalt utskilte proteiner i det endoplasmatiske retikulum og Golgi-apparatet. Således kan teknikken beskrevet her forbedrer detekterbarheten av cytokin-produserende lymfocytter ved strømningscytometri. - Plate 1 til 2 millioner celler i en 12-brønn (aorta eller nyre) eller 24-brønn (lymfeknute) lav etterlevelse plater. Sett platen i en 37 ° C fuktet CO2-inkubator i 3 timer.
MERK: Antallet belagt celler kan være lavere i lymfeknuter fra kontroll mus. I tillegg har tiden for stimulering som skal bestemmes empirisk for hver cellepopulasjon og cytokin studert. I tilfelle av T-celler isolert fra aorta, nyre eller lymfeknuter, anbefaler vi stimulerende i 3 til 4 timer. En lengre stimulering will ikke øker cytokinsekresjon og vil indusere en ytterligere nedregulering av flere T-celleoverflatemarkører som CD3, CD4 og CD8. (Merk at selv en 3-4 timers stimulering vil forårsake noen nedregulering av disse markørene.)
4. Surface Farging
- Overfør cellene inn i en polystyren FACS rør og sentrifuge (300 xg, 8 min, 4 ° C). Vask cellene to ganger med FACS-buffer (Ca2 + og Mg + fritt PBS inneholdende 4% FBS og 2 mM EDTA) og dele cellesuspensjonen jevnt i forskjellige FACS-rør basert på antall antistoffpaneler ønsket og antallet kontrollrørene som trengs ( se nedenfor).
- For å utføre kompensasjon for hvert panel, forberede ufargede kontrollrørene og single farget rør for hver vevstype og antistoff panel. I tillegg forberede fluorescens minus én (FMO) kontroll rør for hvert antistoff panel ved å legge alle unntatt én av de antistoffer.
- Juster volumet på hvert rør til 2 ml med FACSBuffer. Sentrifuger cellesuspensjonen (300 xg, 8 min, 4 ° C), fjern supernatanten og blokkere Fc-reseptorer ved å inkubere cellene med 0,5 ug av anti-CD16 / CD32-antistoffer per million celler i 10 minutter på is.
MERK: CD16 er lav affinitet IgG Fc reseptor III (FcR III) og CD32 er FcR II. CD16 / CD32 uttrykkes på granulocytter, mastceller, monocytter / makrofager, naturlige dreperceller, B-celler, dendrittiske celler og enkelte aktiverte modne T-celler. - Utføre levedyktighet farging: Vask cellene med 1 x PBS, sentrifuger (300 xg, 8 min, 4 ° C), og resuspenderes i 1000 pl av 1 x PBS. Tilsett 1 pl av en celle-impermeant amin-reaktive fargestoff (levedyktighet flekk). Inkuber i 15 minutter ved 4 ° C beskyttet mot lys.
- I løpet av inkubasjonen forberede cocktail av antistoffer (for overflatefarging) i et passende volum av FACS-buffer. Vask cellene to ganger med 1-2 ml FACS-buffer, sentrifuge (300 xg, 8 min, 4 ° C) og resuspender hver pellet med 100 ulav antistoffet blandingen. Inkuber i 30 min ved 4 ° C beskyttet mot lys.
NB: For hver strømningscytometri antistoff, er det nyttig å bestemme den optimale mengden av antistoff som er nødvendig ved å utføre en dose titreringskurven. - Vask cellene to ganger med 2 ml FACS-buffer og pelletere cellene (300 xg, 8 min, 4 ° C).
5. Fiksering, Permeabilization og Intracellulær Farging
- Utfør intracellulær farging med en fiksering og permeabilization kit inneholder nødvendige buffere ved å følge produsentens instruksjoner. Fix og permeabilisere cellene ved resuspendering av dem i den passende buffer. Inkuber prøvene i 40 min ved 4 ° C beskyttet mot lys.
- Tilsett 1 ml 1x permeabilization og vaske buffer direkte til de faste og permeabilized celler. Sentrifuge (500 xg, 8 min, 4 ° C) og fjerne supernatanten. Resuspender pellet med 2 ml 1x vaskebuffer.
- Forbered blandinger av Antibodies (for intracellulær farging only) i et passende volum av 1x vaskebuffer (vanligvis 100 mL per rør).
MERK: Som beskrevet ovenfor, må den optimale antistoffkonsentrasjonen må bestemmes for hvert antistoff i panelet. For eksempel, for antistoffer mot IL-17A eller IL-17F, bruker vi en fortynning faktor på 01:30, men for antistoffer mot IFNy og T-bet, bruker vi en fortynning faktor på 1: 100. - Sentrifuger cellene (500 xg, 8 min, 4 ° C) og resuspender hver pellet med 100 ul av den antistoffblandingen. Inkuber i 40 min ved 4 ° C beskyttet mot lys.
- Vask cellene to ganger med 2 ml av 1 x vaskebuffer, og pellet cellene (500 xg, 8 min, 4 ° C). Resuspender pellet med 300 ul av 1 x vaskebuffer, og analysere på et strømningscytometer med passende filtre.
- For kvantifisering av det totale antall celler pr vevsprøve bruke telle perler. Før oppkjøpet, legge det anbefalte volum / antall telle perler i hvert rør.
6. Godtgjørelse, begrensning, normalisering, og tips
- Kompensasjon og gating
- Kjør ufargede og enkelt farget kontroll rør for kompensasjon for å justere for spektral overlapp.
MERK: Bruken av kompensasjons kuler i stedet for cellebaserte kompensasjons kontroller er nødvendig i de tilfeller hvor antigenet av interesse eller celle-populasjonen i en prøve som er til stede i så lave nivåer som kompensasjon ved bruk av celler vil være vanskelig. Også verdt å merke, når du bruker tandem fargestoffer, er det lurt å forberede kompensasjon for hvert forsøk siden tandem fargestoffer varierer mye til lot og med hver dag. - Kjør fluorescens minus én kontroller (FMOs) for alle fluorophores i panelet når du starter en ny flerfarget eksperiment.
MERK: FMO kontrollene er prøver som inneholder alle antistoffer i panelet med unntak av én. Disse kontrollene tillate nøyaktig diskriminering av positive versus negative signaler for den utelatte antistoff til riktig adjust portene. Disse kontrollene er spesielt viktig når uttrykket nivåer er lave eller når separasjonen av målgruppen er dårlig (for eksempel når målet er et cytokin eller transkripsjonsfaktor). Selv om det ikke alltid er nødvendig, i noen tilfeller, isotype kontroller kan være foretrukket i stedet for FMO kontroller som de gir riktig kompensasjon for antistoff-isotypen og fluorofor konjugat uten spesifisiteten av antigenet. - Sett opp hovedporten: justere Forward Scatter Area (FSC-A) og sidespredning Area (SSC-A) spenning for å detektere leukocytter befolkningen.
- Ekskluder de døde cellene.
MERK: levedyktighet flekken reagerer med frie aminer er tilstede på både overflaten og det indre av cellene. I motsetning til levende celler, døde celler (med svekket membraner) tillate fargestoffet for å gå inn i cytoplasma, noe som øker mengden av protein merking. Dermed vil døde celler være lysere enn levende celler som gir enkel diskriminering. Gate på liveceller.
MERK: levedyktighet av cellesuspensjoner fra aorta og nyrene kan være lavere enn levedyktigheten av cellesuspensjoner fra lymfeknutene grunn av den ekstra fordøyelse trinn. - Plot Forward Scatter Area (FSC-A) [y-aksen] og Forward Scatter Høyde (FSC-H) [x-aksen]. Singlets vises som en diagonal på denne prikkplott. Gate på denne diagonal å utelukke dubletter. Deretter plotte SSC-A [y-akse] og CD45 [x-aksen].
- CD45 + leukocytter befolkning lett kan identifiseres. Gate på denne populasjonen. Påfølgende bestander kan identifiseres fra denne populasjonen.
- Kjør ufargede og enkelt farget kontroll rør for kompensasjon for å justere for spektral overlapp.
- Normalisering av celletall
- Telle perler har egenskaper som resulterer i lav FSC og høy SSC. Hvis for eksempel 50.000 perler ble tilsatt til 300 ul celle-suspensjon, ligningen for beregning av den absolutte antall av enhver gi celletype per rør er som følger:
Antall celler per tube = (50000 / antall kuler telles ved flowcytometer) x antall celler tellet.
Ved hjelp av denne beregning, kan det absolutte antall av en hvilken som helst gitt celletype per rør bestemmes. Basert på hvor mange rør ble samlet fra hvert organ, kan antallet av celler pr organ beregnes.
MERK: Hold alle celler og reagenser ved 4 ° C under protokollen. Unngå kraftig virvling fordi det kan skade celler. Bruk minimalt med krefter til pellet cellene. Unngå å lage bobler i FACS røret siden det kan utfelles celledød. Ikke la pellets tørke ut når som helst.
- Telle perler har egenskaper som resulterer i lav FSC og høy SSC. Hvis for eksempel 50.000 perler ble tilsatt til 300 ul celle-suspensjon, ligningen for beregning av den absolutte antall av enhver gi celletype per rør er som følger:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen er beskrevet tillater identifisering av overflate og intracellulære markører i T-celler isolert fra murine nyre, aorta og aorta drenerende lymfeknuter i en modell av angiotensin II-indusert hypertensjon. Representative resultater er presentert nedenfor.
Figur 1 viser portstyringsstrategien anvendt for å identifisere T-celle-populasjonen i en enkelt cellesuspensjon fremstilt fra aorta fra et WT mus infusert med angiotensin II for å indusere hypertensjon. En lignende strategi er anvendt i nyre og lymfeknuter. Den Forward Scatter Area (FSC-A) og sidespredning Area (SSC-A) spenning ble justert til å detektere leukocytter befolkningen (G1) og for å utelukke rusk. De levende celler (G2) er negativ for levedyktigheten markør konjugert med Pacific Blue. Levende celler ble deretter separert på Forward Scatter Høyde (FSC-H) og Forward Scatter Area (FSC-A) til gate bare påsing befolkningen (G3). Leukocytter ble så valgt av port på SSC-A og CD45 (G4). CD45 er konjugert med AmCyan i dette eksempel. Til slutt blir T-celler gated som CD45 + CD3 + populasjonen (G5). CD3 er konjugert med PerCP-Cy5.5 i dette eksempel.
For å bestemme nærvær av IL-17A og IL-17F produserende T-celler i løpet av murine nyre og aorta i denne modellen, ble enkeltcellesuspensjoner farget for IL-17A og IL-17F. Figur 2 viser fluorescens-minus en kontroller (FMOs) for IL-17A og IL-17F farging i en nyre prøve (konjugert med FITC og APC, henholdsvis). FMO kontrollene er prøver som inneholder alle antistoffer i et panel med unntak av én. Som forventet, svært få celler som er positive for IL-17A (figur 2A) eller IL-17F (Figur 2B) i FMO kontrollene. Disse kontrollene tillate nøyaktig diskriminering av positive versus negative signaler til riktig adjust portene for å identifisere cellene som var positive for IL-17A og IL-17F i de eksperimentelle prøver.
Figur 3 gir et eksempel på intracellulær farging av T-celler isolert fra nyre (figur 3A) og aorta (figur 3B) av WT mus infusert med bærer (Sham) eller angiotensin II (Ang II). Faktisk kan en undergruppe av T-celler som uttrykker IL-17A eller IL-17F påvises i begge vev i denne modellen.
Figur 4 illustrerer intracellulær farging av T-celler i aorta drenerende lymfeknuter i denne modellen (figur 4A). CD8 + T-celler ble først gated (figur 4B). Deretter uttrykk for to TC1 markører, cytokin IFNy eller transkripsjonsfaktor T-bet, ble kvantifisert fra CD8 + T-celle undergruppe. Figur 4C illustrerer FMOs for IFN47; og T-bet flekker i lymfeknuteprøver (konjugert med FITC og PE-Cy7, henholdsvis). Figur 4D viser at i aorta drenering lymfeknuter WT mus som oser av angiotensin II, kan en befolkning på CD8 + IFNy + og CD8 + T-bet + celler bli identifisert.
Figur 1: Strømningscytometri gating strategi for å identifisere T-celler. Leukocytter først inngjerdet på en forward scatter / side scatter (FSC-A / SSC-A) prikkplott (G1), og levende celler er valgt (G2). Cellene blir deretter separert på singletter (FSC-A / FSC-H) (G3). Celler fra G3 er videre kjennetegnet ved ekspresjon av CD45 (G4). Til slutt blir T-celler separert på CD45 + CD3 + doble positive celler (G5). Denne enkeltcellesuspensjon ble fremstilt fra hele aorta isolert fra en villtype (WT) mus infusert med angiot ensin II å indusere hypertensjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Fluorescens minus én kontroller (FMO) for IL-17A og IL-17F. (A) En enkelt cellesuspensjon isolert fra en angiotensin II-behandlede mus nyreprøve ble farget ved anvendelse av en festbar levedyktighet markør (Pacific Blue), CD45 (AmCyan), CD3 (PerCP-Cy5.5) og IL-17F (APC). Antistoffet for IL-17A ble utelatt for å bestemme riktig separasjon for IL-17A. (B) En enkelt cellesuspensjon isolert fra en angiotensin II-behandlede mus nyreprøve ble farget ved anvendelse av en festbar levedyktighet markør (Pacific Blue), CD45 (AmCyan), CD3 (PerCP-Cy5.5) og IL-17A (FITC). I dette tilfelle ble antistoffet til IL-17F utelatt.urce.jove.com/files/ftp_upload/55266/55266fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Intracellulær farging av T-celler isolert fra murine nyre og aorta for IL-17A og IL-17F. Flowcytometri dot plott som viser IL-17A og IL-17F-ekspresjon i T-celler fra nyrene (A) og aorta (B) fra WT mus infusert med bærer (Sham) eller angiotensin II (Ang II), og som tidligere gating på CD45 + CD3 + celler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Intracellulær farging av T-celle- s isolert fra murine aorta-drenerende lymfeknuter. (A) Makroskopiske opptredener av to kors aorta drenerende lymfeknuter i en WT mus. (B) Representant flowcytometri dot plots av CD4 + og CD8 + T-celler isolert fra fire aorta drenering lymfeknuter isolert fra en WT mus infused med angiotensin II og tidligere gating på CD45 + CD3 + celler. (C) En enkelt cellesuspensjon isolert fra lymfeknuter ble farget ved anvendelse av en markør levedyktighet (Pacific Blue), CD3 (PerCP-Cy5.5), CD4 (APC-Cy7), og CD8 (APC). FMO kontroller er vist hvor antistoffet for IFNy (FITC) eller T-bet (PE-Cy7) ble utelatt for å finne den riktige gating. (D) Flow cytometri dot tomter som viser positiv IFNy og T-bet uttrykk innenfor CD8 + lymfeknute T-celler ved hjelp av bestemmes av FMO kontroller porter.g "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
MSM er støttet av en bevilgning fra Gilead Hjerte- Sciences.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av en American Heart Association Fellowship Award (16POST29950007) til FL, en trening bevilgning fra National Institutes of Health (NIH T32 HL069765) til BLD, en American Heart Association Fellowship Award (14POST20420025) til MA Saleh, og en NIH K08 award (HL121671) til MSM. MSM er også støttet av en forskningsstipend fra Gilead Sciences, Inc.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase D | ROCHE | 11088882001 | |
| Collagenase A | ROCHE | 10103586001 | |
| Collagenase B | ROCHE | 11088815001 | |
| Dnase | ROCHE | 10104159001 | |
| 1x Red blood cell lysis buffer | eBioscience | 00-4333-57 | |
| RPMI Medium 1614 1x | Gibco | 11835-030 | |
| DPBS without calcium and magnesium | Gibco | 14190-144 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-5445-02 | For density gradient centrifugation |
| GentleMACS™ C tube | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| GentleMACS dissociator device | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Use the program SPLEEN_04 |
| Cell activation cocktail (with Brefeldin A) | Biolegend | 423303 | |
| anti-CD16/32 | eBioscience | 14-0161-81 | dilute 1:100 |
| LIVE/DEAD fixable violet dead cell stain kit | Life Technologies | L34955 | |
| Transcription factor buffer set | BD Pharmingen | 562725 | |
| OneComp eBeads | eBioscience | 01-1111-42 | |
| 123 count eBeads | eBioscience | 01-1234-42 | |
| CD45 AmCyan (clone 30-F11) | BioLegend | 103138 | |
| CD3 PerCP-Cy5.5 (clone 17A2) | BioLegend | 100218 | |
| IL-17A FITC (clone TC11-18H10.1) | BioLegend | 506910 | |
| IL-17F APC (clone 9D3.1C8) | BioLegend | 517004 | |
| CD4 APC-Cy7 (clone GK1.5) | BD Biosciences | 560181 | |
| CD8 APC (clone 53-67) | eBioscience | 17-0081-82 | |
| T-bet PE-Cy7 (clone 4B10) | BioLegend | 644823 | |
| IFNγ FITC (clone XMG1.2) | BD Biosciences | 557724 |
References
- Saleh, M. A., McMaster, W. G., Wu, J., et al. Lymphocyte adaptor protein LNK deficiency exacerbates hypertension and end-organ inflammation. J Clin Invest. 125 (3), 1189-1202 (2015).
- Madhur, M. S., Lob, H. E., McCann, L. A., et al. Interleukin 17 promotes angiotensin II-induced hypertension and vascular dysfunction. Hypertension. 55 (2), 500-507 (2010).
- Laroumanie, F., Douin-Echinard, V., Pozzo, J., et al. CD4+ T Cells Promote the Transition From Hypertrophy to Heart Failure During Chronic Pressure Overload. Circulation. 129 (21), 2111-2124 (2014).
- Guzik, T. J., Hoch, N. E., Brown, K. A., et al. Role of the T cell in the genesis of angiotensin II induced hypertension and vascular dysfunction. J Exp Med. 204 (10), 2449-2460 (2007).
- Ketelhuth, D. F. J., Hansson, G. K. Adaptive Response of T and B Cells in Atherosclerosis. Circ Res. 118 (4), 668-678 (2016).
- McMaster, W. G., Kirabo, A., Madhur, M. S., Harrison, D. G. Inflammation, Immunity, and Hypertensive End-Organ Damage. Circ Res. (6), 1022-1033 (2015).
- Luckheeram, R. V., Zhou, R., Verma, A. D., et al. CD4+T Cells: Differentiation and Functions. Clin Dev Immunol. 2012, 1-12 (2012).
- Mittrücker, H. -W., Visekruna, A., Huber, M. Heterogeneity in the differentiation and function of CD8+ T cells. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 62 (6), 449-458 (2014).
- Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. Eur J Microbiol Immunol (Bp). 2 (2), 112-120 (2012).
- Finak, G., Langweiler, M., Jaimes, M., et al. Standardizing Flow Cytometry Immunophenotyping Analysis from the Human ImmunoPhenotyping Consortium. Sci Rep. 6, 20686 (2016).
- Herzenberg, L. A., Parks, D., Sahaf, B., Perez, O., Roederer, M., Herzenberg, L. A. The history and future of the fluorescence activated cell sorter and flow cytometry: a view from Stanford. Clin Chem. 48 (10), 1819-1827 (2002).
- Hrvatin, S., Deng, F., O'Donnell, C. W., Gifford, D. K., Melton, D. A. MARIS: method for analyzing RNA following intracellular sorting. PLoS One. 9 (3), 89459 (2014).
- Kalisky, T., Quake, S. R. Single-cell genomics. Nat Methods. 8 (4), 311-314 (2011).
- Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Cytometry: Today's technology and tomorrow's horizons. Methods. 57 (3), 251-258 (2012).
- Jiang, L., Tixeira, R., Caruso, S., et al. Monitoring the progression of cell death and the disassembly of dying cells by flow cytometry. Nat Protoc. 11 (4), 655-663 (2016).
- Lemoine, S., Jaron, B., Tabka, S., et al. Dectin-1 activation unlocks IL12A expression and reveals the TH1 potency of neonatal dendritic cells. J Allergy Clin Immunol. 136 (5), 1355-1368 (2015).
- Gaublomme, J. T., Yosef, N., Lee, Y., et al. Single-Cell Genomics Unveils Critical Regulators of Th17 Cell Pathogenicity. Cell. 163 (6), 1400-1412 (2015).
