Disseksjon av Larve Sebrafisk Gonadale Tissue

Summary

Her presenterer vi en protokoll for isolering av kjønnskjertelvevet over larve sebrafisk, noe som vil lette undersøkelser av sebrafisk kjønn differensiering og vedlikehold.

Abstract

Selv om vill sebrafisk har en ZZ / ZW sex-bestemmelsessystem har tamme sebrafisk tapt sex kromosomet. De benytter en polygenisk kjønnsbestemmelse system, hvor flere gener fordelt over hele genomet kollektivt bestemme kjønn identiteten til individuelle fisk. Foreløpig genene involvert i regulering gonadeutvikling og hvordan de fungerer fortsatt unnvikende. Normalt isolere kjønnskjertelvevet er det første trinnet for å undersøke kjønns utviklingsprosesser. Her presenterer vi en prosedyre for å isolere gonadal vev fra 17 dpf (dager etter befruktning) og 25 dpf sebrafisk larver. Det isolerte gonadal vev kan deretter undersøkes ved morfologi og genekspresjon profilering.

Introduction

Den viktigste kvinnelige kjønns determinant i vilt sebrafisk kromosom 4 er tapt eller endres i temmet sebrafisk (dvs. felles lab stammer) ^1. I stedet har de en polygenic kjønnsbestemmelse system ledsaget av miljøfaktorer som temperatur, oksygenmangel, næringstilgang og befolkningstetthet. De detaljerte mekanismer for sebrafisk sex utvikling er ikke fullt ut forstått. Grunnleggende spørsmål slik som når sebrafisk kjønnsbestemmelse finner sted, hva det primære kjønnsbestemmelse signal (er) er / er, og hvilke gener som regulerer det første trinn av gonade transformasjon gjenstår å bli besvart ^{2, 3.}

I prosessen med sebrafisk sex utvikling, har flere viktige stadier blitt gjenkjent. I det tidlige stadium av utviklingen, ved å starte fra 4 HPF (timer etter befruktning) opphave bakterie-celler (PGC) gjennomgå spesifikasjon, migrering til genital mønet ogspredning. PGC tall og gjensidige interaksjoner mellom kjønnsceller og somatiske celler som er viktige for gonade differensiering ^4. Ved 13 dpf (dager etter befruktning), gonadene er i udifferensierte trinnet. Ved 17 dpf, gonadene utvikle seg til bi-potensielle eggstokkene hos både fremtidige hunner og hanner. Den apoptose-avhengig overgang fra eggstokk til testis begynne ved 21 til 25 dpf og kan fortsette i flere uker. Med 35 dpf, og kjønn på gonade blitt bestemt og kjønnsspesifikke kjønnscelleproduksjon er i gang i begge eggstokkene og testiklene ^{5, 6, 7.}

Hittil har diverse kandidatgener og mekanismer for kjønnsbestemmelse blitt foreslått. Proteomikk og transcriptomic analyse har isolert mange gener med seksuelt dimorf uttrykk og disse genene er blitt anvendt for å studere sex differensiering i sebrafisk ^8, </sup> ^{9, 10.} For eksempel, i larvesebrafisk, den cyp19a1a genet er spesifikt uttrykt i eggstokken, men ikke i testiklene ^{11, 12.} I tillegg er AMH gen svakt uttrykt i eggstokkfollikelen granulosa celler, men sterkt i testis Sertolicellene ^13. I motsetning til dette er vasa genet uttrykkes kontinuerlig i kjønnsceller både kvinnelig og mannlig sebrafisk, slik at det er en passende gonade markør ^{14, 15.}

Investigating gonadale genekspresjonsnivåer er viktig å forstå den molekylære mekanismen for kjønnsbestemmelse og differensiering, spesielt i den bi-potensialet eggstokk trinn ^{3, 9.} Imidlertid er den lille størrelsen på larvesebrafisk og tilsvarende små gonader kompliserer isoleringen av gonadal vev for ytterligere molekylær analyse. Tidligere studier anvendte dissekert hele stammen område mellom opercula og anal pore ^16. Dette preparatet, selv om det inneholder gonader, består av flere vev og organer. Alternativt kan transgene dyr med gonade-spesifikk GFP uttrykk som vasa: ble EGFP anvendt for kjønnskjertelvevet isolert via fluorescens-aktivert cellesortering (FACS) laser og fange mikro disseksjon ^{17, 18.} Men deres utbredt program er begrenset. Her beskriver vi en enkel prosedyre for å isolere gonadal vev fra larvesebrafisk på 17 dpf og 25 dpf. Vi viser posisjonen av gonadene i forhold til andre organer og isolere de morfologisk intakte gonadene fra det omgivende vev. Vi viser videre til gonade-spesifikke gener som vasa og cyp19a1a er sterkt uttrykt i de isolerte gonadene i forhold til stammen vev ved kvantitativ PCR (qPCR) analyse. Den foreliggende protokollen tillater identifisering, isolering, rensing og RNA-amplifikasjon av gonadal spesifikke gener fra larvesebrafisk, for derved å muliggjorde etterfølgende molekylær analyse av gonadal vev ^19.

Protocol

Sebrafisk eksperimenter ble godkjent av Fudan University Institutional Animal Care og bruk Committee. Sebrafisk ble hevet og avlet i henhold til standard prosedyrer 20. 1. Forberedelser Dyrke 17 dpf og 25 dpf larvesebrafisk Transfer to mannlige og to kvinnelige voksen sebrafisk (sunt, 3 til 6 måneder gamle, laboratorium AB strain) til en kryssing tank sent på ettermiddagen før krysset dag. Separer hanner og hunner med en barriere. Neste morgen, …

Representative Results

Disseksjoner av gonadene ble utført på AB strain larvesebrafisk. Figur 1 viser et typisk kjønnskjertelvevet over larve sebrafisk ved 17 dpf og 25 dpf. For det første er den hud og musklene på den ene side av magen skåret for å eksponere de indre organer. Etter fjerning av massen av indre organer, svømmeblæren sammen med den gonade forbli i bagasjerommet. Den gonade ble festet til den ventrale side av svømmeblæren (pil i figur …

Discussion

Sebrafisk har blitt en kraftig modell og er mye brukt i utvikling og sykdomsrelatert forskning. Fremgangsmåtene for isolering av organer i voksne sebrafisk, slik som hjerne, hjerte, gonade-, og nyre, har blitt godt dokumentert ^{23, 24, 25.} På grunn av den lille størrelsen og dynamisk remodellering av vev i gonadal larvesebrafisk, er isolasjon av kjønnskjertelvevet en krevende oppgave. Tidligere studier benyttet hele disseker…

Materials

Cell culture dish 100 mm	Corning	430167	For embryo incubation
20 X EM			For a 1 liter needed: add 17.5 g NaCl, 0.75 g KCl and 2.9 g CaCl.2H2O; then add 0.41 g KH2PO4, 0.412 g Na2HPO4 anhydrous and 4.9 g MgSO4. 7H2O.
1 X EM			Dilute 20 X EM in distilled water
AGAROSE G-10	Gene	121985	For preparing the 2% agar plates
Trizol Reagent	Invitrogen	15596-026	For RNA isolation
Meter glass	Shen Bo	250 ml	For preparing the 2% agar plates
Microwave Oven	Midea	M1-211A	For heating the AGAR
TWEEZER DUMONT#5INOX	World Precision Instrument	500341	For dissection
Stereomicroscope	Motic	SMZ168	For dissection
Pure water equipment	Millipore
Ringer’s solution			For a 1 liter needed: Add 6.78g NaCl, 0.22 g KCl, 0.26 g CaCl2 and 1.19 g Hepes; then fill to 1 L; Adjust pH to 7.2. Sterilize by filtration and keep in an autoclaved clear polycarbonate container.
Transfer pipette	Samco	202, 204
Metal bath	QiLinbeier		Model GL-150
Microscope	Leica	M205 FA	For photomicrograph
Centrifuge	Eppendorf	5417R
Micro Scale RNA Isolation Kit	Ambion	AM1931	For RNA isolation from gonad tissues
Dnase I	Sigma	AMPD1-1KT	For DNA digestion in the RNA solution
RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit	Thermo Scientific	#K1631	For  first-strand cDNA synthesis
Rnase H	Thermo Scientific	#EN0202	For digesting the residual RNA in the cDNA solution.
SYBR Green Realtime PCR Master Mix	TOYOBO	QPK-201	This product is a Taq DNA polymerase-based 2 x master mix for real-time PCR and  applicable for intercalation assay with SYBR Green I.
Spectrophotometer	Ne Drop	OD-2000+	Measuring the concentration of the total RNA
Mastercycler	Eppendorf	AG 22331 Hamburg	gene expression profiling