Summary
Heri præsenterer vi en fremgangsmåde til foder pesticid forurenede fødevarer til både en individuel honningbi og en bikube koloni. Proceduren evaluerer pesticidet virkning på individuelle honningbier ved in vivo tilførsel af basisk larvediæt og også på den naturlige tilstand bikube koloni.
Introduction
Tilstedeværelsen af pesticider i miljøet er en af de mest alvorlige problemer, som påvirker livet for en honningbi 1, 2, 3. Flere undersøgelser har påvist den fælles tilstedeværelse af pesticidrester i honning bikolonier og biprodukter. I Taiwan, den gennemsnitlige anvendelse af pesticider var 11-12 kg / ha hvert år (fra 2005 til 2013). Mængden af pesticider, der anvendes i Taiwan er højere end i EU-landene, og de latinamerikanske lande 4, 5. Med andre ord, er fra stadet miljø lider alvorlig pesticid stress, især i Taiwan og muligvis i andre lande.
Honningbien Apis mellifera er en af de store bestøvere i landbrugssystemer 6 og det producerer også værdifulde produkter såsom honning. Men honningbier er udstillingered til forskellige pesticider og disse pesticider kan bringes tilbage til bistader efter fouragere på blomster, der er blevet sprøjtet med pesticider, når de indsamler nektar og pollen 7, 8. De kan også blive udsat for pesticider ved biavlerne selv har til formål at kontrollere problemer med skadedyr inde bistader 9, 10, 11. Fordi honningbi larver fodret med sygeplejerske bier for deres udvikling, larver, droner og endda dronningen kan udsættes for disse pesticider-kontamineret nektar og pollen 12. Toksiciteten af forskellige pesticider til honningbier skal løses 13.
Der er gjort mange forsøg på at vurdere spørgsmålene om miljømæssige pesticidrester. Yang et al. testet påvirkningen af det neurotoksiske insektmidlet imidacloprid på udviklingen af honningbi larver ibikube og rapporterede, at en sub-letal dosis af imidacloprid resulterede i olfaktoriske associative opførsel af de voksne bier 14. Også, Urlacher et al. undersøgte de subletale virkninger af et organophosphat pesticider, chlorpyrifos, på en honningbi arbejdstagers læring ydeevne under laboratorieforhold 15. I vores tidligere undersøgelse, vi evaluerede effekten af et insekt vækst regulator (IGR), pyriproxyfen (PPN), på larver honningbier 16.
I dette papir, vi præsenterer metoder til evaluering af de kemiske virkninger på udviklingen af honningbier. Honey bee fodringsmetoder blev beskrevet og anvendt til enten individuelle honningbier eller til en koloni. Først testede vi forskellige koncentrationer af pesticid-forurenet basisk larvediæt (BLD) på larver i kolonierne at vurdere virkningen af pesticidet på individuelle honningbier in vivo. Vi fortsatte derefter med at simulere den naturlige conditioner af pesticidet ved anvendelse pesticid-forurenet sirup i bistader. Ved denne fremgangsmåde vil PPN, som er meget udbredt mod skadedyr 17 og er skadeligt for udviklingen af honningbi-larver og pupper 16, 18, 19, være en indikator til at repræsentere den negative virkning af pesticidet i marken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Præparater
- Lav 1 liter 50% sukkersirup. Opløs 1 kg saccharose i 1 I Hedeselskabet 2 O.
- Forberede pyriproxyfen (PPN) opløsning i BLD. Gøre 1,1 I 10.000 ppm PPN stamopløsning og fortyndes 100 ml PPN opløsning i 1 liter steriliseret Hedeselskabet 2 O. Opbevares ved 4 ° C.
- Fortynde PPN stamopløsningen til slutkoncentrationer på 0,1, 1, 10 og 100 mg / kg (ppm) i BLD for det følgende eksperiment.
- Make PPN-sirup (for kolonien niveau). Fortynde PPN lager til slutkoncentrationer på 10 og 100 ppm i 50% sukkersirup til det følgende eksperiment.
- Honey bee opdræt.
Bemærk: Her er den eksperimentelle placering er National Ilan University (NIU) bigården, Yi-Lan City, Taiwan; (GPS-koordinater: N24.747278, E121.746200).- Check honningbi (Apis mellifera L.) kolonier ugentligt for fødevarer mængde og foder med 1 liter 50% sukkersirup om nødvendigt (honning lagerområde er tom). Definer en sundkoloni som 9 frames honningbien kamme i hver koloni med en dronning lægge æg normalt.
- Fremstilling af 100 ml af basisk larvediæt (BLD). Opløs 6% D-glucose, 6% fructose, og 1% gærekstrakt i steriliseret destilleret deioniseret vand (ddH2O) og supplere med 50% gelée. Opbevar ved 4 ° C, men ikke mere end 3 dage.
Bemærk: Pre-varme til 35 ° C før eksperimentet og anvendes inden for 3 dage.
2. In vivo Feeding Metode
Bemærk: In vivo er blevet modificeret fodringsmetoden fra Hanley et al. 20
- Honey bee larver udvælgelse og mærkning.
- Indsætte en dronning tætningslisten at opdele 9 rammer af en sund koloni i 4 rammer og 5 rammer samtidig begrænse dronningen til 4 rammesektion. Efterlad mindst en tom ramme i 4 ramme sektion for at lægge æg.
- Efter dronningen lægger æg i 1 dag, Kontrollere rammerne for forekomsten af æg og holde æggene inde i bistader i 72 timer (den 4. dag) indtil 1 dag-gamle larver lugen. Tag en af de rammer, der indeholder 1 dage gammel arbejdstager larver (skraveret inden 24 timer) ud fra testen hiven med hånden og fjern honningbien arbejdere fra rammen med en bi pensel.
- Dække rammen med et transparent objektglas (Størrelse = længde x bredde x tykkelse = 29,7 mm x 21 mm x 0,1 mm) og søm gennemsigtig slide på kanten af rammer med tegnestifter (figur 1A).
- For hver behandling tilfældigt vælge 50 daggamle larver (den 4. dag) og markere hver kuld celle ved hjælp af permanente tuschpenne på den gennemsigtige slæde (figur 1A og 1B).
Bemærk: Skriv oplysningerne for hver behandling på rammen og gennemsigtig slide samt ved hjælp af permanente tuscher for at undgå forveksling mellem forskellige behandlinger. Fjern de markerede dias og holde for in vivo </ Em> fodring og observation.
- In vivo fodring.
- Tilføje forskellige koncentrationer af PPN-BLD (0,1, 1, 10 og 100 ppm) til hver mærket kuld celle ved pipettering på dag 1, 2 og 3 med 10 pi, 10 pi og 20 pi henholdsvis ifølge indtaget mængde af larver alder. Tilsæt samme mængde BLD (ingen PPN) til en kontrolgruppe. Derved er den samlede dosis af PPN-BLD i hver mærket kuld celle akkumulerer til 4, 40, 400, og 4000 s.
BEMÆRK: Anerkend de mærkede yngel celler ved de afmærkede gennemsigtige rutschebaner og fjern de markerede transparente dias efter fodring. Brug frisk BLD til fodring forhindre rengøring af yngel celler ved bier. - Retur de PPN-behandlede rammer til de oprindelige kolonier for yderligere bemærkninger.
BEMÆRK: Hver behandling har fire biologiske gentagelser i fire kolonier.
- Tilføje forskellige koncentrationer af PPN-BLD (0,1, 1, 10 og 100 ppm) til hver mærket kuld celle ved pipettering på dag 1, 2 og 3 med 10 pi, 10 pi og 20 pi henholdsvis ifølge indtaget mængde af larver alder. Tilsæt samme mængde BLD (ingen PPN) til en kontrolgruppe. Derved er den samlede dosis af PPN-BLD i hver mærket kuld celle akkumulerer til 4, 40, 400, og 4000 s.
- Observation af behandlede larver på dag 7.
- At observere the PPN-behandlet larver, returnere de mærkede transparente dias til rammerne for at registrere dødelighed og capping satser i de mærkede yngel celler.
- Observation af behandlede pupper og eclosion satser på dag 13.
- Fjern bivoks af en begrænset yngel celler.
- Sæt bløde tippes pincet ind yngel celle og klemme pupper meget lidt derefter tage pupper ud forsigtigt.
- Overfør pupper i 24-brønds vævskulturplader med en dobbelt-lag af laboratorie væv under hver brønd. Optag skaderne og dødelighed under puppe overførsel.
- Holde 24-brønds vævskulturplader i en inkubator ved 34 ° C og 70% relativ fugtighed indtil fremkomsten (ca. 8 dage).
- Observere og registrere pupper og dukket honningbier.
- Statistik
- Beregne de registrerede data og til stede som en middelværdi ± SD
- Analysere dataene ved hjælp af variansanalyse (ANOVA) af SAS og anvende den mindst signifikante forskel (LSD) test for at analysere forskellene mellem to hjælp af forskellige behandlinger. Definer statistisk signifikant som P-værdi <0,05. Forskellige bogstaver i samme kolonne i tabellen viste en signifikant virkning ved den statistiske analyse.
3. Toksicitet af PPN på Colony niveau i Beehive
- Opsæt honningbien grupper.
- Indsætte en dronning tætningslisten vertikalt at opdele 9 rammer af en sund koloni i 4 rammer (del A) og 5 rammer (del B), mens begrænsende dronningen til 4 rammesektion. Efterlad mindst en tom ramme i afsnit 4-ramme til at lægge æg.
Bemærk: Sagt på en anden dronning excluder den oven på dronningen del for at forhindre dronningen i at bevæge sig mellem delene. - Efter dronningen lægger æg for 1 dag, tjek rammerne for udseendet af æg. Tag de passende rammer, der indeholder æg ud fra del A i hånden og fjern honningbien arbejderefra rammen med en bi pensel.
- Dæk ramme med gennemsigtige rutschebane og søm den gennemsigtige dias til kanten af rammen med tegnestifter.
- Tilfældigt vælge 100 yngel celler indeholdende æg og mærke hver kuld celle ved hjælp af permanent markør på den gennemsigtige slide. Tildele disse 100 yngel celler som gruppe 1. Skriv informationen af hver behandling på rammen og gennemsigtig slide anvendelse permanent markør for at undgå forveksling mellem forskellige behandlinger.
- Returnere det mærkede ramme til del A i 3 dage og derefter overføre dronningen til del B for at lægge æg.
- Efter 1 dag, kontrollere rammerne af del B, vælge en passende ramme og mærke 100 yngel celler indeholdende æg som beskrevet i trin 3.1.4. Tildel disse 100 yngel celler som gruppe 2.
- Returnere det mærkede ramme til del B i 3 dage og derefter overføre dronningen til del A for at lægge æg.
- Gentag dronningen udveksling mellem del A og del B endnu 6 gange og tildele grupper numerisk,(figur 2). Der bør være alt 9 grupper.
- Indsætte en dronning tætningslisten vertikalt at opdele 9 rammer af en sund koloni i 4 rammer (del A) og 5 rammer (del B), mens begrænsende dronningen til 4 rammesektion. Efterlad mindst en tom ramme i afsnit 4-ramme til at lægge æg.
- T reat honningbi koloni med PPN sukkersirup på dag 13 (figur 2).
- Tilsæt 1 L 50% PPN sukkersirup indeholdende 10 eller 100 ppm i en plastik bi feeder kasse (B x L x H = 20 cm x 30 cm x 3,5 cm) og anbringes derefter felt over rammerne i de eksperimentelle kolonier.
Bemærk: Gruppe 1 ikke modtager PPN på 13 dage, da yngel celler er blevet forseglet. - Fodre kontrolgruppen med 1 L 50% sukkersirup (ingen PPN) som beskrevet i trin 2.2.
- Tilsæt 1 L 50% PPN sukkersirup indeholdende 10 eller 100 ppm i en plastik bi feeder kasse (B x L x H = 20 cm x 30 cm x 3,5 cm) og anbringes derefter felt over rammerne i de eksperimentelle kolonier.
- Tæller 1 dag-gamle larver og rekord som ægget udklækningsmængde af 100 mærkede yngel celler for hver gruppe på dag 5 (figur 2). Honey bee æg normalt tager 3 dage at klække i 0 dage larver; derfor, kontrollere og mærke 100 æg-holdige yngel celler på dag 1 og tælle antallet af 1 daggamle larver for hver gruppe på dag 5 for at opnå procentdelen af udklækningsmængde.
- Count de dækkede yngel celler og optage som larve- udjævningssatsen af 100 mærkede yngel celler for hver gruppe på dag 11 (figur 2). 6 til 7 dage gamle larver yngel celler vil blive udjævnet med bivoks ved honningbi arbejdere til larver pupating.
- Observere pupper modning og registrere eclosion hastighed på 100 mærkede yngel celler for hver gruppe på dag 17 (figur 2).
- Fjern bivoks af en begrænset yngel celler og tage pupper ud med bløde tippet pincet forsigtigt. Overfør pupper i en 24-brønds vævskulturplader med en dobbelt-lag af laboratorie væv under hver brønd.
- Holde 24-brønds vævskulturplader i en inkubator ved 34 ° C og 70% RH indtil fremkomsten.
- Observere og registrere pupper og opstod honningbier for hver gruppe indtil Gruppe 9 (49 eksperimentelle dage).
Bemærk: Hver behandling har fire biologiske gentagelser.
- Statistik
- Beregne de registrerede data og til stede som den gennemsnitlige± SD.
- Analyser af de betydelige forskelle mellem par af behandlinger (f.eks 0 ppm / 10 ppm, 10 ppm / 100 ppm og 0 ppm / 100 ppm) i hver gruppe ved anvendelse af Students tohalet t-test. Definerer som statistisk signifikant hvis P-værdi <0,05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For honningbien felttest blev en dronning begrænset til 4-frame sektion for at lægge æg. Dette trin kan øge kuld tæthed i en ramme og lette efterfølgende observationer. Hver behandling var mærket, og honningbier udvikling klart blev observeret gennem et transparent objektglas. In vivo fodring af PPN-BLD til Honey Bee larver i bistadet blev udført til præcist at vurdere indflydelsen af PPN på udviklingen af honningbier i kolonien. Anvendelse af det in vivo fodringsmetoden lettet observation af virkningerne af de kemiske behandlinger på bistadet.
For hver dosis af PPN-BLD, blev i alt halvtreds yngel celler mærkes og behandles. Efter tilsætning PPN-BLD blev de behandlede rammer returneres til de oprindelige kolonier til observation under naturlige betingelser. De negative virkninger af PPN-BLD på larvestadiet-trins honningbier var nemt observed. En dosis-afhængig effekt blev observeret. Tabel 1 præsenterer antallet af honningbier, der døde på larvestadiet ved de to højere doser af 10 og 100 ppm. Som vist i tabel 1, ved de to doser (0,1 og 1 ppm), udjævningen rater, dage til fremspiring og eclosion satser var ikke signifikant forskellig fra 0 (BLD fødevarer tilsat) eller ufodrede kontrol, med kun en signifikant højere procentdel af bier med deforme vinger på 1 ppm. Melanin af pupperne blev iagttaget ved lave koncentrationer af PPN. Endvidere er andelen af voksne honningbier optrådte med deforme vinger steg med højere doser af PPN (tabel 1).
At simulere honningbikolonier lider miljømæssige PPN rest, fodring af PPN sirup til hele honningbi koloni blev udført. Før behandling, blev hver koloni opdelt i 9 forskellige tidsmæssige grupper med 3 dages intervaller med to dronning excluders (Figur 2). Derfor blev virkningerne af PPN på satserne for klækning, capping og eclosion observeret samtidigt under betingelser svarende til de i det naturlige miljø.
Kolonierne blev fodret sirup med 10 eller 100 ppm PPN på dag 13 (angivet med den røde stiplede i figur 2). Teoretisk gruppe 1 var en PPN-fri kontrol, fordi den PPN-sirup blev tilført på dag 13, og honningbier i gruppe 1 var i puppestadiet og loft; honningbier i larvestadiet begyndte at blive berørt i gruppe 2 og 3, og æggene vil blive påvirket i grupper 4-9 på grund af den længere eksponeringstid i PPN-forurenede bikuber (figur 2).
I dette forsøg vi fodres honningbi kolonier med PPN sirup og observerede udvikling, når de voksne honningbier fortærede sirup og formentlig fodret dronningen og larverne. Denne antagelse blev bekræftet af hatching, capping og eclosion rater, og deforme vingede bier blev observeret efter de PPN behandlinger, som vist i figur 3A - 3D. Alle parametre afveg signifikant ved den højere dosis (100 ppm), startende med gruppe 3 bortset udklækningsmængden (figur 3A - 3D). Endvidere efter PPN-sirup behandlinger, mange pupper døde med sorte neglebånd eller ved ikke at dukke op. I 100 ppm PPN behandling blev de dækkede celler ødelagt, og den sårede pupper blev fjernet fra koloni (figur 3E).
Figur 1: Skema til etikettering kuld-celler. (A) 1 dag-gammel arbejder larver dækket af transparente slide papirer og blev mærket ved permanent markør. (B) mærket 1 daggamle worker larval yngel celler; den hvide pil angiver en 1 daggamle arbejdstager larve indeni. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Tidslinje for når PPN startes i forhold til de 9 forsøgsgrupper. Forskellige koncentrationer af PPN blev fodret på dag 13 (rød stiplet linie). Den behandlede koloni blev delt i del A og del B. dronning udvekslinger fra del A til del B og omvendt for at lægge æg er vist. Dette er blevet gengivet med tilladelse fra Elsevier 16. Klik her for at se en større version af dette tal.
6 / 55296fig3.jpg"/>
Figur 3: Udvikling af honningbi-larver før og efter feeding 1 kg PPN sirup i testede bikolonier. I alt ni grupper blev undersøgt i dette forsøg: (A) udklækningsmængde; (B) udjævningssatsen; (C) eclosion rate; og (D) misdannet fløj sats. Middelværdi ± standardafvigelse er vist; Røde pile viser den tid, hvor PPN kan begynde at handle på bier. Sorte asterisker viser statistisk signifikans sammenlignet med kontrollen (0 ppm). Røde asterisker viser statistisk signifikans mellem 10 og 100 ppm; (E) 100 ppm PPN sirup behandlet bifamilie viste uncapped celler, formodentlig deformeret pupper og sort og deforme pupper. Dette er blevet gengivet med tilladelse fra Elsevier 16. Klik her for at se en større version af dette tal.
| PPN-BLD (ppm) | Larver No. | larve udvikling | ||
| Udjævnede rate (%) | Eclosion rate (%) | Misdannede vinger (%) | ||
| 100 | 140 | 0b | 0b | - |
| 10 | 139 | 22,2 ± 33.2b | 0b | - |
| 1 | 140 | 72,3 ± 17.9a | 67,7 ± 17.6a | 7,7 ± 5.7a |
| 0,1 | 136 | 78,3 ± 17.5a | 75,4 ± 22.8a | 1,4 ± 2.8b |
| 0 | 138 | 78,9 ± 5.4a | 78,9 ± 5.4a | 0b |
| Ikke-fodring | 122 | 87.8 ± 9.1a | 86,1 ± 7.2a | 0,8 ± 1.5b |
Tabel 1: Effekter af fortsatte 3 dage fodring af PPN den 1. daggamle larver. Til hver larve celle blev 10, 10 og 20 pi af BLD tilsat fra dag 1 til 3 hhv. Hvert assay indeholdt 25-38 larver i en koloni og 4 kolonier blev testet. Middelværdi ± SD er vist. Forskellige bogstaver i samme kolonne er signifikant forskellige ved de mindste kvadraters forskel test (P <0,05) efter ANOVA viste en signifikant effekt. Dette er blevet gengivet med tilladelse fra Elsevier 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dronningen-begrænset æglægning metode og dronning-udveksling metode er kritiske trin til opsætning af honningbi grupper til feltforsøg inden for denne protokol. Dronningen-begrænset æglægning metode tillader synkronisering af livscyklus honningbier. Derfor kan forskerne vælge 1 dag-gamle larver af samme alder for behandling med forskellige doser af pesticider. For queen-udveksling metode blev dronningen udveksles mellem del A (4 rammer) og B (5 billeder) for at opnå forskellige udviklingsstadier i honningbi for feltforsøg til at vurdere virkningerne af pesticider og pesticid-rester. Desuden blev et stort antal udvalgte yngel celler optaget i fieldtesten anvendelse af transparente objektglas til mærkning. Imidlertid æg over-æglæggende lejlighedsvis resulterer i utilstrækkelige yngel celler til dronningen lægge æg. Derfor er fremstillingen af tomme rammer kræves til queen-ombytningsmetode. Alternativt kunne queen-begrænset æglægning fremgangsmåde også anvendes tilforberede forskellige honningbi grupper til test i bistadet. Adskillelsen af rammerne i 2 rammer i del A og 7 rammer i del B og placeringen af dronningen i del A (2 rammer) kan begrænse de af dronningen inden for 2 rammer æg.
Til in vivo fodring metode blev PPN-BLD tilsat til hver yngel celle. Honningbier udviste højere accept af BLD end sirup 16, 20. Honey bee larver kan overleve og vokse på en kunstig diæt bestående af gelé royal, sukker, gærekstrakt, og destilleret vand 22, 23. Glucose og fructose sammensætningen af BLD påvirkede ikke overlevelsesraterne for larverne in vitro 21, og derfor ville BLD være mere stabile for honningbi vækst i bistadet. Især brugen af frisk BLD til fodring kunne også forhindre bier larve udelukkelse underlarve fodringsforsøg. Desuden under fodringen, blid fodring er i første omgang forpligtet til at undgå døden for 1 dag-gamle larver.
Under feltforsøg, kemisk forurenet BLD i bistadet lejlighedsvis forårsaget larve udstødelse på grund af den høje olfaktoriske følsomhed ammende bier. Sukkersammensætningen påvirker signifikant den gennemsnitlige larve overlevelse, præ-puppe larval vægte, voksne vægte, og ovariole numre 21. Når sirup blev anvendt til at levere transgene pollen eller en positiv kontrol pesticid diazinon til honningbi larver, arbejderne fjernet få larver fra yngel celler tilsat eller kontaminerede fødevarer 21. Således bør bemærkes sukkersammensætningen. Forøgelse af antallet af 1 dag-gamle larver eller dispergere de testede enkelte yngel celle sites kan også forbedre problemerne. Faktisk er baseret på observationen af PPN-BLD behandlingsprocesser og de dramatiske dosisafhængige virkninger afPPN-BLD på udviklingen af honningbier, antog vi, at sygeplejerskerne ikke fjernede den kunstigt tilsat BLD til yngel celler. Lave koncentrationer af PPN årsag melanin af pupper, muligvis på grund af øget phenoloxidase aktivitet, som regulerer melanin og pupation 24, 25, 26. Baseret på anvendelsen af en kunstig fodring metode for hvert kuld celle, kan de dramatiske virkninger af PPN-BLD om udviklingen af honningbier skyldes direkte kontakt med PPN fra den første udklækningen.
De kemiske doseringer anvendt i fodringsforsøg kunne designes baseret på data fra undersøgelsen af pesticidrester i friske pollen prøver indsamlet fra honning bikuber. Der er en række ruter til forurening af kolonier i det naturlige miljø pesticid. Kemiske forureninger kunne bringes tilbage til honningbikolonier og indtages af larver grund fodring motion af arbejdstager honningbier, i sidste ende påvirke udviklingen af larver. For at vurdere virkningen af PPN på kolonien niveau i bistadet, blev sirup i stedet for pollen til fodring i denne undersøgelse som den hurtigste og mest direkte måde at sikre, at honningbier forbruges kemikaliet. Desuden kan defineres, tilstanden af siruppen, hvorimod er vanskeligt at styre (fx patogener eller pesticidforurening) indholdet af pollen.
Under markforhold, forskellige udviklingsstadier (æg, larver, pupper og voksne bier) af honningbier i en honningbi koloni lide samme miljø faktor. I vores forsøgsopstilling, blev naturforhold simuleret for at vurdere virkningerne af kemikaliet på udviklingsstadier af honningbier i et dynamisk miljø. Derfor, efter PPN behandling (13 dage), kunne vi observere upåvirket udjævningssatsen i gruppe 1, den påvirkes udjævningssatsen i de andre otte grupper, og den påvirkes larvestadiets i gruppe 2 og 3, osv Under disse betingelser, de sande virkninger inden kolonien og rute for spredning af kemikaliet til hele kolonien er klare.
De honningbikolonier behandlet med PPN sirup udviste fordrejning af udjævnede celler og fjernelse af pupper fra kolonien. Endvidere blev omfattende melanin af pupper observeret i 100 ppm PPN behandling. Således PPN-sirup fodringsmetoden tillod den dynamiske virkning af kemikalier på livscyklus honningbier i bistadet skal overholdes. I dette forsøg blev siruppen taget op af arbejdstageren og ammende bier formentlig føres til dronningen og larverne. For bekræftelse vil vores fremtidige undersøgelser anvendes kemiske markører (såsom et spiseligt farvestof) i den kemiske-holdige sirup til yderligere lette undersøgelsen af dynamikken i kemisk forurenede bikuber.
Fødevarer kilde til sygeplejerske bier bør komme fra finsnittere eller bikube og larver fodres mandibular og hypopharyngeal kirtelsekretioner produceret af sygeplejerske bier 21, 25, 26, 27, 28. Når larverne fodres med sygeplejerske bier, kan sekreter produceret af hypopharyngeal kirtel i mandiblerne fortynde PPN-sirup. Denne biologiske udvandingseffekt mere ligner de naturlige forhold, men forklarer de forskellige resultater til in vivo-fodring metode. Flere materialer, herunder andre pesticider, tungmetaller og honning bipatogener kunne anvendes på denne fodring metode til evaluering og håndtering af roller i honningbi populationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Denne forskning blev støttet af Grant 105AS-13.2.3-BQ-B1 fra Bureau of Animal og Plantesundhed Inspection and Quarantine, Rådet for landbrug, Executive Yuan og Grant 103-2313-B-197-002-MY3 fra ministeriet for Videnskab og Teknologi (MOST).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Honey bee box | SAN-YI Honey Factory | W1266 | Honeybees rearing |
| Queen excluder (between frames) | SAN-YI Honey Factory | I1575 | Queen limitation |
| Queen excluder (on top) | SAN-YI Honey Factory | I1566 | Queen limitation on top |
| Bee brush | SAN-YI Honey Factory, Taiwan | W1414 | clean the bees on frame gently |
| Bee feeder | SAN-YI Honey Factory, Taiwan | P0219 | feed sugar syrup to colony |
| Transparent slide | Wan-Shih-Chei, Taiwan (http://www.mbsc.com.tw/a01goods.asp?s_id=40) | 1139 | Mark the larval area on the frames (Material: Polyethylene Terephthalate, PET) (Size = Length*Width*thick = 29.7 mm * 21 mm * 0.1 mm) |
| 24 well tissu culture plate | Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd | TCP011024 | Rearing pupae from extraction |
| Autoclave | Tomin medical equipmenco., LTD. | TM-321 | Make sterilized distilled deionized water (ddH2O) |
| P20 pipetman | Gilson | F123600 | Add PPN into bee larval food pool |
| Incubator | Yihder Co., Ltd. | LE-550RD | Rearing pupae from extraction |
| Kimwipes | COW LUNG INSTRUMENT CO., LTD | KCS34155 | Rearing pupae from extraction |
| Royal jelly | National Ilan University (NIU) | NIU | Make basic larval diet (BLD) |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G8270 | Make basic larval diet (BLD) |
| D-(-)-Fructose | Sigma | F0127 | Make basic larval diet (BLD) |
| Yeast extract | CONDA, pronadisa | 1702 | Make basic larval diet (BLD) |
| Sucrose | Taiwan sugar coporation | E01071010 | Make sugar syrup for bee food |
| Pyriproxyfen (11%) | LIH-NUNG CHEMICAL CO.. LTD. | Registration No. 1937 | Insect growth regulator (IGR) used in the experiment |
References
- Ruffi nengo, S. R., et al. Integrated pest management to control Varroa destructor and its implications to Apis mellifera colonies. Zootecnia Trop. 32 (2), 149-168 (2014).
- Mullin, C. A., et al. High levels of miticides and agrochemicals in North American apiaries, implications for honey bee health. PLoS One. 5, e9754 (2010).
- Lu, C. A., Chang, C. H., Tao, L., Chen, M. Distributions of neonicotinoid insecticides in the Commonwealth of Massachusetts, a temporal and spatial variation analysis for pollen and honey samples. Environ. Chem. 13, 4-11 (2016).
- Tsai, W. T. Analysis of coupling the pesticide use reduction with environmental policy for agricultural sustainability in Taiwan. Environ. & Pollut. 2, 59-65 (2013).
- Weng, Z. H. Pesticide market status and development trend (in Chinese). PRIDE. , https://pride.stpi.narl.org.tw/ (2016).
- Kevan, P. G. Pollinators as bioindicators of the state of the environment, species, activity and diversity. Agric. Ecosys. Environ. 74 (1-3), 373-393 (1999).
- Kevan, P. G. Forest application of the insecticide fenitrothion and its effect on wild bee pollinators (Hymenoptera: Apoidea) of lowbush blueberries (Vaccinium SPP.) in Southern New Brunswick, Canada. Biol. Conserv. 7, 301-309 (1975).
- Crane, E., Walker, P. The impact of pest management on bees and pollination. , IBRA. Cardiff, UK. (1983).
- Haouar, M., Decormis, L., Rey, J. Fluvalinate applied to flowering apple trees-contamination of honey-gathering bees and hive products. Agronomie. 10 (2), 133-137 (1990).
- Chauzat, M. P., et al. A survey of pesticide residues in pollen loads collected by honey bees in France. J. Econ. Entomol. 99 (2), 253-262 (2006).
- Bonzini, S., Tremolada, P., Bernardinelli, I., Colombo, M., Vighi, M. Predicting pesticide fate in the hive (part 1), experimentally determined τ-fluvalinate residues in bees, honey and wax. Apidologie. 42 (3), 378 (2011).
- Sanchez-Bayo, F., Goka, K. Pesticide residues and bees-a risk assessment. PLoS One. 9 (4), e94482 (2014).
- Johnson, R. M., Ellis, M. D., Mullin, C. A., Frazier, M. Pesticides and honey bee toxicity-USA. Apidologie. 41, 312-331 (2010).
- Yang, E. C., Chang, H. C., Wu, W. Y., Chen, Y. W. Impaired olfactory associative behavior of honeybee workers due to contamination of imidacloprid in the larval stage. PLoS One. 7, e49472 (2012).
- Urlacher, E., et al. Measurements of chlorpyrifos levels in forager bees and comparison with levels that disrupt honey bee odor-mediated learning under laboratory conditions. J. Chem. Ecol. 42 (2), 127-138 (2016).
- Chen, Y. W., Wu, P. S., Yang, E. C., Nai, Y. S., Huang, Z. Y. The impact of pyriproxyfen on the development of honey bee (Apis mellifera L.) colony in field. J. Asia Pac. Entomol. 19 (3), 589-594 (2016).
- Dennehy, T. J., DrGain, B. A., Harpold, V. S., Brink, S. A., Nichols, R. L. Whitefly Resistance to Insecticides in Arizona: 2002 and 2003 Results. , San Antonio, TX, USA. http://ag.arizona.edu/crop/cotton/insects/wf/whiteflyresistance0204.pdf 1926-1938 (2004).
- Yang, E. C., Wu, P. S., Chang, H. C., Chen, Y. W. Effect of sub-lethal dosages of insecticides on honey bee behavior and physiology. Proceedings of international seminar on enhancement of functional biodiversity relevant to sustainable food production, ASPAC, Tsukuba, Japan, , http://www.niaes.affrc.go.jp/sinfo/sympo/h22/1109/paper_06.pdf (2010).
- Fourrier, J., et al. Larval exposure to the juvenile hormone analog pyriproxyfen disrupts acceptance of and social behavior performance in adult honey bees. PLoS One. 10, e0132985 (2015).
- Hanley, A. V., Huang, Z. Y., Pett, W. L. Effects of dietary transgenic Bt corn pollen on larvae of Apis mellifera and Galleria mellonella. J. Apicult.Res. 42 (4), 77-81 (2003).
- Kaftanoglu, O., Linksvayer, T. A., Page, R. E. Rearing honey bees, apis mellifera, in vitro 1, effects of sugar concentrations on survival and development. J. Insect Sci. 11 (96), 1-10 (2011).
- Vandenberg, J. D., Shimanuki, H. Technique for rearing worker honey bees in the laboratory. J. Apicult. Res. 26 (2), 90-97 (1987).
- Peng, Y. S. C., Mussen, E., Fong, A., Montague, M. A., Tyler, T. Effects of chlortetracycline on honey bee worker larvae reared in vitro. J. Invertebr.Pathol. 60 (2), 127-133 (1992).
- Bitondi, M. M., Mora, I. M., Simoes, Z. L., Figueiredo, V. L. The Apis mellifera pupal melanization program is affected by treatment with a juvenile hormone analogue. J. Insect Physiol. 44 (5-6), 499-507 (1998).
- Zufelato, M. S., Bitondi, M. M., Simoes, Z. L., Hartfelder, K. The juvenile hormone analog pyriproxyfen affects ecdysteroid-dependent cuticle melanization and shifts the pupal ecdysteroid peak in the honey bee (Apis mellifera). Arthropod Struct. Dev. 29 (2), 111-119 (2000).
- Santos, A. E., Bitondi, M. M., Simoes, Z. L. Hormone-dependent protein patterns in integument and cuticular pigmentation in Apis mellifera during pharate adult development. J. Insect Physiol. 47 (11), 1275-1282 (2001).
- Brouwers, E. V. M. Glucose/Fructose ratio in the food of honeybee larvae during caste differentiation. J. Apicult.Res. 23 (2), 94-101 (1984).
- Howe, S. R., Dimick, P. S., Benton, A. W. Composition of freshly harvested and commercial royal jelly. J. Apicult. Res. 24 (1), 52-61 (1985).
