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कॉलोनी स्तर को व्यक्ति से हनी बी विकास पर पर्यावरण रसायन के प्रभाव का मूल्यांकन

Published: April 1, 2017 doi: 10.3791/55296
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biotechnology and Animal Science, National Ilan University

Summary

इस के साथ साथ हम प्रस्तुत करते हैं एक विधि दोनों एक व्यक्तिगत मधु मक्खी और एक मधुमक्खी के छत्ते कॉलोनी में कीटनाशक दूषित भोजन खिलाने के लिए। प्रक्रिया बुनियादी लार्वा आहार के इन विवो खिला द्वारा और भी मधुमक्खी के छत्ते कॉलोनी के प्राकृतिक स्थिति पर अलग-अलग मधु मक्खियों पर कीटनाशक प्रभाव मूल्यांकन करता है।

Introduction

वातावरण में कीटनाशकों की मौजूदगी सबसे गंभीर समस्याओं में से एक यह है कि प्रभावों मधु मक्खी 1, 2, 3 के जीवन। कई अध्ययनों से मधु मक्खी कालोनियों और मधुमक्खी उत्पादों में कीटनाशक अवशेषों की आम उपस्थिति का प्रदर्शन किया है। ताइवान में, कीटनाशकों के औसत आवेदन था 11-12 किग्रा / हर साल (2005 से 2013 तक) हा। ताइवान में इस्तेमाल कीटनाशकों की मात्रा यूरोपीय संघ के देशों की तुलना में अधिक है, और लैटिन अमेरिकी देशों 4, 5। दूसरे शब्दों में, apicultural वातावरण गंभीर कीटनाशक तनाव पीड़ित है, विशेष रूप से ताइवान में और संभवतः अन्य देशों में।

मधु मक्खी शहद की मक्खी mellifera कृषि प्रणालियों 6 में प्रमुख परागण में से एक है और यह भी इस तरह के शहद के रूप में मूल्यवान उत्पादों का उत्पादन। हालांकि, मधु मक्खियों एक्सपोस हैंविभिन्न कीटनाशकों और इन कीटनाशकों के एड फूल जब अमृत और पराग 7, 8 का संग्रह है कि कीटनाशकों का छिड़काव किया गया है पर चारा के बाद beehives में वापस लाया जा सकता है। उन्होंने यह भी beekeepers खुद को पित्ती 9, 10, 11 के अंदर कीट समस्याओं को नियंत्रित करने के लक्ष्य से कीटनाशकों के संपर्क में आ सकते हैं। क्योंकि मधु मक्खी के लार्वा उनके विकास, लार्वा, ड्रोन के लिए नर्स मधुमक्खियों द्वारा खिलाया और कर रहे हैं यहां तक कि रानी इन कीटनाशक दूषित सुधा और पराग 12 से अवगत कराया जा सकता है। मधु मक्खियों के लिए विभिन्न कीटनाशकों के विषाक्तता 13 संबोधित करने की जरूरत।

कई प्रयासों पर्यावरण कीटनाशकों के अवशेष के मुद्दों का मूल्यांकन करने के किए गए हैं। यांग एट अल। में मधु मक्खी के लार्वा के विकास पर न्यूरोटोक्सिक कीटनाशक imidacloprid के प्रभाव का परीक्षण कियामधुमक्खी के छत्ते और बताया कि imidacloprid की एक उप-घातक खुराक वयस्क मधुमक्खियों 14 वर्ष की घ्राण साहचर्य व्यवहार में हुई। इसके अलावा, Urlacher एट अल। एक organophosphate कीटनाशक, chlorpyrifos, मधु मक्खी कार्यकर्ता की सीखने के प्रदर्शन पर प्रयोगशाला परिस्थितियों 15 के तहत की उप घातक प्रभाव की जांच की। हमारे पिछले अध्ययन में, हम एक कीट विकास नियामक के प्रभाव (IGR), pyriproxyfen (PPN), लार्वा मधु मक्खियों 16 पर मूल्यांकन किया।

इस पत्र में, हम मधु मक्खियों के विकास पर रासायनिक प्रभावों के मूल्यांकन के लिए तरीकों प्रस्तुत करते हैं। मधु मक्खी भोजन के विशिष्ट तरीकों का वर्णन किया है और या तो अलग-अलग मधु मक्खियों के लिए या एक कॉलोनी के लिए लागू किया गया था। सबसे पहले, हम कीटनाशक दूषित बुनियादी लार्वा आहार (BLD) के विभिन्न सांद्रता लार्वा पर कालोनियों में विवो में अलग-अलग मधु मक्खियों पर कीटनाशक के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए परीक्षण किया गया। हम तो दीं प्राकृतिक condit अनुकरण करने के लिएbeehives भीतर कीटनाशक दूषित सिरप का उपयोग करके कीटनाशक के आयनों। इस विधि में, PPN, जो व्यापक रूप से कीट कीड़ों 17 के खिलाफ इस्तेमाल किया और मधु मक्खी के लार्वा और प्यूपा 16, 18, 19 के विकास के लिए हानिकारक है है, क्षेत्र में कीटनाशक के नकारात्मक प्रभाव को दर्शाने के लिए एक संकेत हो जाएगा।

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Protocol

1. तैयारी

  1. 50% चाशनी की 1 एल बनाओ। 1 एल DDH 2 ओ में 1 किलो सुक्रोज भंग
  2. BLD में pyriproxyfen (PPN) समाधान तैयार करें। 10,000 पीपीएम PPN शेयर समाधान के 1.1 एल करें और 1 एल 4 डिग्री सेल्सियस पर DDH 2 ओ स्टोर निष्फल में 100 एमएल PPN समाधान पतला।
  3. PPN शेयर निम्न प्रयोग के लिए BLD में 0.1, 1, 10 और 100 मिलीग्राम / किग्रा (पीपीएम) के अंतिम सांद्रता का हल पतला।
  4. PPN-सिरप (कॉलोनी स्तर के लिए) बनाओ। निम्नलिखित प्रयोग के लिए 50% चाशनी में 10 और 100 पीपीएम के अंतिम सांद्रता के PPN शेयर पतला।
  5. मधु मक्खी पालन।
    नोट: यहाँ, प्रयोगात्मक स्थान राष्ट्रीय इलान विश्वविद्यालय (NIU) मधुमक्षिकालय, यी-लैन सिटी, ताइवान है; (जीपीएस निर्देशांक: N24.747278, E121.746200)।
    1. चेक मधु मक्खी (mellifera एल) भोजन मात्रा के लिए साप्ताहिक कालोनियों और 1 लीटर में 50% चीनी सिरप के साथ फ़ीड यदि आवश्यक हो तो (शहद भंडारण क्षेत्र खाली है)। एक स्वस्थ परिभाषित करेंएक रानी सामान्य रूप से अंडे बिछाने के साथ प्रत्येक कॉलोनी में मधु मक्खी कंघी के 9 फ्रेम के रूप में कॉलोनी।
  6. बुनियादी लार्वा आहार (BLD) की 100 एमएल तैयार करें। निष्फल आसुत विआयनीकृत जल में 6% डी ग्लूकोज, 6% फ्रुक्टोज, और 1% खमीर निकालने भंग (DDH 2 हे) और 50% शाही जेली के साथ पूरक। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर लेकिन अधिक से अधिक 3 दिनों के लिए नहीं।
    नोट: प्रयोग से पहले 35 डिग्री सेल्सियस के लिए पूर्व गर्म और 3 दिन के भीतर का उपयोग करें।

2. विवो दूध पिलाने की विधि में

ध्यान दें: विवो में खिला विधि हेनले एट अल से संशोधित किया गया है। 20

  1. मधु मक्खी के लार्वा चयन और लेबलिंग।
    1. 4 फ्रेम और 5 फ्रेम में एक स्वस्थ कॉलोनी के 9 फ्रेम विभाजित करने के लिए है, जबकि 4 फ्रेम अनुभाग के लिए रानी को सीमित एक रानी को अलग डालें। अंडे बिछाने के लिए 4 फ्रेम खंड में कम से कम एक खाली फ्रेम छोड़ दें।
    2. रानी 1 दिन के लिए अंडे बिछाने के बाद, अंडे की उपस्थिति के लिए फ्रेम की जाँच करें और जब तक 1 दिन पुरानी लार्वा हैच 72 ज (4 वें दिन) के लिए beehives अंदर अंडे रखने के लिए। हाथ से परीक्षण छत्ता से बाहर 1-दिन पुरानी कार्यकर्ता लार्वा (24 घंटे के भीतर रची) युक्त फ्रेम में से एक ले लो और एक मधुमक्खी ब्रश के साथ फ्रेम से मधु मक्खी श्रमिकों को हटा दें।
    3. एक पारदर्शी स्लाइड (आकार = लम्बाई x चौड़ाई x मोटी = 29.7 मिमी x 21 मिमी x 0.1 मिमी) के साथ फ्रेम कवर और थम्बपिन (चित्रा 1 ए) के साथ फ्रेम के किनारे पर पारदर्शी स्लाइड कील।
    4. प्रत्येक उपचार के लिए, बेतरतीब ढंग से 50 एक दिन पुरानी लार्वा (4 वें दिन) का चयन करें और पारदर्शी स्लाइड पर स्थायी मार्कर पेन का उपयोग करके प्रत्येक बच्चे सेल निशान (आंकड़े 1 ए और 1 बी)।
      नोट: स्थायी मार्कर पेन का उपयोग कर विभिन्न उपचार के बीच भ्रम से बचने के द्वारा फ्रेम और पारदर्शी स्लाइड पर प्रत्येक उपचार की जानकारी लिखें रूप में अच्छी तरह। चिह्नित स्लाइड निकालें और इन विवो के लिए रख </ Em> खिलाने और अवलोकन।
  2. विवो खिलाने में।
    1. PPN-BLD (0.1, 1, 10 और 100 पीपीएम) के विभिन्न सांद्रता प्रत्येक लेबल चिंता सेल करने के लिए के सेवन मात्रा के अनुसार 10 μL, 10 μL और 20 μL क्रमश साथ दिन 1, 2 और 3 पर pipetting द्वारा जोड़े, लार्वा उम्र। एक नियंत्रण समूह के लिए BLD (कोई PPN) का एक ही राशि जोड़ें। इस प्रकार, प्रत्येक लेबल चिंता सेल में PPN-BLD की कुल खुराक 4, 40, 400, और 4000 स्नातकोत्तर जम जाता है।
      नोट: चिह्नित पारदर्शी स्लाइड द्वारा लेबल चिंता कोशिकाओं को समझते हैं और खिलाने के बाद चिह्नित पारदर्शी स्लाइड को हटा दें। कार्यकर्ता मधुमक्खियों द्वारा चिंता कोशिकाओं की सफाई को रोकने के लिए भोजन के लिए ताजा BLD का प्रयोग करें।
    2. आगे टिप्पणियों के लिए मूल कालोनियों के लिए PPN इलाज फ्रेम लौटें।
      नोट: प्रत्येक उपचार चार कालोनियों में चार जैविक दोहराता है।
  3. 7 दिन में इलाज लार्वा का अवलोकन।
    1. वें निरीक्षण करने के लिएई PPN इलाज लार्वा, फ्रेम करने के लिए लेबल पारदर्शी स्लाइड वापसी लेबल चिंता कोशिकाओं में मृत्यु दर और कैपिंग दरों रिकॉर्ड करने के लिए।
  4. 13 दिन में इलाज प्यूपा और eclosion दरों का अवलोकन।
    1. छाया हुआ चिंता कोशिकाओं के मधुमक्खी मोम निकालें।
    2. बच्चे सेल में नरम टिप चिमटी रखो और क्लैंप प्यूपा बहुत थोड़ा फिर धीरे से प्यूपा बाहर ले।
    3. प्रत्येक अच्छी तरह से नीचे प्रयोगशाला के ऊतकों की एक डबल परत के साथ 24-अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट में प्यूपा स्थानांतरित करें। पोटा संबंधी स्थानांतरण के दौरान क्षति और मृत्यु दर रिकॉर्ड।
    4. (सी ए 8 दिन) उद्भव जब तक 34 डिग्री सेल्सियस और 70% सापेक्ष आर्द्रता में एक इनक्यूबेटर में 24-अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट रखें।
    5. ध्यान से देखें और प्यूपा और उभरा मधु मक्खियों रिकॉर्ड है।
  5. आंकड़े
    1. ± एसडी एक मतलब के रूप में दर्ज आंकड़ों और वर्तमान की गणना करें
    2. एसए द्वारा विचरण (एनोवा) का विश्लेषण का उपयोग कर डेटा का विश्लेषणएस और कम से कम महत्वपूर्ण अंतर (एलएसडी) परीक्षण का उपयोग विभिन्न उपचारों के दो साधन के बीच मतभेद का विश्लेषण करने के लिए। पी -value <0.05 के रूप में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण परिभाषित करें। तालिका के एक ही स्तंभ में विभिन्न पत्र सांख्यिकीय विश्लेषण द्वारा एक महत्वपूर्ण प्रभाव दिखाया।

बीहाईव में कॉलोनी स्तर पर PPN की 3. विषाक्तता

  1. मधु मक्खी समूहों सेट करें।
    1. 4 फ्रेम (भाग ए) और 5 फ्रेम (पार्ट बी), जबकि 4 फ्रेम अनुभाग के लिए रानी को सीमित करने में एक स्वस्थ कॉलोनी के 9 फ्रेम विभाजित करने के लिए खड़ी एक रानी को अलग डालें। अंडे बिछाने के लिए 4-फ्रेम खंड में कम से कम एक खाली फ्रेम छोड़ दें।
      ध्यान दें: एक और रानी रानी भाग के ऊपर को अलग हिस्सों के बीच जाने से रानी को रोकने के लिए रखो।
    2. बाद रानी 1 दिन के लिए अंडे बिछाने, अंडे की उपस्थिति के लिए फ्रेम की जाँच करें। हाथ से भाग एक से अंडे बाहर वाले उचित फ्रेम ले लो और मधु मक्खी कार्यकर्ताओं को दूरएक मधुमक्खी ब्रश के साथ फ्रेम से।
    3. पारदर्शी स्लाइड के साथ फ्रेम कवर और थम्बपिन के साथ फ्रेम के किनारे करने के लिए पारदर्शी स्लाइड कील।
    4. बेतरतीब ढंग से 100 बच्चे अंडे वाले सेल का चयन करें और पारदर्शी स्लाइड पर स्थायी मार्कर का उपयोग करके प्रत्येक बच्चे सेल निशान। इन 100 बच्चे कोशिकाओं निरुपित समूह 1. फ्रेम और पारदर्शी स्लाइड स्थायी मार्कर का उपयोग विभिन्न उपचारों के बीच भ्रम की स्थिति से बचने के लिए पर प्रत्येक उपचार की जानकारी लिखें के रूप में।
    5. 3 दिनों के लिए भाग एक के लिए लेबल फ्रेम लौटें और फिर भाग बी को रानी हस्तांतरण अंडे देना।
    6. 1 दिन के बाद, भाग बी के तख्ते की जाँच, एक उचित फ्रेम का चयन और कदम 3.1.4 में वर्णित के रूप में 100 बच्चे अंडे युक्त कोशिकाओं लेबल। समूह 2 के रूप में इन 100 बच्चे कोशिकाओं असाइन करें।
    7. 3 दिनों के लिए भाग बी के लेबल फ्रेम लौटें और फिर अंडे देना एक हिस्सा करने के रानी हस्तांतरण।
    8. भाग एक और भाग बी के बीच रानी विनिमय दोहराएँ 6 गुना अधिक और संख्यानुसार समूह भी निर्दिष्ट,क्रमशः (चित्रा 2)। वहाँ 9 समूहों की कुल होना चाहिए।
  2. टी 13 दिन PPN चीनी सिरप के साथ reat मधु मक्खी कॉलोनी (चित्रा 2)।
    1. जोड़े 1 एल 50% PPN चीनी युक्त एक प्लास्टिक मधुमक्खी फीडर बॉक्स में 10 या 100 पीपीएम (डब्ल्यू एक्स एल एक्स एच = 20 सेमी x 30 सेमी x 3.5 सेमी) सिरप और प्रयोगात्मक कालोनियों में फ्रेम के शीर्ष पर बॉक्स डाल दिया।
      नोट: समूह 1 13 दिनों में PPN प्राप्त नहीं होता है के रूप में चिंता कोशिकाओं सील किया गया है।
    2. 1 एल 50% चाशनी (कोई PPN) कदम 2.2 में वर्णित के रूप के साथ नियंत्रण समूह फ़ीड।
  3. गणना 1 दिन पुरानी लार्वा और दिन 5 (चित्रा 2) में प्रत्येक समूह के लिए 100 लेबल चिंता कोशिकाओं के अंडे सेने दर के रूप में रिकॉर्ड। मधु मक्खी अंडे आमतौर पर 3 दिन लग 0 दिन लार्वा में बच्चे निकलते करने के लिए; इसलिए, जाँच और 100 अंडे युक्त 1 दिन में चिंता कोशिकाओं लेबल और दर अंडे सेने का प्रतिशत प्राप्त करने के लिए 5 दिन में प्रत्येक समूह के लिए 1 दिन पुरानी लार्वा की संख्या की गणना।
  4. सीछाया हुआ चिंता कोशिकाओं और 11 दिन (चित्रा 2) में प्रत्येक समूह के लिए 100 लेबल चिंता कोशिकाओं के लार्वा कैपिंग दर के रूप में रिकॉर्ड ount। 6 से 7 दिन पुरानी लार्वा चिंता कोशिकाओं लार्वा pupating के लिए मधु मक्खी कार्यकर्ताओं द्वारा मधुमक्खी मोम से सीमित किया जाएगा।
  5. प्यूपा परिपक्वता का निरीक्षण करें और दिन 17 (चित्रा 2) में प्रत्येक समूह के लिए 100 लेबल चिंता कोशिकाओं के eclosion दर दर्ज करते हैं।
    1. छाया हुआ चिंता कोशिकाओं के मधुमक्खी मोम निकालें और नरम इत्तला दे दी चिमटी धीरे साथ प्यूपा बाहर ले। प्रत्येक अच्छी तरह से नीचे प्रयोगशाला के ऊतकों की एक डबल परत के साथ एक 24 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट में प्यूपा स्थानांतरित करें।
    2. उद्भव जब तक 34 डिग्री सेल्सियस और 70% आरएच पर एक इनक्यूबेटर में 24-अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट रखें।
    3. ध्यान से देखें और प्यूपा रिकॉर्ड और (49 प्रयोगात्मक दिन) समूह 9 तक प्रत्येक समूह के लिए मधु मक्खियों का उदय हुआ।
      नोट: प्रत्येक उपचार चार जैविक दोहराता है।
  6. आंकड़े
    1. दर्ज आंकड़ों की गणना करें और मतलब के रूप में उपस्थित± एसडी।
    2. (उदाहरण के लिए 0 पीपीएम / 10 पीपीएम, 10 पीपीएम / 100 पीपीएम और 0 पीपीएम / 100 पीपीएम) विद्यार्थी का दो-पुच्छीय टी टेस्ट का उपयोग करके प्रत्येक समूह में उपचार के जोड़ों के बीच महत्वपूर्ण अंतर का विश्लेषण करें। सांख्यिकीय रूप से करता है, तो पी -value <0.05 महत्वपूर्ण परिभाषित करें।

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Representative Results

मधु मक्खी क्षेत्र परीक्षण के लिए, एक रानी अंडे बिछाने के लिए 4-फ्रेम अनुभाग तक ही सीमित था। यह कदम एक फ्रेम में चिंता घनत्व बढ़ाने के लिए और बाद में टिप्पणियों की सुविधा सकता है। प्रत्येक उपचार में चिह्नित किया गया है, और मधु मक्खियों के विकास स्पष्ट रूप से एक पारदर्शी स्लाइड के माध्यम से मनाया गया। मधुमक्खी के छत्ते में मधु मक्खी के लार्वा को PPN-BLD की विवो खिला में ठीक कॉलोनी में मधु मक्खियों के विकास पर PPN के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए किया गया था। इन विवो खिला पद्धति का उपयोग करना मधुमक्खी के छत्ते पर रासायनिक उपचार के प्रभावों का अवलोकन मदद की।

PPN-BLD की प्रत्येक खुराक के लिए, पचास बच्चे कोशिकाओं की कुल चिह्नित और इलाज किया गया। PPN-BLD जोड़ने के बाद, इलाज किया फ्रेम प्राकृतिक परिस्थितियों में अवलोकन के लिए मूल कालोनियों के लिए लौट रहे थे। लार्वा चरण मधु मक्खियों पर PPN-BLD के नकारात्मक प्रभावों को आसानी से obse थेrved। एक खुराक पर निर्भर प्रभाव देखा गया। तालिका 1 मधु मक्खियों कि 10 और 100 पीपीएम के दो अधिक मात्रा में लार्वा चरण में निधन हो गया की संख्या प्रस्तुत करते हैं। जैसा कि तालिका 1 में दिखाया गया है, दो खुराक (0.1 और 1 पीपीएम) में, कैपिंग दरों, उद्भव और eclosion दरों के दिन, भूखा नियंत्रण काफी 0 (BLD भोजन जोड़ा) से अलग है या नहीं थे केवल के एक काफी उच्च प्रतिशत के साथ 1 पीपीएम पर विकृत पंखों के साथ मधुमक्खियों। प्यूपा की melanization PPN की कम सांद्रता में मनाया गया। इसके अलावा, वयस्क मधु मक्खियों के अनुपात में विकृत पंख PPN की अधिक मात्रा (तालिका 1) के साथ बढ़ के साथ दिखाई दिया।

पर्यावरण PPN अवशेषों से पीड़ित, पूरे मधु मक्खी कॉलोनी के PPN सिरप के खिला मधु मक्खी कालोनियों अनुकरण करने के लिए किया गया था। इलाज से पहले, प्रत्येक कॉलोनी 9 विभिन्न अस्थायी समूहों में 3 दिन के अंतराल पर दो रानी excluders द्वारा (फाई विभाजित किया गया थाआंकड़ा 2)। इसलिए,, अंडे सेने कैपिंग और eclosion के दर पर PPN के प्रभाव प्राकृतिक वातावरण में उन लोगों के समान परिस्थितियों में एक साथ देखा गया।

कालोनियों दिन 13 (चित्रा 2 में लाल बिंदीदार द्वारा इंगित) में 10 या 100 पीपीएम PPN साथ सिरप खिलाया गया। सैद्धांतिक रूप से, समूह 1 क्योंकि PPN-सिरप 13 दिन कम से तंग आ गया था और समूह 1 में मधु मक्खियों पोटा संबंधी चरण में थे और छाया हुआ एक PPN से मुक्त नियंत्रण था, लार्वा चरण में मधुमक्खियों समूहों 2 और 3 में प्रभावित होने लगा, और अंडे PPN दूषित beehives में अब जोखिम समय (चित्रा 2) के कारण समूहों 4-9 में प्रभावित हो जाएगा।

इस परीक्षण में, हम PPN सिरप के साथ शहद मधुमक्खियों के छत्तों खिलाया और विकास मनाया जब वयस्क मधुमक्खियों सिरप का सेवन किया और शायद रानी और लार्वा खिलाया। यह धारणा hatc द्वारा पुष्टि की गईहिंग, कैपिंग और के रूप में आंकड़े 3 ए में दिखाया गया eclosion दरों, और विकृत पंखों वाला मधुमक्खियों, PPN उपचार के बाद देखा गया - 3 डी। सभी मापदंडों अंडे सेने की दर (- 3 डी चित्रा 3A) को छोड़कर उच्च खुराक (100 पीपीएम) समूह 3 से शुरू होने पर काफ़ी भिन्न है,। इसके अलावा, PPN-सिरप उपचार के बाद, कई प्यूपा काला cuticles के साथ या उभरने में नाकाम रहने से मृत्यु हो गई। 100 पीपीएम PPN उपचार में, छाया हुआ कोशिकाओं को नष्ट कर दिया गया है, और घायल प्यूपा कॉलोनी (चित्रा 3E) से हटा दिया गया।

आकृति 1
चित्र 1: शिशु-कोशिकाओं लेबलिंग के Schematics। (ए) 1 दिन पुरानी कार्यकर्ता लार्वा पारदर्शी स्लाइड कागजात के अंतर्गत आने वाले और स्थायी मार्कर द्वारा लेबल किया गया। (बी) 1 दिन पुरानी कार्यकर्ता लार्वा चिंता कोशिकाओं लेबल लगाए गए; सफेद तीर एक 1 इंगित करता है दिन पुरानी कार्यकर्ता लार्वा के अंदर। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्र 2: जब PPN 9 प्रयोगात्मक समूहों के सापेक्ष शुरू कर दिया है के लिए समय। PPN के विभिन्न सांद्रता दिन 13 (लाल बिंदीदार रेखा) पर खिलाया गया। इलाज किया कॉलोनी अंडे बिछाने दिखाए जाते हैं के लिए भाग बी और इसके विपरीत भाग एक से भाग एक और भाग बी रानी एक्सचेंजों में बांटा गया था। यह एल्सवियर 16 से अनुमति के साथ reproduced किया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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चित्र 3: से पहले और परीक्षण मधुमक्खियों के छत्तों में 1 किलो PPN सिरप खिला के बाद मधु मक्खी के लार्वा का विकास। नौ समूहों के कुल इस प्रयोग में सर्वेक्षण किया गया: (ए) अंडे सेने दर; (बी) कैपिंग दर; (सी) eclosion दर; और (डी) विकृत विंग दर। ± एसडी प्रस्तुत कर रहे हैं मतलब; लाल तीर समय जिसके दौरान PPN मधुमक्खियों पर अभिनय शुरू कर सकते हैं संकेत मिलता है। काले तारक नियंत्रण (0 पीपीएम) की तुलना में सांख्यिकीय महत्व को दिखाते हैं। लाल तारक 10 और 100 पीपीएम के बीच सांख्यिकीय महत्व को दिखाने; (ई) 100 पीपीएम PPN सिरप इलाज किया मधुमक्खी कॉलोनी अनकैप्ड कोशिकाओं, शायद विकृत प्यूपा और काले और विकृत प्यूपा दिखाया। यह एल्सवियर 16 से अनुमति के साथ reproduced किया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

PPN-BLD (पीपीएम) लार्वा नहीं। लारवल विकास
छाया हुआ दर (%) Eclosion दर (%) विकृत पंख (%)
100 140 0b 0b -
10 139 22.2 ± 33.2b 0b -
1 140 72.3 ± 17.9a 67.7 ± 17.6a 7.7 ± 5.7a
0.1 136 78.3 ± 17.5a 75.4 ± 22.8a 1.4 ± 2.8b
0 138 78.9 ± 5.4a 78.9 ± 5.4a 0b
गैर-खिला 122 87.8 ± 9.1a 86.1 ± 7.2a 0.8 ± 1.5b

तालिका 1: को जारी रखा 3 दिन 1 दिन पुरानी लार्वा पर PPN के खिला के प्रभाव। प्रत्येक लार्वा सेल करने के लिए, BLD के 10, 10 और 20 μL क्रमश: दिन 1 से 3 से जोड़ा गया था। प्रत्येक परख एक कॉलोनी में 25-38 लार्वा निहित और 4 कालोनियों परीक्षण किया गया। मीन ± एसडी प्रस्तुत कर रहे हैं। एक ही स्तंभ में विभिन्न पत्र काफी कम से कम वर्ग अंतर परीक्षण (पी <0.05) से अलग होने के बाद एनोवा एक महत्वपूर्ण प्रभाव से पता चला रहे हैं। यह एल्सवियर 16 से अनुमति के साथ reproduced किया गया है।

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Discussion

रानी सीमित अंडे बिछाने विधि और क्वीन एक्सचेंज विधि इस प्रोटोकॉल के भीतर क्षेत्र के परीक्षण के लिए मधु मक्खी समूहों को सेट करने के लिए महत्वपूर्ण कदम हैं। रानी सीमित अंडे बिछाने विधि मधु मक्खियों के जीवन चक्र के तुल्यकालन अनुमति देता है। नतीजतन, शोधकर्ताओं ने कीटनाशक के विभिन्न खुराक के साथ इलाज के लिए एक ही उम्र के 1 दिन पुरानी लार्वा चुन सकते हैं। रानी एक्सचेंज विधि के लिए, रानी भाग ए (4 फ्रेम) और बी (5 फ्रेम) क्षेत्र परीक्षण कीटनाशक और कीटनाशकों के अवशेष के प्रभावों का मूल्यांकन करने के लिए मधु मक्खी के विभिन्न विकास के चरणों प्राप्त करने के लिए के बीच आदान-प्रदान किया गया था। इसके अलावा, चयनित बच्चे कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या लेबलिंग के लिए पारदर्शी स्लाइड का उपयोग कर क्षेत्र परीक्षण में दर्ज किए गए। हालांकि, अधिक बिछाने अंडे कभी कभी रानी अंडे बिछाने के लिए अपर्याप्त चिंता कोशिकाओं का परिणाम है। इसलिए, खाली फ्रेम की तैयारी रानी एक्सचेंज विधि के लिए आवश्यक है। वैकल्पिक रूप से, रानी सीमित अंडे बिछाने विधि को भी करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकतामधुमक्खी के छत्ते में परीक्षण के लिए विभिन्न मधु मक्खी समूहों तैयार करते हैं। भाग एक में 2 फ्रेम और भाग बी में 7 फ्रेम में फ्रेम की जुदाई और भाग एक (2 फ्रेम) में रानी की नियुक्ति अंडे 2 फ्रेम के भीतर रानी द्वारा रखी सीमित कर सकता है।

इन विवो खिला विधि के लिए, PPN-BLD प्रत्येक बच्चे सेल करने के लिए जोड़ा गया है। मधु मक्खियों सिरप 16, 20 से BLD के उच्च स्वीकृति का प्रदर्शन किया। मधु मक्खी के लार्वा जीवित रहने और एक कृत्रिम शाही जेली, शक्कर, खमीर निकालने, और आसुत जल 22, 23 से बना आहार पर बढ़ सकता है। BLD की ग्लूकोज और फ्रुक्टोज रचना विट्रो 21 में लार्वा के बचने की दर को प्रभावित नहीं किया है, और इसलिए, BLD मधुमक्खी के छत्ते में मधु मक्खी के विकास के लिए और अधिक स्थिर होगा। विशेष रूप से, खिला के लिए ताजा BLD का प्रयोग भी दौरान कार्यकर्ता मधुमक्खियों 'लार्वा बहिष्कार रोका जा सकता हैलार्वा खिला प्रयोग। इसके अलावा, खिला की प्रक्रिया के दौरान, कोमल खिला शुरू में 1 दिन पुरानी लार्वा की मौत से बचने के लिए आवश्यक है।

क्षेत्र परीक्षण के दौरान, रासायनिक नर्सिंग मधुमक्खियों के उच्च घ्राण संवेदनशीलता के कारण मधुमक्खी के छत्ते कभी कभी वजह से लार्वा बहिष्कार में BLD दूषित। चीनी रचना काफी औसत लार्वा अस्तित्व, पूर्व पोटा संबंधी लार्वा वजन, वयस्क वजन, और ovariole संख्या 21 प्रभावित करता है। जब सिरप ट्रांसजेनिक पराग या मधु मक्खी के लार्वा को एक सकारात्मक नियंत्रण कीटनाशक diazinon वितरित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, कार्यकर्ताओं जोड़ा या दूषित भोजन 21 युक्त चिंता कोशिकाओं से कुछ लार्वा हटा दिया। इस प्रकार, चीनी रचना ध्यान दिया जाना चाहिए। 1 दिन पुरानी लार्वा की संख्या में वृद्धि या परीक्षण व्यक्तिगत चिंता सेल साइटों dispersing भी समस्याओं में सुधार हो सकता। दरअसल, PPN-BLD उपचार प्रक्रियाओं के अवलोकन और के नाटकीय खुराक पर निर्भर प्रभावों के आधार परPPN-BLD मधु मक्खियों के विकास पर, हम उस नर्सों चिंता कोशिकाओं को कृत्रिम रूप से जोड़ा BLD को नहीं निकाला ग्रहण किया। प्यूपा की PPN कारण melanization, संभवतः वृद्धि हुई phenoloxidase गतिविधि के कारण, जो melanization और पोटा बनना 24, 25, 26 को नियंत्रित करता है की कम सांद्रता। प्रत्येक बच्चे सेल के लिए एक कृत्रिम खिला पद्धति के उपयोग के आधार पर, मधु मक्खियों के विकास पर PPN-BLD के नाटकीय प्रभाव डालता है अंडे सेने के पहले दिन से PPN के साथ सीधे संपर्क की वजह से हो सकता है।

खिला प्रयोगों में इस्तेमाल किया रासायनिक खुराक मधु मक्खी पित्ती से एकत्र ताजा पराग नमूनों में कीटनाशकों के अवशेष के लिए सर्वेक्षण के आधार पर तैयार किया जा सकता है। वहाँ प्राकृतिक वातावरण में कालोनियों के कीटनाशक संदूषण के मार्गों की एक किस्म है। रासायनिक दूषित पदार्थों को मधु मक्खी कालोनियों में वापस लाया जा सकता है और लार्वा द्वारा किया जाता खिला mot की वजह सेकार्यकर्ता मधु मक्खियों के आयन, अंत में लार्वा के विकास को प्रभावित किया। मधुमक्खी के छत्ते में कॉलोनी के स्तर पर PPN के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए, सिरप सबसे तेज और सबसे सीधा तरीका के रूप में इस अध्ययन में खिला सुनिश्चित करना है कि मधु मक्खियों रासायनिक भस्म के लिए पराग के बजाय इस्तेमाल किया गया था। इसके अलावा, सिरप की हालत में परिभाषित किया जा सकता है जबकि पराग की सामग्री नियंत्रण (जैसे, रोगजनक या कीटनाशक संदूषण) के लिए मुश्किल है।

क्षेत्र की स्थिति, विभिन्न विकास के चरणों (अंडे, लार्वा, प्यूपा और वयस्क मधुमक्खियों) एक मधु मक्खी कॉलोनी में मधु मक्खियों के तहत एक ही वातावरण कारक पीड़ित हैं। हमारे प्रयोगात्मक सेटअप में, प्राकृतिक परिस्थितियों एक गतिशील वातावरण में मधु मक्खियों के विकास के चरणों पर रासायनिक के प्रभावों का मूल्यांकन करने के नकली थे। इसलिए, PPN उपचार (13 दिन) के बाद, हम uninfluenced कैपिंग दर समूह 1 में निरीक्षण कर सकता है, अन्य आठ समूहों में प्रभावित कैपिंग दर, और प्रभावित लार्वा चरणसमूह 2 और 3, आदि इन परिस्थितियों में में, कॉलोनी के भीतर सही प्रभाव और पूरे कॉलोनी के लिए रासायनिक के प्रसार का मार्ग स्पष्ट हैं।

मधु मक्खी कालोनियों PPN सिरप के साथ इलाज छाया हुआ कोशिकाओं और कॉलोनी से प्यूपा को हटाने की विकृति का प्रदर्शन किया। इसके अलावा, प्यूपा के व्यापक melanization 100 पीपीएम PPN उपचार में मनाया गया। इस प्रकार, PPN-सिरप खिला विधि गतिशील मधुमक्खी के छत्ते में मधु मक्खियों के जीवन चक्र पर रसायनों के प्रभाव की अनुमति पालन किए जाने वाले। इस परीक्षण में, कार्यकर्ता और नर्सिंग मधुमक्खियों द्वारा लिया सिरप शायद रानी और लार्वा को खिलाया जाता था। पुष्टि के लिए, हमारे भविष्य के अध्ययनों रासायनिक युक्त सिरप में (जैसे कि एक खाद्य डाई के रूप में) रासायनिक मार्कर का उपयोग आगे रासायनिक दूषित beehives की गतिशीलता के अध्ययन की सुविधा के लिए होगा।

नर्स मधुमक्खियों के खाद्य स्रोत foragers से या मधुमक्खी के छत्ते और लार्वा तंग आ चुके हैं जबड़े और hypopharyng में आना चाहिएeal ग्रंथि नर्स मधुमक्खियों 21, 25, 26, 27, 28 के द्वारा उत्पादित स्राव। लार्वा नर्स मधुमक्खियों द्वारा तंग आ रहे हैं, mandibles में hypopharyngeal ग्रंथि द्वारा उत्पादित स्राव PPN-सिरप पतला हो सकता है। यह जैविक कमजोर पड़ने प्रभाव और अधिक बारीकी से प्राकृतिक परिस्थितियों जैसा दिखता है, लेकिन इन विवो खिला विधि के लिए अलग-अलग परिणाम बताते हैं। अन्य कीटनाशकों, भारी धातु और मधु मक्खी रोगजनकों सहित कई सामग्री का मूल्यांकन और मधु मक्खी आबादी में भूमिकाओं के समाधान के लिए इस खिला विधि को लागू किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों की घोषणा वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है।

Acknowledgments

इस शोध अनुदान 105AS-13.2.3-BQ-बी 1 पशु ब्यूरो और संयंत्र स्वास्थ्य निरीक्षण और संगरोध, कृषि की परिषद, कार्यकारी युआन और अनुदान 103-2313-B-197-002-MY3 मंत्रालय की ओर से से द्वारा समर्थित किया गया विज्ञान और प्रौद्योगिकी (मोस्ट) की।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Honey bee box SAN-YI Honey Factory W1266 Honeybees rearing
Queen excluder (between frames) SAN-YI Honey Factory I1575 Queen limitation 
Queen excluder (on top) SAN-YI Honey Factory I1566 Queen limitation on top 
Bee brush SAN-YI Honey Factory, Taiwan W1414 clean the bees on frame gently
Bee feeder SAN-YI Honey Factory, Taiwan P0219 feed sugar syrup to colony
Transparent slide Wan-Shih-Chei, Taiwan (http://www.mbsc.com.tw/a01goods.asp?s_id=40) 1139 Mark the larval area on the frames (Material: Polyethylene Terephthalate, PET) (Size = Length*Width*thick = 29.7 mm * 21 mm * 0.1 mm)
24 well tissu culture plate Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd TCP011024 Rearing pupae from extraction
Autoclave Tomin medical equipmenco., LTD. TM-321 Make sterilized distilled deionized water (ddH2O)
P20 pipetman Gilson F123600 Add PPN into bee larval food pool
Incubator  Yihder Co., Ltd. LE-550RD Rearing pupae from extraction
Kimwipes COW LUNG INSTRUMENT CO., LTD KCS34155 Rearing pupae from extraction
Royal jelly National Ilan University (NIU) NIU Make basic larval diet (BLD)
D-(+)-Glucose Sigma G8270 Make basic larval diet (BLD)
D-(-)-Fructose Sigma F0127 Make basic larval diet (BLD)
Yeast extract CONDA, pronadisa 1702 Make basic larval diet (BLD)
Sucrose Taiwan sugar coporation E01071010 Make sugar syrup for bee food
Pyriproxyfen (11%) LIH-NUNG CHEMICAL CO.. LTD. Registration No. 1937 Insect growth regulator (IGR) used in the experiment

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References

  1. Ruffi nengo, S. R., et al. Integrated pest management to control Varroa destructor and its implications to Apis mellifera colonies. Zootecnia Trop. 32 (2), 149-168 (2014).
  2. Mullin, C. A., et al. High levels of miticides and agrochemicals in North American apiaries, implications for honey bee health. PLoS One. 5, e9754 (2010).
  3. Lu, C. A., Chang, C. H., Tao, L., Chen, M. Distributions of neonicotinoid insecticides in the Commonwealth of Massachusetts, a temporal and spatial variation analysis for pollen and honey samples. Environ. Chem. 13, 4-11 (2016).
  4. Tsai, W. T. Analysis of coupling the pesticide use reduction with environmental policy for agricultural sustainability in Taiwan. Environ. & Pollut. 2, 59-65 (2013).
  5. Weng, Z. H. Pesticide market status and development trend (in Chinese). PRIDE. , https://pride.stpi.narl.org.tw/ (2016).
  6. Kevan, P. G. Pollinators as bioindicators of the state of the environment, species, activity and diversity. Agric. Ecosys. Environ. 74 (1-3), 373-393 (1999).
  7. Kevan, P. G. Forest application of the insecticide fenitrothion and its effect on wild bee pollinators (Hymenoptera: Apoidea) of lowbush blueberries (Vaccinium SPP.) in Southern New Brunswick, Canada. Biol. Conserv. 7, 301-309 (1975).
  8. Crane, E., Walker, P. The impact of pest management on bees and pollination. , IBRA. Cardiff, UK. (1983).
  9. Haouar, M., Decormis, L., Rey, J. Fluvalinate applied to flowering apple trees-contamination of honey-gathering bees and hive products. Agronomie. 10 (2), 133-137 (1990).
  10. Chauzat, M. P., et al. A survey of pesticide residues in pollen loads collected by honey bees in France. J. Econ. Entomol. 99 (2), 253-262 (2006).
  11. Bonzini, S., Tremolada, P., Bernardinelli, I., Colombo, M., Vighi, M. Predicting pesticide fate in the hive (part 1), experimentally determined τ-fluvalinate residues in bees, honey and wax. Apidologie. 42 (3), 378 (2011).
  12. Sanchez-Bayo, F., Goka, K. Pesticide residues and bees-a risk assessment. PLoS One. 9 (4), e94482 (2014).
  13. Johnson, R. M., Ellis, M. D., Mullin, C. A., Frazier, M. Pesticides and honey bee toxicity-USA. Apidologie. 41, 312-331 (2010).
  14. Yang, E. C., Chang, H. C., Wu, W. Y., Chen, Y. W. Impaired olfactory associative behavior of honeybee workers due to contamination of imidacloprid in the larval stage. PLoS One. 7, e49472 (2012).
  15. Urlacher, E., et al. Measurements of chlorpyrifos levels in forager bees and comparison with levels that disrupt honey bee odor-mediated learning under laboratory conditions. J. Chem. Ecol. 42 (2), 127-138 (2016).
  16. Chen, Y. W., Wu, P. S., Yang, E. C., Nai, Y. S., Huang, Z. Y. The impact of pyriproxyfen on the development of honey bee (Apis mellifera L.) colony in field. J. Asia Pac. Entomol. 19 (3), 589-594 (2016).
  17. Dennehy, T. J., DrGain, B. A., Harpold, V. S., Brink, S. A., Nichols, R. L. Whitefly Resistance to Insecticides in Arizona: 2002 and 2003 Results. , San Antonio, TX, USA. http://ag.arizona.edu/crop/cotton/insects/wf/whiteflyresistance0204.pdf 1926-1938 (2004).
  18. Yang, E. C., Wu, P. S., Chang, H. C., Chen, Y. W. Effect of sub-lethal dosages of insecticides on honey bee behavior and physiology. Proceedings of international seminar on enhancement of functional biodiversity relevant to sustainable food production, ASPAC, Tsukuba, Japan, , http://www.niaes.affrc.go.jp/sinfo/sympo/h22/1109/paper_06.pdf (2010).
  19. Fourrier, J., et al. Larval exposure to the juvenile hormone analog pyriproxyfen disrupts acceptance of and social behavior performance in adult honey bees. PLoS One. 10, e0132985 (2015).
  20. Hanley, A. V., Huang, Z. Y., Pett, W. L. Effects of dietary transgenic Bt corn pollen on larvae of Apis mellifera and Galleria mellonella. J. Apicult.Res. 42 (4), 77-81 (2003).
  21. Kaftanoglu, O., Linksvayer, T. A., Page, R. E. Rearing honey bees, apis mellifera, in vitro 1, effects of sugar concentrations on survival and development. J. Insect Sci. 11 (96), 1-10 (2011).
  22. Vandenberg, J. D., Shimanuki, H. Technique for rearing worker honey bees in the laboratory. J. Apicult. Res. 26 (2), 90-97 (1987).
  23. Peng, Y. S. C., Mussen, E., Fong, A., Montague, M. A., Tyler, T. Effects of chlortetracycline on honey bee worker larvae reared in vitro. J. Invertebr.Pathol. 60 (2), 127-133 (1992).
  24. Bitondi, M. M., Mora, I. M., Simoes, Z. L., Figueiredo, V. L. The Apis mellifera pupal melanization program is affected by treatment with a juvenile hormone analogue. J. Insect Physiol. 44 (5-6), 499-507 (1998).
  25. Zufelato, M. S., Bitondi, M. M., Simoes, Z. L., Hartfelder, K. The juvenile hormone analog pyriproxyfen affects ecdysteroid-dependent cuticle melanization and shifts the pupal ecdysteroid peak in the honey bee (Apis mellifera). Arthropod Struct. Dev. 29 (2), 111-119 (2000).
  26. Santos, A. E., Bitondi, M. M., Simoes, Z. L. Hormone-dependent protein patterns in integument and cuticular pigmentation in Apis mellifera during pharate adult development. J. Insect Physiol. 47 (11), 1275-1282 (2001).
  27. Brouwers, E. V. M. Glucose/Fructose ratio in the food of honeybee larvae during caste differentiation. J. Apicult.Res. 23 (2), 94-101 (1984).
  28. Howe, S. R., Dimick, P. S., Benton, A. W. Composition of freshly harvested and commercial royal jelly. J. Apicult. Res. 24 (1), 52-61 (1985).

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पर्यावरण विज्ञान अंक 122 मधु मक्खी, कीटनाशक pyriproxyfen (PPN) बुनियादी लार्वा आहार (BLD),
कॉलोनी स्तर को व्यक्ति से हनी बी विकास पर पर्यावरण रसायन के प्रभाव का मूल्यांकन
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Ko, C. Y., Chen, Y. W., Nai, Y. S. Evaluating the Effect of Environmental Chemicals on Honey Bee Development from the Individual to Colony Level. J. Vis. Exp. (122), e55296, doi:10.3791/55296 (2017).

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