Summary
בזאת אנו מציגים שיטה להאכיל מזון מזוהם דברה כדי הן דבורת דבש פרט מושבת כוורת. ההליך מעריך את השפעת הדברה על דבורים ודבש פרט על ידי in vivo האכלה של דיאטת זחל בסיסית גם על המצב הטבעי של מושבת כוורת.
Introduction
הנוכחות של חומרי הדברה בסביבה היא אחת הבעיות החמורות ביותר שמשפיע על חייו של דבורת דבש 1, 2, 3. מספר מחקרים הראו הנוכחות המשותפת של שאריות חומר הדברה ב מושבות דבורי דבש ומוצרי דבורים. בטייוואן, היישום הממוצע של חומרי הדברה היה 11-12 ק"ג / דונם כל שנה (מ -2005 כדי 2013). כמות חומרי ההדברה המשמשים בטייוואן גבוה מזה של מדינות האיחוד האירופי, ומדינות אמריקה הלטינית 4, 5. במילים אחרות, את הסביבה apicultural סובל מתח הדברה רצינית, במיוחד בטייוואן ואולי במדינות אחרות.
דבש הדבורה Apis mellifera הוא אחד המאביקים העיקריים במערכות חקלאיות 6 וזה גם מייצר מוצרים יקרים ערך כגון דבש. עם זאת, דבורים ודבש הם ירידיםאד לחומרי הדברה שונים וחומרי הדברה אלה ניתן להביא בחזרה כוורות לאחר ליקוט על פרחים כי רוססו בחומרי הדברה בעת איסוף צוף ואבקה 7, 8. הם גם יכולים להיות חשופים לחומרי הדברה על ידי דבוראים עצמם במטרה לשלוט בעיות מזיקות בתוך הכוורות 9, 10, 11. מכיוון זחלי דבורת דבש ניזונים דבורי אחות לפיתוח, הזחלים, מזל"טים שלהם ואפילו המלכה עלולה להיחשף תקטר ההדברה המזוהמת אלה אבקה 12. הרעילות של חומרי הדברה שונים כדי דבורי הדבש צריך להיות מטופל 13.
מאמצים רבים נעשו כדי להעריך את הבעיות של שאריות חומר הדברה סביבתיות. יאנג et al. בחנו את ההשפעה של imidacloprid הדברה הנוירו על התפתחות זחלי הדבורים דבשכוורת והדיווח כי מינון תת קטלני של imidacloprid הביא התנהגות אסוציאטיבית הרחה של הדבורים הבוגרות 14. כמו כן, Urlacher ואח. בחן את השפעות תת-קטלני של חומרי הדברה organophosphate, chlorpyrifos, על מופע הלמידה של דבורה עובדת דבש בתנאי מעבדה 15. במחקר הקודם שלנו, אנו הערכנו את ההשפעה של רגולטור התפתחות חרקים (IGR), pyriproxyfen (PPN), על דבורים ודבש זחל 16.
במאמר זה, אנו מציגים שיטות להערכת ההשפעות הכימיות על התפתחות דבורי דבש. שיטות האכלת דבורת הדבש תואר וכן להחיל גם דבורים ודבש פרט או למושבה. בתחילה, בדקנו ריכוזים שונים של דיאטת זחל בסיסית מזוהם דברה (BLD) על זחלים במושבות להעריך את ההשפעה של חומרי ההדברה על דבורים ודבש פרט in vivo. אנחנו מכן המשכנו לדמות את קונדיט הטבעייונים של חומרי ההדברה באמצעות סירופ מזוהם-הדברה בתוך כוורות. בשיטה זו, HBC, שנמצא בשימוש נרחב נגד חרקים מזיקים 17 ו מזיק להתפתחות זחלי דבש דבורים וגלמים 16, 18, 19, יהיה אינדיקטור לייצג את ההשפעה השלילית של חומרי ההדברה בתחום.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנות
- הפוך 1 ליטר של סירופ סוכר 50%. ממיסים סוכרוז 1 ק"ג ב 1 L DDH 2 O.
- כן pyriproxyfen (PPN) פתרון BLD. הפוך 1.1 L של פתרון המניות 10,000 עמודים לדקה HBC ו לדלל 100 מ"ל פתרון של HBC ב 1 L מעוקר חנות DDH 2 O. ב 4 מעלות צלזיוס.
- לדלל את הפתרון המניות של HBC לריכוזים הסופי של 0.1, 1, 10 ו 100 מ"ג / ק"ג (ppm) של BLD לניסוי הבא.
- הפוך-סירופ PPN (עבור רמת המושבה). לדלל את המניות של HBC לריכוזים סופיים של 10 ו 100 עמודים לדקת סירופ סוכר 50% עבור הניסוי הבא.
- דבש דבורים וגידול.
הערה: כאן, המיקום ניסיוני הוא מאוניברסיטת אילן הלאומי (Niu) המכוורת, יי-Lan סיטי, טייוואן; (קואורדינטות GPS: N24.747278, E121.746200).- בדוק דבורת הדבש (Apis mellifera L.) מושבות שבועי כמות המזון להאכיל עם 1 ליטר 50% סוכר סירופ במידת הצורך (אזור אחסון דבש ריק). גדר בריאהמושבה כפי 9 מסגרות של מסרקי דבורת דבש בכל מושבה עם מלכה להטיל ביצים בדרך כלל.
- כן 100 מיליליטר של דיאטת זחל בסיסית (BLD). ממיסים 6% גלוקוז D, 6% פרוקטוז, ואת תמצית שמרים 1% במים deionized מזוקקים מעוקר (DDH 2 O) ו להשלים עם 50% מזון מלכות. חנות ב 4 מעלות צלזיוס אך לא יותר מ- 3 ימים.
הערה: Pre-חם 35 ° C לפני הניסוי ולהשתמש תוך 3 ימים.
2. שיטת הזנה Vivo
הערה: בשנת vivo שיטת האכלה שונתה ואח הנלי. 20
- בחירה וסימון דבש דבורי זחלים.
- כנס הנימן לחלק 9 מסגרות של מושבה בריאה לתוך 4 מסגרות 5 מסגרות תוך הגבלת המלכה אל מקטע מסגרת 4. השאר לפחות מסגרת ריקה אחד בקטע 4 המסגרת להטיל ביצים.
- אחרי המלכה להטיל ביצים עבור 1 יום, לבדוק את המסגרות עבור הופעת ביצים ולשמור את הביצים בתוך הכוורות עבור 72 h (היום 4 th) עד בוקעי זחלים 1 יום-זקנים. קח אחד המסגרות המכילות רימות הפועלות 1 ימים בת (בקעו בתוך 24 h) החוצה מן כוורת המבחן ביד ולהסיר עובדי דבורת דבש מהמסגרת עם מברשת דבורה.
- מכסה את המסגרת עם מגלשה שקופה (גודל = אורך X רוחב X עבה = 29.7 מ"מ x 21 מ"מ x 0.1 מ"מ) ולרתק את השקף השקוף על קצה המסגרות עם נעצים (איור 1 א).
- עבור כל טיפול, בחירה אקראית 50 זחלי יום אחד בן (היום 4 th) ולסמן כל תא לרבוץ באמצעות עטים סמן קבעו בשקופית השקופה (1A דמויות 1B).
הערה: כתוב את המידע של כל טיפול על המסגרת והחלק שקוף כמו גם באמצעות עטים סמן קבע כדי למנוע את הבלבול בין טיפולים שונים. הסר את השקופיות המסומנות ולשמור על vivo ב </ Em> האכלה והתבוננות.
- בשנת האכלת vivo.
- הוספת ריכוזים שונים של HBC-BLD (0.1, 1, 10 ו 100 ppm) לכל תא לרבוץ שכותרתו ידי pipetting ב יום 1, 2 ו 3 עם 10 μL, 10 μL ו 20 μL, בהתאמה, בהתאם לכמות הצריכה של גיל זחלים. מוסיפים אותה כמות של BLD (לא של HBC) לקבוצת ביקורת. ובכך, מנה הכוללת של HBC-BLD בכל תא לרבוץ שכותרתו מצטבר עד 4, 40, 400, ו 4000 pg.
הערה: הכר תאי הקינון שכותרתו ידי השקופיות שקופות המסומנים ולהסיר את השקופיות שקופות מסומן לאחר ההאכלה. השתמשו BLD טריים האכלה למניעת ניקוי של תאי קינון על ידי הדבורים הפועלות. - החזר את המסגרות של HBC שטופל אל המושבות המקוריות עבור תצפיות נוספות.
הערה: כל טיפול יש ארבע חזרות ביולוגיות בארבע מושבות.
- הוספת ריכוזים שונים של HBC-BLD (0.1, 1, 10 ו 100 ppm) לכל תא לרבוץ שכותרתו ידי pipetting ב יום 1, 2 ו 3 עם 10 μL, 10 μL ו 20 μL, בהתאמה, בהתאם לכמות הצריכה של גיל זחלים. מוסיפים אותה כמות של BLD (לא של HBC) לקבוצת ביקורת. ובכך, מנה הכוללת של HBC-BLD בכל תא לרבוץ שכותרתו מצטבר עד 4, 40, 400, ו 4000 pg.
- תצפית של זחלים שטופלו ב יום 7.
- כדי לבחון הדואר PPN שטופל זחלים, להחזיר את השקופיות השקופות שכותרתו אל המסגרות כדי להקליט את התמותה ושיעורי מכסה בתאים לרבוץ שכותרתו.
- תצפית של שיעורי גלמים ו eclosion שטופלו ב יום 13.
- הסר את שעוות דבורים של תאי קינון כתרים.
- שים את פינצטה רך היטה לתא לרבוץ ואוחזת גלמים מאוד מעט ואז לקחת גלמים החוצה בעדינות.
- עבר הגלמים לתוך צלחות תרבית רקמת 24-היטב בשכבה כפולה של רקמות במעבדה מתחת לכל היטב. רשום את הניזק ותמותה במהלך העברת גלמים.
- שמור על צלחות תרבית הרקמה 24-היטב באינקובטור ב 34 מעלות צלזיוס והלחות היחסית 70% עד הופעתה (בערך 8 ימים).
- שים ולהקליט גלמים ודבורי דבש יצאו.
- סטָטִיסטִיקָה
- חשב את הנתונים שנרשמו ובהווה כמו ממוצע ± SD
- לנתח את הנתונים באמצעות ניתוח שונות (ANOVA) על ידי SAS ולהשתמש הבדל משמעותי לפחות (LSD) הבדיקה כדי לנתח את ההבדלים בין שני אמצעי טיפולים שונים. גדר מובהקת סטטיסטי כמו P -Value <0.05. אותיות שונות באותה עמודה של הטבלה הראתה השפעה משמעותית על ידי ניתוח סטטיסטי.
3. רעילות של HBC ברמת קולוני ב כוורת
- הגדרת קבוצות דבורת הדבש.
- כנס הנימן אנכי לחלק 9 מסגרות של מושבה בריאה לתוך 4 מסגרות (חלק א ') ו 5 מסגרות (חלק ב') תוך הגבלת המלכה אל מקטע מסגרת 4. השאירו לפחות מסגרת ריקה אחד בקטע 4-מסגרת להטיל ביצים.
הערה: שים מלכה אחרת המדיר על גבי חלק המלכה כדי למנוע את המלכה לנוע בין החלקים. - אחרי המלכה להטיל ביצים עבור 1 יום, לבדוק את המסגרות עבור הופעת ביצים. קח את המסגרות המתאימות המכילות ביצי מ- חלק ביד ולהסיר עובדי דבורת הדבשמהמסגרת עם מברשת דבורה.
- מכסה את המסגרת עם שקופיות שקופות ולרתק את השקף השקוף לקצה המסגרת עם נעצים.
- בחירה האקראית של 100 תאים לרבוץ המכילים ביצים ולסמן כל תא לרבוץ באמצעות סמן קבע בשקופית השקופה. הקצאת תאי קינון 100 אלה כמו קבוצת 1. כתוב את המידע של כל טיפול על המסגרת וחלק שקוף באמצעות סמן קבע כדי למנוע את הבלבול בין טיפולים שונים.
- החזר את מסגרת שכותרתו לחלק א עבור 3 ימים ולאחר מכן להעביר את המלכה לחלק B להטיל ביצים.
- אחרי 1 יום, לבדוק את המסגרות של חלק B, לבחור מסגרת אחת מתאימה תווית 100 תאי קינון המכילים ביצים כפי שמתואר בשלב 3.1.4. הקצאת תאי קינון 100 אלה כמו קבוצה 2.
- החזר את מסגרת שכותרתו לחלק B עבור 3 ימים ולאחר מכן להעביר את המלכה שנועדו לפזר להטיל ביצים.
- חזור על חילופי המלכה בין חלק א 'וחלק ב 6 יותר פעמים ולהקצות קבוצות מספריות,בהתאמה (איור 2). לא צריך להיות סך של 9 קבוצות.
- כנס הנימן אנכי לחלק 9 מסגרות של מושבה בריאה לתוך 4 מסגרות (חלק א ') ו 5 מסגרות (חלק ב') תוך הגבלת המלכה אל מקטע מסגרת 4. השאירו לפחות מסגרת ריקה אחד בקטע 4-מסגרת להטיל ביצים.
- המושבה דבורה T דבש reat עם סירופ סוכר HBC, ביום 13 (איור 2).
- מוסיפים 1 ליטר 50% סירופ סוכר HBC, המכיל 10 או 100 ppm בקופסה מזין דבורה פלסטיק (W x L x H = 20 ס"מ X 30 ס"מ X 3.5 ס"מ) ולשים בתיבה על גבי מסגרות במושבות ניסיוני.
הערה: קבוצה 1 לא יקבל את HBC, ב 13 ימים כפי התאים לרבוץ נאטמו. - Feed בקבוצת הביקורת עם 1 סירופ L 50% סוכר (לא של HBC) כפי שמתואר בשלב 2.2.
- מוסיפים 1 ליטר 50% סירופ סוכר HBC, המכיל 10 או 100 ppm בקופסה מזין דבורה פלסטיק (W x L x H = 20 ס"מ X 30 ס"מ X 3.5 ס"מ) ולשים בתיבה על גבי מסגרות במושבות ניסיוני.
- רוזן 1 יום בן זחלים ולהקליט כמו שיעור בקיעת הביצה של 100 תאים לרבוץ שכותרתו עבור כל קבוצה ביום 5 (איור 2). ביצים דבורת הדבש בדרך כלל לוקח 3 ימים לבקוע לתוך 0 יום זחלי; ולכן, לבדוק התווית 100 ביצים המכילים תאי קינון ב יום 1 ולספור את מספר 1 זחלי בן יומו לכל קבוצה בכל יום 5 כדי לקבל את אחוז הבקיעה שער.
- גount התאים לרבוץ כתרים ולהקליט כמו שיעור זחל המכסה של 100 תאים לרבוץ שכותרתו עבור כל קבוצה ביום 11 (איור 2). 6 עד 7 תאים לרבוץ זחל בן יומו הוא יוגבל עם שעוות דבורים ידי עובדי דבורת דבש עבור pupating זחלים.
- שים התבגרות גלמים ולהקליט את שיעור eclosion של 100 תאים לרבוץ שכותרתו עבור כל קבוצה ביום 17 (איור 2).
- הסר את שעוות דבורים של תאי קינון כתרים ולקחת גלמים החוצה עם פינצטה היטה רך בעדינות. עבר הגלמים לתוך צלחות תרבית רקמת 24-היטב בשכבה כפולה של רקמות במעבדה מתחת לכל היטב.
- שמור על צלחות תרבית הרקמה 24-היטב באינקובטור ב 34 מעלות צלזיוס ו 70% לחות יחסית עד הופעתה.
- שים ולהקליט הגלמים ויצאו דבורים ודבש לכל קבוצה עד 9 קבוצה (49 ימים ניסיוניים).
הערה: כל טיפול יש ארבע חזרות ביולוגיות.
- סטָטִיסטִיקָה
- חשב את הנתונים שנרשמו ובהווה כממוצעSD ±.
- לנתח את ההבדלים המשמעותיים בין הזוגות של טיפולים (למשל 0 עמודים לדקה / 10 עמודים לדקה, 10 עמודים לדקה / 100 עמודים לדקה 0 עמודים לדקה / 100 ppm) בכל קבוצה על ידי שימוש -test t דו-זנבי של הסטודנטים. הגדר כמשמעותי מבחינה סטטיסטית אם -Value P <0.05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
עבור מבחן שדה דבורת דבש, מלכה הוגבלה בסעיף 4-המסגרת להטיל ביצים. צעד זה יכול להגדיל את צפיפות קינון מסגרת אחת ולהקל תצפיות עוקבות. טיפול אחד מהם היה מסומן, לבין ההתפתחות דבש הדבורים נצפתה בבירור באמצעות שקופית שקופה. בשנת האכלת vivo של HBC-BLD כדי זחלי דבורים דבש בכוורת בוצע כדי להעריך את ההשפעה בדיוק של HBC על התפתחות דבורי דבש במושבה. באמצעות שיטת האכלת vivo ב הקל על התצפית של ההשפעות של הטיפולים הכימיים על הכוורת.
עבור כל מנה של HBC-BLD, סך של חמישים תאי קינון סומן ומטופלים. לאחר הוספת PPN-BLD, מסגרות המטופלים הוחזרו המושבות המקוריות תצפית בתנאים טבעיים. ההשפעות השליליות של HBC-BLD על דבורים ודבש הזחל בשלב היו בקלות observed. אפקט המינון התלוי נצפה. טבלה 1 מציגה את מספר דבורי דבש כי מתו בשלב הזחל בשני המינונים הגבוהים של 10 ו 100 ppm. כפי שניתן לראות בטבלה 1, על שני מינונים (0.1 ו 1 ppm), שיעורי המכסה, הימים ל הופעתה ואת eclosion לא היו שונים באופן משמעותי מן 0 (מזון BLD הוסיף) או השליטה תאכיל אותם, עם רק אחוז גבוה משמעותי של דבורים עם כנפיים מעוותות על 1 ppm. Melanization של גלמים נצפה בריכוזים נמוכים של HBC. יתר על כן, שיעור דבורים ודבש בוגרת הופיע עם כנפיים מעוותות גדלו עם מינונים גבוהים יותר של HBC (לוח 1).
כדי לדמות מושבות דבורים סובלים שאריות סביבתיות HBC, האכלה של סירופ של HBC למושבת דבורת דבש כולו בוצע. לפני הטיפול, כל מושבה חולקה 9 קבוצות זמניות שונות 3 מרווחים ביום שני excluders המלכה (אלחוטיתאיור 2). לכן, ההשפעות של HBC על שיעורי הבקיעה, מכסת eclosion נצפו בו זמנית בתנאים דומים לאלו של הסביבה הטבעית.
המושבות הואכלו סירופ עם 10 או 100 ppm של HBC ב יום 13 (מסומן על ידי מקווקו אדום באיור 2). תיאורטית, קבוצה 1 היה שלט של HBC-חינם כי סירופ PPN הוזן ב יום 13 ו דבורי הדבש בקבוצה 1 היו בשלב גלמי ו כתרים; הדבורים בשלב הזחל החלו להיפגע בקבוצות 2 ו 3, ואת הביצים תושפענה בקבוצות 4-9 בשל זמן חשיפה הארוך יותר ב במכוורת-המזוהמת של HBC (איור 2).
במחקר זה, האכלנו מושבות דבורי דבש עם סירופ HBC ו שנצפינו פיתוח כאשר הדבורים המבוגרים נצרך הסירופ כנראה נמאסים המלכה ואת הזחלים. הנחה זו אושרה על ידי hatcהינג, מכסה ושיעורי eclosion, ודבורים מכונפים מעווים נצפו לאחר טיפולי HBC, כמתואר 3A הדמוי - 3D. כל הפרמטרים היו שונים משמעותית במינון הגבוה (100 ppm) החל בקבוצה 3, למעט שיעור הבקיעה (איור 3A - 3D). יתר על כן, לאחר הטיפולים של HBC-סירופ, גלמים רבים מתו עם עור קרני שחור או בכך שלא להתגלות. במסגרת הטיפול של HBC 100 ppm, התאים כתרים נהרסו, וכן הגלמים הפצועים פונו מהמושבה (האיור 3E).
איור 1: שרטוטים של תיוג לרבוץ-תאי. (א) 1 בן היום זחלי עובד מכוסה ניירות שקופיות שקופות תויגו על ידי סמן קבע. (ב) מקבל תווית של 1-בני יומם תאי קינון זחל עובד; החץ הלבן מצביע על 1 יום בן זחל עובד מבפנים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: מתי תכונה של HBC הוא התחיל ביחס 9 קבוצות הניסוי. ריכוזים שונים של HBC הואכלו ב יום 13 (קו מקווקו אדום). המושבה טיפל חולקה חלק א 'חלק ב' חילופי המלכה מחלק לחלק B ולהיפך עבור להטיל ביצים מוצגים. זה שוחזר באישור Elsevier 16. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
6 / 55296fig3.jpg"/>
איור 3: פיתוח של זחלי דבש דבורים לפני ואחרי האכלה 1 ק"ג סירופ PPN לתוך מושבות הדבורים נבדק. בסך הכל תשע קבוצות נסקרו בניסוי זה: (א) שיעור הבקיעה; (ב) שיעור מכסת; (ג) eclosion שיעור; ו (ד) שיעור כנף פגום. ממוצע ± SD מוצג; החיצים האדומים מציינים את הזמן שבמהלכו HBC, עלול להתחיל לפעול על דבורים. כוכביים שחור להראות מובהקות סטטיסטיות לעומת השליטה (0 ppm). כוכביות אדומות להראות מובהקות סטטיסטיות בין 10 לבין 100 ppm; (E) 100 ppm סירופ HBC, דבורת מטופלי מושבה הראתה תאים סגורים ופתוחים, כנראה גלמים מעווים וגלמים שחורים מעווים. זה שוחזר באישור Elsevier 16. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| PPN-BLD (ppm) | מס זחלים | התפתחות הזחל | ||
| שיעור כתרים (%) | שיעור eclosion (%) | כנפיים פגומות (%) | ||
| 100 | 140 | 0B | 0B | - |
| 10 | 139 | 22.2 ± 33.2b | 0B | - |
| 1 | 140 | 72.3 ± 17.9a | 67.7 ± 17.6a | 7.7 ± 5.7a |
| 0.1 | 136 | 78.3 ± 17.5a | 75.4 ± 22.8a | 1.4 ± 2.8b |
| 0 | 138 | 78.9 ± 5.4a | 78.9 ± 5.4a | 0B |
| ללא האכלה | 122 | 87.8 ± 9.1a | 86.1 ± 7.2a | 0.8 ± 1.5b |
טבלה 1: אפקטים של 3 ימים המשיכו האכלה של HBC על 1 היום בת הזחלים. לכל תא זחל, 10, 10 ו 20 μL של BLD נוספו מימים 1 עד 3, בהתאמה. כל assay שהכיל רימות 25-38 במושבה ו 4 מושבות נבדקו. ממוצע ± SD מוצגים. אותיות שונות באותה העמודה שונות באופן משמעותי על ידי מבחן ההבדל הרבוע לפחות (P <0.05) לאחר ANOVA הראה השפעה משמעותית. זה שוחזר באישור Elsevier 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שיטת ההטלה המוגבלת-המלכה והשיטה קווין חילופית הם שלבים קריטיים בהגדרת קבוצות דבורת דבש לבדיקות שדה בתוך פרוטוקול זה. שיטת ההטלה המוגבלת-המלכה מאפשרת סנכרון של מחזור החיים של דבורי דבש. כתוצאה מכך, חוקרים יכולים לבחור 1 זחלי היום בן אותו הגיל לטיפול עם מינונים שונים של חומרי הדברה. לקבלת השיטה החילופית מלכה, המלכה הוחלפה בין חלק (4 מסגרות) ו- B (5 מסגרות) כדי להשיג בשלבי התפתחותיים שונים של דבורת דבש לבדיקות שדה להעריך את ההשפעות של שאריות חומר הדברה חומר הדברה. יתר על כן, מספר רב של תאים לרבוץ שנבחרו נרשם מבחן השדה באמצעות שקופיות שקופות עבור תיוג. עם זאת, ביצת יתר נחת לאתים מהתוצאות בתאי קינון מספיקים עבור המלכה להטיל ביצים. לכן, הכנת מסגרות ריקות נדרשת שיטת קווין החליפין. לחלופין, שיטת הטלת קווין המוגבלת יכולה להיות גם נהגהלהכין קבוצות דבורת דבש שונות לבדיקה של הכוורת. ההפרדה של מסגרות לתוך 2 מסגרות ב חלק ו 7 פריימים ב B חלק וההקצאה של המלכה ב חלק (2 מסגרות) עלולה להגביל את הביצים שמטילה המלכה בתוך 2 המסגרות.
לקבלת שיטת האכלת vivo ב, HBC-BLD נוספה כל תא קינון. דבורי הדבש הציגו קבלה גבוהה של BLD מ סירופ 16, 20. זחלי דבורי דבש יכולים לשרוד ולגדול על דיאטה מלאכותית המורכבת של מזון מלכות, סוכרים, תמצית שמרים, מים מזוקקים 22, 23. רכב גלוקוז ופרוקטוז של BLD לא השפיע על שיעורי ההישרדות של הזחלים במבחנת 21, ולכן, BLD יהיה יציב יותר לצמיחת דבורת דבש בכוורת. יש לציין, כי השימוש BLD טרי האכלה יכול גם למנוע הדרה הזחל הדבורים הפועלות במהלךניסוי האכלת הזחל. יתר על כן, במהלך תהליך ההאכלה, האכלה עדינה נדרשת בתחילה כדי למנוע את מותו של 1 יום בן זחלים.
במהלך בדיקות שדה, מזוהם כימי BLD לידי הרחקת הזחל שלעתים גרמה כוורת בשל רגישות חוש ריח הגבוהה של דבורי סיעוד. רכב הסוכר משפיע באופן משמעותי את הישרדות הזחל הממוצעת, משקולות זחל טרום גלמים, משקולות מבוגרות, ומספרי ovariole 21. כאשר סירופ שמש לספק אבקה מהונדסת או diazinon דברת בקרה חיובי כדי זחלי דבורת דבש, העובדים הסירו כמה זחלים מהתאים לרבוץ המכילים הוסיף או מזוהמי מזון 21. לפיכך, רכב הסוכר יצוין. הגדלת מספר 1 זחלים ישנים-יום או פיזור האתרים הסלולריים הגוזל בודד שנבדקו עשוי גם לשפר את הבעיות. ואכן, המבוסס על התצפית של תהליכי הטיפול של HBC-BLD ואת ההשפעות הדרמטיות תלוי במינון שלPPN-BLD על התפתחות דבורים ודבש, הנחנו כי האחיות לא להסיר את BLD הוסיף מלאכותי לתאי גוזלים. בריכוזים נמוכים של הגורם PPN melanization של גלמים, ואולי בשל פעילות מוגברת phenoloxidase, אשר מסדיר melanization ואת התגלמות 24, 25, 26. בהתבסס על השימוש בשיטת האכלה מלאכותית עבור כל תא קינון, ההשפעות הדרמטיות של HBC-BLD על התפתחות דבורי דבש ייתכן שדבר נובעים מגע ישיר עם HBC, מהיום הראשון של בקיעה.
המינונים הכימיים המשמשים בניסויי ההאכלה יכולים להיות מתוכננים על סמך נתוני סקר שאריות חומר הדברה בדגימות אבקה טריות שנאספו כוורות דבש. יש מגוון של מסלולים של זיהום דברה של מושבות בסביבה הטבעית. מזהמים כימיים ניתן להחזירו אל מושבות דבורים ודבש לקיבת זחל בשל MOT ההאכלהיון של דבורי דבש עובד, בסופו של דבר משפיע על ההתפתחות של זחלים. כדי להעריך את ההשפעה של HBC ברמת המושבה של הכוורת, סירופ שמש במקום אבקה להאכלה במחקר זה כמו הדרך המהירה והישירה ביותר על מנת להבטיח כי דבורי הדבש נצרכים הכימיים. יתר על כן, מצבו של סירופ יכול להיות מוגדר, ואילו התוכן של אבקה קשה לשליטה (למשל, פתוגנים או זיהום דברה).
בתנאי שדה, בשלבים התפתחותיים שונים (ביצים, זחלים, גלמים דבורים למבוגרים) של דבורי הדבש במושבה דבורת הדבש לסבול אותו גורם לסביבה. ב התקנת הניסוי שלנו, תנאים טבעיים היו מדומים כדי להעריך את ההשפעות של חומר הכימי על שלבי ההתפתחות של דבורי דבש בסביבה דינמית. לכן, לאחר הטיפול של HBC (13 ימים), נוכל לבחון את השיעור לֹא מוּשׁפַּע מכסה בקבוצה 1, שיעור המכסה השפיע בשמונה הקבוצות האחרות, ואת בשלב הזחל השפיעים בקבוצות 2 ו 3, וכו 'בתנאים אלה, על ההשפעות האמיתיות בתוך המושבה ואת תוואי פיזור של החומר הכימי כדי המושבה כולה ברורים.
מושבות דבורי דבש שטופלו סירופ HBC, הציגו עיוות של תאים כתרים והסרה של גלמים מהמושבה. יתר על כן, melanization הנרחב של גלמים נצפה בטיפול 100 ppm של HBC. לפיכך, שיטת ההאכלה-סירופ HBC, מותר ההשפעה הדינמית של כימיקלים על מחזור החיים של דבורים דבש בכוורת כדי לצפות. במחקר זה, סירופ נלקח על ידי הדבורים הפועלות וסיעוד כנראה היה נמאס המלכה ואת הזחלים. לקבלת אישור, המחקרים העתידיים שלנו ישתמשו סמנים כימיים (כגון צבע מאכל) בסירופ הכימי המכיל כדי להקל עוד יותר ללימוד הדינמיקה של כוורות מזוהמות כימי.
מקור המזון של דבורי אחות צריך לבוא לקטים או כוורת וזחלים ניזונים בלסת תחתונה, ואת hypopharyngהפרשות בלוטת EAL המיוצרות על ידי דבורי אחות 21, 25, 26, 27, 28. כאשר הזחלים ניזונים דבורים אחות, הפרשות המיוצר על ידי בלוטת hypopharyngeal של הלסתות עשוי לדלל את סירופ HBC. אפקט דילול ביולוגי זה יותר דומה התנאים הטבעיים אך מסביר את התוצאות השונות לשיטת האכלת vivo ב. חומרים שונים, הכוללים חומרי הדברה אחרות, מתכות כבדות ופתוגנים דבורת דבש יכולים להיות מיושמים על שיטת האכלה זו להערכה והתייחסות תפקידי אוכלוסיות דבורת דבש.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
מחקר זה מומן על ידי גרנט 105AS-13.2.3-BQ-B1 מן הלשכה חייה וצומח בריאות פיקוח הסגר, מועצת החקלאות, הפועל יואן גרנט 103-2313-B-197-002-MY3 מהמשרד המדע והטכנולוגיה (MOST).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Honey bee box | SAN-YI Honey Factory | W1266 | Honeybees rearing |
| Queen excluder (between frames) | SAN-YI Honey Factory | I1575 | Queen limitation |
| Queen excluder (on top) | SAN-YI Honey Factory | I1566 | Queen limitation on top |
| Bee brush | SAN-YI Honey Factory, Taiwan | W1414 | clean the bees on frame gently |
| Bee feeder | SAN-YI Honey Factory, Taiwan | P0219 | feed sugar syrup to colony |
| Transparent slide | Wan-Shih-Chei, Taiwan (http://www.mbsc.com.tw/a01goods.asp?s_id=40) | 1139 | Mark the larval area on the frames (Material: Polyethylene Terephthalate, PET) (Size = Length*Width*thick = 29.7 mm * 21 mm * 0.1 mm) |
| 24 well tissu culture plate | Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd | TCP011024 | Rearing pupae from extraction |
| Autoclave | Tomin medical equipmenco., LTD. | TM-321 | Make sterilized distilled deionized water (ddH2O) |
| P20 pipetman | Gilson | F123600 | Add PPN into bee larval food pool |
| Incubator | Yihder Co., Ltd. | LE-550RD | Rearing pupae from extraction |
| Kimwipes | COW LUNG INSTRUMENT CO., LTD | KCS34155 | Rearing pupae from extraction |
| Royal jelly | National Ilan University (NIU) | NIU | Make basic larval diet (BLD) |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G8270 | Make basic larval diet (BLD) |
| D-(-)-Fructose | Sigma | F0127 | Make basic larval diet (BLD) |
| Yeast extract | CONDA, pronadisa | 1702 | Make basic larval diet (BLD) |
| Sucrose | Taiwan sugar coporation | E01071010 | Make sugar syrup for bee food |
| Pyriproxyfen (11%) | LIH-NUNG CHEMICAL CO.. LTD. | Registration No. 1937 | Insect growth regulator (IGR) used in the experiment |
References
- Ruffi nengo, S. R., et al. Integrated pest management to control Varroa destructor and its implications to Apis mellifera colonies. Zootecnia Trop. 32 (2), 149-168 (2014).
- Mullin, C. A., et al. High levels of miticides and agrochemicals in North American apiaries, implications for honey bee health. PLoS One. 5, e9754 (2010).
- Lu, C. A., Chang, C. H., Tao, L., Chen, M. Distributions of neonicotinoid insecticides in the Commonwealth of Massachusetts, a temporal and spatial variation analysis for pollen and honey samples. Environ. Chem. 13, 4-11 (2016).
- Tsai, W. T. Analysis of coupling the pesticide use reduction with environmental policy for agricultural sustainability in Taiwan. Environ. & Pollut. 2, 59-65 (2013).
- Weng, Z. H. Pesticide market status and development trend (in Chinese). PRIDE. , https://pride.stpi.narl.org.tw/ (2016).
- Kevan, P. G. Pollinators as bioindicators of the state of the environment, species, activity and diversity. Agric. Ecosys. Environ. 74 (1-3), 373-393 (1999).
- Kevan, P. G. Forest application of the insecticide fenitrothion and its effect on wild bee pollinators (Hymenoptera: Apoidea) of lowbush blueberries (Vaccinium SPP.) in Southern New Brunswick, Canada. Biol. Conserv. 7, 301-309 (1975).
- Crane, E., Walker, P. The impact of pest management on bees and pollination. , IBRA. Cardiff, UK. (1983).
- Haouar, M., Decormis, L., Rey, J. Fluvalinate applied to flowering apple trees-contamination of honey-gathering bees and hive products. Agronomie. 10 (2), 133-137 (1990).
- Chauzat, M. P., et al. A survey of pesticide residues in pollen loads collected by honey bees in France. J. Econ. Entomol. 99 (2), 253-262 (2006).
- Bonzini, S., Tremolada, P., Bernardinelli, I., Colombo, M., Vighi, M. Predicting pesticide fate in the hive (part 1), experimentally determined τ-fluvalinate residues in bees, honey and wax. Apidologie. 42 (3), 378 (2011).
- Sanchez-Bayo, F., Goka, K. Pesticide residues and bees-a risk assessment. PLoS One. 9 (4), e94482 (2014).
- Johnson, R. M., Ellis, M. D., Mullin, C. A., Frazier, M. Pesticides and honey bee toxicity-USA. Apidologie. 41, 312-331 (2010).
- Yang, E. C., Chang, H. C., Wu, W. Y., Chen, Y. W. Impaired olfactory associative behavior of honeybee workers due to contamination of imidacloprid in the larval stage. PLoS One. 7, e49472 (2012).
- Urlacher, E., et al. Measurements of chlorpyrifos levels in forager bees and comparison with levels that disrupt honey bee odor-mediated learning under laboratory conditions. J. Chem. Ecol. 42 (2), 127-138 (2016).
- Chen, Y. W., Wu, P. S., Yang, E. C., Nai, Y. S., Huang, Z. Y. The impact of pyriproxyfen on the development of honey bee (Apis mellifera L.) colony in field. J. Asia Pac. Entomol. 19 (3), 589-594 (2016).
- Dennehy, T. J., DrGain, B. A., Harpold, V. S., Brink, S. A., Nichols, R. L. Whitefly Resistance to Insecticides in Arizona: 2002 and 2003 Results. , San Antonio, TX, USA. http://ag.arizona.edu/crop/cotton/insects/wf/whiteflyresistance0204.pdf 1926-1938 (2004).
- Yang, E. C., Wu, P. S., Chang, H. C., Chen, Y. W. Effect of sub-lethal dosages of insecticides on honey bee behavior and physiology. Proceedings of international seminar on enhancement of functional biodiversity relevant to sustainable food production, ASPAC, Tsukuba, Japan, , http://www.niaes.affrc.go.jp/sinfo/sympo/h22/1109/paper_06.pdf (2010).
- Fourrier, J., et al. Larval exposure to the juvenile hormone analog pyriproxyfen disrupts acceptance of and social behavior performance in adult honey bees. PLoS One. 10, e0132985 (2015).
- Hanley, A. V., Huang, Z. Y., Pett, W. L. Effects of dietary transgenic Bt corn pollen on larvae of Apis mellifera and Galleria mellonella. J. Apicult.Res. 42 (4), 77-81 (2003).
- Kaftanoglu, O., Linksvayer, T. A., Page, R. E. Rearing honey bees, apis mellifera, in vitro 1, effects of sugar concentrations on survival and development. J. Insect Sci. 11 (96), 1-10 (2011).
- Vandenberg, J. D., Shimanuki, H. Technique for rearing worker honey bees in the laboratory. J. Apicult. Res. 26 (2), 90-97 (1987).
- Peng, Y. S. C., Mussen, E., Fong, A., Montague, M. A., Tyler, T. Effects of chlortetracycline on honey bee worker larvae reared in vitro. J. Invertebr.Pathol. 60 (2), 127-133 (1992).
- Bitondi, M. M., Mora, I. M., Simoes, Z. L., Figueiredo, V. L. The Apis mellifera pupal melanization program is affected by treatment with a juvenile hormone analogue. J. Insect Physiol. 44 (5-6), 499-507 (1998).
- Zufelato, M. S., Bitondi, M. M., Simoes, Z. L., Hartfelder, K. The juvenile hormone analog pyriproxyfen affects ecdysteroid-dependent cuticle melanization and shifts the pupal ecdysteroid peak in the honey bee (Apis mellifera). Arthropod Struct. Dev. 29 (2), 111-119 (2000).
- Santos, A. E., Bitondi, M. M., Simoes, Z. L. Hormone-dependent protein patterns in integument and cuticular pigmentation in Apis mellifera during pharate adult development. J. Insect Physiol. 47 (11), 1275-1282 (2001).
- Brouwers, E. V. M. Glucose/Fructose ratio in the food of honeybee larvae during caste differentiation. J. Apicult.Res. 23 (2), 94-101 (1984).
- Howe, S. R., Dimick, P. S., Benton, A. W. Composition of freshly harvested and commercial royal jelly. J. Apicult. Res. 24 (1), 52-61 (1985).
